番茄NAC转录因子SlNAP2的克隆、表达及功能分析

为了探究NAC转录因子在番茄生物胁迫响应中的功能,本试验通过逆转录PCR(RT-PCR)技术从番茄中克隆得到一个NAC转录因子基因SlNAP2,其cDNA全长（ORT）1 227 bp,包含142 bp的5′非编码区和257 bp的3′非编码区以及一个长度为828 bp编码275个氨基酸的开放阅读框（ORF）,含1个NAM结构域。同源序列比对及系统进化树分析结果表明,SlNAP2与潘那利番茄SpNAP2亲缘关系最近,并与其他茄科NAC聚为一组,而与菊科、葫芦科、葡萄科、大戟科、杨柳科NAC的亲缘关系较远,在系统发育树上处于不同的分支。生物信息学分析结果显示,SlNAP2相对分子质量为31 877.23 Da,理论等电点pI为8.56,该基因编码的蛋白不存在跨膜结构。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明,SlNAP2基因表达具有组织特异性,在番茄茎中的表达量最高,并参与了番茄对青枯菌胁迫及水杨酸和茉莉酸刺激的响应。利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术发现,沉默SlNAP2后降低了植株对青枯病的抗性,表明SlNAP2在番茄抗青枯病过程中起正调控作用。本研究为深入探讨SlNAP2基...     

月季MYB转录因子基因RcWER-like的克隆及表达分析

MYB转录因子在植物响应盐胁迫过程中起着重要的调控作用。为明确MYB类转录因子RcWER-like生物学功能,本研究以月季月月粉为材料,利用生物信息学分析及实时荧光定量PCR技术研究RcWER-like基因在盐处理、激素处理、盐与激素综合处理下不同组织不同时间点的表达特性。结果表明,依据转录组测序获得的序列信息和月季全基因组信息克隆得到了RcWER-like,该基因全长为882 bp,开放阅读框(ORF)为669 bp,编码223个氨基酸。序列比对发现,RcWER-like在N端具有保守的R2R3-MYB结构域。系统进化树分析结果显示,RcWER-like与桃PpWER-like、梅花PmWER-like、苹果MdWER-like处于同一分支,属于R2R3-MYB类转录因子。实时荧光定量PCR结果表明,RcWER-like基因在盐胁迫处理24 h后表达明显上调,且外施水杨酸和茉莉酸甲酯均可诱导RcWER-like的表达;在盐胁迫下,外施水杨酸和茉莉酸甲酯可诱导RcWER-like的表达,且均高于单独盐或激素处理。此外,月季RcWER-like在盐处理、激素处理、盐与激素综合处理下不同组...     

雷公藤转录因子TwWRKY1基因的克隆与表达分析

雷公藤(Tripterygium wilfordii)作为传统的药用植物,其主要活性成分萜类和生物碱类在农业和医药领域有着广泛的应用。WRKY转录因子广泛参与植物的生长发育、衰老、逆境胁迫反应和次生代谢产物生物合成调控等过程。本研究利用cDNA末端快速扩增(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)和q RT-PCR技术,从雷公藤发状根中克隆得到1个WRKY转录因子TwWRKY1(Gen Bank No.GAVZ01022264.1),该基因全长962 bp,开放阅读框为537 bp,编码178个氨基酸;生物信息学分析表明,TwWRKY1编码蛋白包含1个WRKY保守结构域,具有C2H2锌指结构,属于WRKY转录因子家族的第Ⅱ类;进化树分析结果表明,TwWRKY1与日本黄连(Coptis japonica)CjWRKY1同源性最高,具有83%的同源性。qRT-PCR技术检测TwWRKY1基因组织差异性表达表明,TwWRKY1基因在根、茎、叶中均有表达,在叶中表达丰度最高,其次是发状根、茎和不定根,自然根中最低。雷公藤发状根经茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,Me JA)诱导后,TwWRKY1基因在6 h内诱导表达,随后诱导表达减弱;水杨酸(salicylic acid,SA)在9 h内诱导变化不明显,12 h后对TwWRKY1有明显的诱导作用。高效液相色谱分析发现,雷公藤发状根中内酯醇、吉碱和次碱均响应MeJA诱导,吉碱和次碱含量变化较大,内酯醇含量变化较小,但含量的增加都呈先增后减的变化趋势,与TwWRKY1基因受Me JA诱导处理后表达量的变化一致。研究结果为深入研究该基因的分子生物学特性及其调控雷公藤次生代谢产物的生物合成提供科学依据。     

青花菜转录因子基因BoNAC1的克隆与表达分析

为明确青花菜NAC转录因子基因的序列特征和表达特点,本研究以青花菜为试验材料,在克隆Bo NAC1转录因子基因的基础上,采用RT-q PCR研究该基因的表达,以明确其在核盘菌和根肿菌侵染下的表达模式。结果表明,Bo NAC1含2个内含子,长度分别为1 832 bp和670 bp,编码区全长为1 035 bp,编码344个氨基酸,含1个NAM结构域;系统发育树分析结果表明,Bo NAC1与来自芸薹属的NAC亲缘关系最近,并与其他十字花科NAC聚为一组,而与豆科、蔷薇科NAC的亲缘关系相对较远,在系统发育树上处于不同的分支。基因表达分析结果表明,Bo NAC1的表达受核盘菌的诱导,在12 h和24h时的表达量最高,分别为对照的6.28倍和7.03倍;Bo NAC1的表达还受根肿菌的诱导,15 d和20 d时的表达量最高,分别为对照的4.23倍和4.11倍,表明该基因可能参与核盘菌和根肿菌的应答反应。本试验对青花菜Bo NAC1基因的克隆与表达分析,为Bo NAC1基因的功能鉴定和生产应用奠定了理论基础。     

毛竹PheDof2转录因子克隆及表达分析

Dof蛋白是单锌指结构蛋白家族之一,在植物生长发育和非生物胁迫中发挥重要作用.为了探索Dof转录因子在毛竹中的功能及表达特征,本研究以毛竹实生苗为材料,采取反转录PCR(RT-PCR)技术克隆得到PheDof2基因的cDNA序列,对其进行生物信息学初步分析,并检测其在毛竹不同高度笋、花发育,及不同胁迫处理下的表达情况....     

葡萄NAC转录因子家族生物信息学分析

NAC基因家族是植物所特有的一类重要转录因子,广泛参与植物生长、发育以及器官建成、逆境胁迫应答等反应。目前,基因组信息的挖掘和分析已经成为葡萄功能基因组学研究的重要组成部分。本文利用生物信息学方法对葡萄143条NAC蛋白序列的系统发生和NAC基因组定位进行分析,然后对其氨基酸组成成分、理化性质以及二级和三级结构进行预测和分析,同时还分析了葡萄与拟南芥的NAC基因家族之间的联系。结果显示这143条蛋白序列与拟南芥94个NAC基因蛋白序列一起分成了16个亚族,说明拟南芥与葡萄NAC基因间具有较高的保守性。基因组定位结果发现143条NAC基因分布在17条染色体上。研究还发现不同亚家族间氨基酸数目、氨基酸序列间的疏水性存在一定的差异;而它们的二级结构都主要以随机卷曲为组成部分,且143条氨基酸序列三维结构十分相似。本文试验结果将为葡萄NAC基因家族的进一步功能分析提供重要研究基础。     

桃WRKY转录因子PpWRKY18克隆及表达分析

为了探究WRKY转录因子在植物抵抗逆境胁迫方面的重要作用,本研究从桃中克隆PpWRKY18基因,通过生物信息学分析PpWRKY18蛋白含有典型WRKY功能结构域。系统进化树分析表明,桃PpWRKY18与蔷薇科物种的亲缘关系最为相近。生物信息学预测PpWRKY18蛋白定位细胞核,并通过农杆菌瞬时注射烟草叶片证实PpWRKY18定位于细胞核。对PGEX-PpWRKY18融合蛋白进行诱导表达,发现PpWRKY18融合蛋白主要在包涵体中表达。荧光定量PCR结果表明,PpWRKY18受干旱诱导表达量上升,复水后PpWRKY18表达量下降。生物信息学预测显示,蛋白磷酸酶蛋白家族(Protein Phosphatase 2C)、C2H2蛋白家族(PpZAT5)、ERF蛋白家族(PpERF9)、BHLH蛋白家族(PpBHLH92)可能与PpWRKY18蛋白互作,推测PpWRKY18蛋白通过与这些蛋白互作协同响应干旱胁迫。本研究为探索PpWRKY18响应干旱的分子机制提供了理论依据。     

小麦胁迫响应转录因子基因TaSNAC1的克隆与表达分析

胁迫响应NAC转录因子参与植物非生物胁迫过程,过表达水稻(Oryza sativa)SNAC1可显著提高植株耐旱、耐冷和抗盐性。本研究同源克隆了小麦(Tricum aestivum)TaSNAC1基因(GenBank登录号No.JN621240),分析了其表达产物的亚细胞定位,并利用实时定量RT-PCR分析了其在不同组织、PEG和NaCl胁迫下的表达。该基因包含一个内含子,编码329个氨基酸残基的蛋白产物。TaSNAC1与其他禾本科植物SNAC1蛋白高度相似,其与大麦(Hordeum vulgare)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、水稻、玉米(Zea mays)和高粱(Sorghum bicolor)SNAC1序列相似性依次为97.3%、86.3%、81.1%、79.1%和79.2%。TaSNAC1可能以二聚体形式存在,包含核定位信号和典型的NAM结构域,100~107位的"WKATGXDK100-107"核心基序处于一段β折叠中,其弯曲产生的凹面可能直接参与DNA结合。瞬时转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)叶肉细胞原生质体的实验表明,TaSNAC1特异定位于细胞核中。盐胁迫条件下,叶和根中TaSNAC1的表达量均升高,且表达模式相似,但根中响应更显著;PEG胁迫下,根中TaSNAC1对胁迫的响应较快且幅度较大,而叶中响应较慢且幅度较小。研究结果提示,TaSNAC1参与小麦的非生物胁迫响应过程,在耐旱、抗盐遗传改良中具有潜在应用价值。     

棉花转录因子基因(GhMYB11)的克隆与表达分析

MYB基因家族在植物应对外界生物和非生物胁迫的过程中有重要的调控作用.本研究利用二倍体雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)基因组数据库,从陆地棉(G.hirsutum)品种鲁棉研32号中克隆到一个新的MYB转录因子GhMYB111(GenBank登录号:HQ234875.1),Cdna全长1 001 bp,开放阅读框828bp.通过与模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)和主要作物小麦(Triticum aestivum L.)、玉米(Zea mays L.)、水稻(Oryza sativa L.) MYB蛋白的氨基酸序列比对发现,GhMYB 11蛋白与拟南芥中脱落酸(abscisic acid,ABA)合成和信号传导的重要基因AtMYB13/14编码的蛋白高度相似(E值分别为7e-83和1e-90),含两个高度保守的MYB结构域R2R3及一个转录激活结构域.实时定量PCR分析发现,GhMYB 11基因在黄萎病菌(Verticillium dahliae)侵染、干旱、盐和氧化胁迫处理后的棉花幼苗叶片中表达显著上调.GhMYB11基因可能在棉花生物和非生物胁迫反应中起重要调控作用,是陆地棉品种抗逆性遗传改良的重要候选基因.本研究为利用基因工程手段提高棉花抗逆性提供了基础材料     

转录因子DREB1A基因的克隆及植物表达载体的构建

研究转录因子DREB1A在植物抗渗透胁迫反应中的作用。根据GenBank中登录的DREB1A基因的序列设计引物,用PCR方法从拟南芥中克隆DREB1A基因,利用基因重组技术成功构建了植物表达载体pCAMB1A1300-DREB1A。该结果为进一步利用DREB1A基因做遗传转化研究奠定了基础。     

平榛ChWRKY1转录因子的克隆及表达模式分析

根据平榛花芽转录本高通量测序的结果,采用RACE-PCR法克隆到1个平榛WRKY基因,全长1273bp,推断其编码317个氨基酸,命名为ChWRKY1。序列分析表明,该蛋白属于WRKY家族第2类成员,只含有1个WRKY结构域,锌指结构为C-X5-C-X23-H-X1-H,构建的系统发育树结果表明,它与杨树PtWRKY5、葡萄VvWRKY4的亲缘关系较近,相似性分别为69%和64%。采用qRT-PCR,以Actin为内参对ChWRKY1基因在自然条件下花芽部位的表达模式进行分析,结果显示在自然条件下12月份达到最高的表达量,随后表达量呈现下降的趋势;对平榛根蘖苗进行4℃低温胁迫处理,叶片中ChWRKY1基因快速上调表达,4h达到最大表达量,表明该基因可能参与平榛对低温胁迫的早期应答反应;冬季(1月份)ChWRKY1基因在韧皮部中的表达高于花芽和雄花序,具有组织表达特异性。     

玉米转录因子基因ZmPTF1在转基因烟草中的表达

为了探讨转录因子基因ZmPTF1在玉米种子萌发中的作用,本研究根据GenBank中收录的玉米PTF1序列设计PCR引物,利用普通玉米自交系A318克隆得到ZmPTF1的全长cDNA序列.该序列开放阅读框包括1 446bp碱基,由481个氨基酸组成.本文构建植物表达载体PCAMBIA3301-ZmPTF1转化烟草W38,经过抗生素筛选和PCR鉴定得到转基因阳性烟草,对2株生长正常的T1转基因烟草进行southern杂交分析及RT-PCR检测,结果表明外源ZmPTF1已经整合进了烟草基因组中并且能正常转录并遗传.与对照相比,转基因烟草种子的发芽率、发芽势及萌发种子α-淀粉酶活性显着增高,表明ZmPTF1基因过表达会促进烟草种子提前解除休眠进入发芽阶段,提高烟草种子发芽势和发芽率.该研究结果为进一步研究ZmPTF1基因的功能提供理论依据.     

14个苹果AP2/ERF转录因子基因的克隆与表达分析

为探究AP2/ERF转录因子在苹果(Malus pumila Mill.)生长发育以及生物或非生物胁迫应答下的功能,本研究利用同源比对和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,克隆苹果MdAP2/ERF全长cDNA序列并进行生物信息学分析。采用Array技术检测MdAP2/ERF在苹果16种不同组织中的表达情况,RNA-seq技术检测MdAP2/ERF在苹果斑点落叶病菌(Alternaria alternata apple pathotype, AAAP)侵染下的表达特性,RT-qPCR技术检测MdAP2/ERF在NaCl和甘露醇胁迫下的表达模式。结果表明,共获得了MdERF9-10、MdERF12-15、MdERF20-21、MdERF30、MdERF37和MdAP2D66-69共计14个MdAP2/ERF基因,其GenBank登录号依次为MG099818-19、MG099821-24、MG099829-30、MG099839、MG099846和MG099855-58,开放阅读框(ORF)分别为966、540、1 260、843、1 056、1 011、1 347、1 047、669、615、1 956、1 455、1 365和1 101 bp。进化分析表明,MdERF12、MdERF37、MdERF20分别属于DREB亚家族A-2、A-4和A-6组;MdERF30、MdERF15、MdERF14/MdERF21和MdERF9/MdERF10/MdERF13分别属于ERF亚家族B-1、B-3、B-5和B-6组;MdAP2D66-69属于AP2亚家族。亚细胞定位预测结果显示,MdERF9-10、MdERF12-15、MdERF20、MdERF30、MdERF37和MdAP2D66-69可能位于细胞核;MdERF21可能位于线粒体。Array分析结果显示,14个MdAP2/ERF在16个检测组织中均有不同的相对表达水平。RNA-seq结果显示,MdERF12、MdERF14、MdERF15、MdERF20和MdAP2D66/67/69响应斑点落叶病菌侵染;在150 mmol·L^-1 NaCl处理下,MdERF10、MdERF12、MdERF13、MdERF15、MdERF20、MdERF30和MdERF37转录水平上调,而MdERF14和MdAP2D68转录水平下调;在300 mmol·L^-1甘露醇处理下,MdERF10、MdERF30、MdERF37和MdAP2D66-69转录水平上调,MdERF14转录水平下调。综上表明,MdAP2/ERF基因呈组成型表达,并受斑点落叶病菌、NaCl或甘露醇胁迫诱导或下调,可能参与调控苹果生物胁迫和非生物胁迫应答的过程。该研究结果为进一步揭示AP2/ERF转录因子调控苹果生长发育及逆境胁迫的机理奠定了理论基础。     

蓖麻延伸因子基因的克隆与表达分析

为探讨蓖麻延伸因子基因(RcEF-1α)作为参考基因进行相关研究的可行性,以蓖麻雌性花为试验材料,扩增RcEF-1α(GenBank登录号: XM_002518027.3)的编码序列(CDS),并将其亚克隆至原核表达载体pET32a(+)构建成重组载体pET32a(+)-RcEF-1α;将pET32a(+)-RcEF-1α转化至大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)中进行优化表达,表达蛋白经纯化后进行Western blot验证。结果表明,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)可诱导一个分子量约66 kD的特异蛋白;采用纯化的表达蛋白免疫新西兰白兔制备抗RcEF-1α的多克隆抗血清,用多克隆抗血清进行Western blot验证,发现多克隆抗血清具有针对RcEF-1α的特异性,经ELISA检测,其效价为1∶51 200;以抗血清为一抗,通过Western blot分析RcEF-1α在时空条件一致且正常生长的根、茎、叶、雌花、雄花和果实中的表达量,结果显示,蓖麻各组织中RcEF-1α蛋白质的含量存在显著差异,其中雌花和雄花中的含量显著高于其他组织。RT-qPCR分析结果表明,蓖麻各组织中RcEF-1α mRNA差异不显著。本研究结果为蓖麻功能基因表达分析参考基因的筛选提供了一定的理论依据。     

高粱转录因子SbWRKY71基因的克隆及其在逆境胁迫下的表达分析

为了探究WRKY转录因子在植物抵抗逆境胁迫方面的重要作用,本研究通过基因克隆的方法,从高粱BTx623中克隆得到一个WRKY转录因子基因(SbWRKY71),该转录因子基因全长1335 bp(phytozome登录号:Sb04g005520),编码364个氨基酸,分子量为38.95 kDa;预测该转录因子定位于细胞核,...     

马铃薯花青素转录激活基因(stmyc)的克隆及表达分析

花青素（anthocyanin）为糖苷类物质,属于类黄酮色素。在花青素生物合成途径中,调控基因主要编码R2R3-MYB、bHLH和WD40转录因子,共同调控花青素合成的结构基因的表达,进而控制花青素在植物中的时空表达和沉积的模式（Holton and comish,1995）。本研究以紫色马铃薯为材料,克隆花色素合成的转录激活基因stmyc并研究其表达模式,为阐明马铃薯花色素生物合成和沉积机制提供依据。     

果梅NAC基因家族的鉴定及组织表达分析

为挖掘果梅中NAC基因成员,探讨其组织表达特异性,本研究采用生物信息学方法鉴定了果梅NAC基因家族,并对其理化性质、染色体分布、亚细胞定位、保守基序、蛋白结构和亚族分类进行预测分析。结果表明,果梅NAC基因家族包含106个NAC基因成员,根据系统发育特征将其分为12个亚族。PmNAC基因在果梅的8条染色体上呈现不均匀分布,多编码酸性氨基酸;大部分NAC蛋白为亲水蛋白,其二级结构多以无规则卷曲为主要构成元件,且三级结构相似;亚细胞定位预测显示,果梅NAC蛋白为典型的核蛋白。选取12个NAC基因家族成员,利用实时荧光定量PCR技术进行组织表达分析,结果表明,12个果梅NAC基因在不同组织中均有表达,但表达差异明显。其中3个基因(PmNAC54、PmNAC32、PmNAC68)在果皮中表达最高,4个基因(PmNAC60、PmNAC95、PmNAC51、PmNAC2)在果肉中表达最高,3个基因(PmNAC31、PmNAC62、PmNAC48)在嫩茎中表达最高,其余2个基因(PmNAC61和PmNAC71)分别在果胚和花芽中具有最高的表达,表达特征的差异表明它们可能具有不同的生物学功能。本研究结果为果梅NAC蛋白的进一步功能分析奠定了一定的理论基础。     

华东葡萄抗白粉病转录因子基因的克隆及亚细胞定位分析

以抗白粉病华东葡萄（Vitis pseudoreticulata W.T.Wang）株系白河-35-1为材料,在经葡萄白粉病病原菌（Uncinula necator（Schw.）Burr.）诱导后获得的EST序列的基础上,本研究通过RACE技术克隆了一个具有转录域的转录因子全长1324bpcDNA序列,其阅读框为1053bp,编码350个氨基酸,命名为VpRFL1（GenBank登录号：FJ356672）。应用PCR技术,进一步获得了转录因子VpRFL1基因的DNA序列,其序列全长1599bp,VpRFL1基因包含3个外显子,2个内含子。生物信息学分析表明,华东葡萄白河-35-1VpRFL1基因编码的氨基酸序列在N端含有核定位信号,C端含有C4C4型RING锌指结构域。VpRFL1/PBI221-GFP在洋葱（Alliumcepa）表皮细胞中的瞬时表达分析表明,该转录因子主要定位于细胞核内。VpRFL1的序列特征与定位分析结果初步表明该转录因子基因在核内起作用,并可能参与了抗逆反应的相关途径。