文昌锥SRAP-PCR体系优化及有效引物筛选

通过单因素试验和正交试验相结合,分析DNA、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶4种因素对文昌锥SRAP-PCR扩增结果的影响,优化建立文昌锥SRAP-PCR体系。结果表明:文昌锥基因组DNA浓度和dNTPs浓度过低或过高均扩增不出产物,而引物浓度和Taq酶用量的增加能提高扩增效率。在适宜浓度范围内,各个因素对文昌锥SRAP-PCR扩增影响大小依次为:引物=dNTPsTaq酶DNA;最优反应体系为:总体系为20μL时,DNA 20 ng,引物0.6μmol/L,dNTPs0.15 mmol/L和Taq酶4 U。经验证,该体系获得的扩增产物清晰、稳定;筛选获得45对有效性引物组合多态性好,可应用于SRAP分子标记技术在文昌锥资源研究。     

地高辛标记对旱稻进行southern杂交分析主要影响因素的优化和验证

以转基因旱稻和野生型旱稻为材料,对通过地高辛随机引物标记法进行的旱稻基因组Southern杂交条件进行了优化分析,包括探针制备效率、DNA样品量、酶切体系及转膜时间等。结果表明:影响探针制备效率的首要因素是温度而不是时间;DNA上样量在10~30μg均可以获得高质量的杂交图;60μL体系15 h即可酶切彻底并获得良好的杂交效果;转膜时间6 h即可。本研究所优化的地高辛标记的旱稻杂交分析结果稳定重复性好,具有较高的灵敏度和信噪比。     

转TGEV-S基因玉米中目的基因的PCR检测及优化

为提高转基因玉米中目的基因的检出效率,以猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白（TGEV-S）转基因玉米为材料,利用PCR方法检测样品中的目的基因.通过对PCR反应体系中4种不同DNA聚合酶和8种退火温度进行比较,建立和优化了转基因玉米中TGEV-S基因的PCR检测方法.对450株转基因玉米叶片DNA和种子DNA中的TGEV-S基因片段进行检测,并设计33对引物检测插入转基因玉米基因组DNA中的质粒pBAC9020DNA片段.结果显示,LA Taq酶对叶片DNA和种子DNA中TGEV-S片段的PCR扩增敏感性和特异性均优于其他Taq聚合酶,且退火温度为53～55℃时扩增效果较好.分别对450份转基因玉米叶片DNA和种子DNA检测结果显示阳性率分别为82.5％和76.3％.利用33对引物进行的PCR扩增及测序结果显示质粒pBAC9020基因片段已全部插入该玉米基因组DNA中.本试验建立的转TGEV-S基因玉米PCR检测方法敏感性和特异性高,为转基因玉米阳性植株的检测奠定了坚实的基础.     

隐性核不育芝麻AFLP反应体系的优化

以芝麻细胞核雄性不育系95ms-5为材料,对AFLP反应体系中的酶切连接、预扩增和选择性扩增中的关键性因素进行了优化。结果表明,在模板DNA质量浓度为200ng/μL、37℃酶切连接6h的情况下,预扩增中最佳Mg2+浓度为1.0mmol/L,dNTP最佳浓度为0.3mmol/L,Taq酶量以0.5U为宜,预扩增引物终浓度为0.4mmol/L;选择性扩增中,预扩增产物稀释10倍后,以Mg2+0.8mmol/L、dNTP 0.2mmol/L、Taq酶1.0U、选扩引物0.6mmol/L为宜。     

我国紫薇属植物AFLP分子标记体系的优化

以采自广西、云南和河南等地的紫薇属Lagerstroemia植物紫薇L.indica,南紫薇L.subcostata,福建紫薇L.limii和桂林紫薇L.guilinensis叶片为材料,利用改良CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法提取叶片基因组DNA,获得了高质量的紫薇叶片DNA,并以其基因组DNA为模板进行了酶切连接,利用酶切连接的产物稀释一定倍数作为预扩增的模板,最后以稀释一定倍数的预扩增产物进行选择性扩增,进行紫薇和南紫薇的AFLP（扩增片段长度多态性）银染反应体系的优化。AFLP体系中每一步反应都设置了不同的反应体系,采用了160对引物作为初选引物,筛选出了10对适合紫薇基因组扩增的引物。结果表明,适宜紫薇基因组扩增的最佳酶切、预扩增和选择性扩增体系为：酶切连接体系1;预扩体系3;选扩体系3,反应体系中Mg2＋质量浓度为1.2×10-6kg.L-1时扩增效果较好。     

松毛虫AFLP反应体系的建立及引物筛选

为研究不同环境条件下松毛虫的遗传多样性,以油松毛虫为材料研究松毛虫的AFLP反应体系。对选择性扩增中的预扩增产物稀释倍数、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度和Taq酶浓度进行了比较分析。结果显示,在选择性扩增体系中,预扩增产物稀释40倍,Mg2+浓度1.5 mmol/L、dNTP浓度0.2 mmol/L,引物浓度0.500pmol/L,Taq酶用量为1U,扩增产物经5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可以得到稳定的结果。用优化的AFLP反应体系,以油松毛虫、赤松毛虫和马尾松毛虫为材料筛选引物,从81对引物组合中筛选出10对多态性高的引物组合。     

大花三色堇FPNI-PCR反应体系的优化

融合引物与巢式聚合酶链式反应(fusion primer and nested integrated PCR,FPNI-PCR)是一种分离并扩增已知序列旁未知序列的有效方法。以大花三色堇(Viola×wittrockiana Gams.)为材料,为提高FPNI-PCR产物特异性,增加条带清晰度,降低非特异性条带的干扰,对FPNI-PCR反应体系中第1轮的模板DNA浓度进行对比,优化了第3轮反应中引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、缓冲液用量,筛选了第3轮特异性引物的退火温度,进一步完善了FPNIPCR反应体系。各因素优化比对试验表明:FPNI-PCR第1轮反应体系应以稀释后的DNA为模板,20μL体系中,用量在4.5~10 ng。第3轮最优反应体系为:20μL反应体系中,特异性引物浓度0.2μmol/L,引物SP2浓度0.75μmol/L,Taq DNA酶用量1.0 U,d NTP用量2μL,10×buffer(20 mmol/L,Mg2+plus)用量2μL,模板1μL(第2轮反应稀释100倍后取1μL为模板),dd H2O补足。第3轮反应中,退火温度为64℃或66℃时条带最为清晰。     

小麦春化相关特异性PCR扩增体系的建立

以小麦幼苗DNA为模板 ,采用小麦春化相关特性Verc2 0 3序列设计合成的春化特异引物 ,进行PCR扩增。通过对扩增体系中引物浓度、Taq酶浓度、Mg2 + 、退火温度以及扩增程序的选择优化 ,确定了PCR扩增的最佳条件 ,获得稳定而理想的扩增效果     

荷花ISSR引物筛选及反应体系优化

利用加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的100条ISSR引物,以2个荷花品种的DNA为模板进行PCR扩增。采用单因素试验方法对荷花ISSR-PCR反应体系的5个因素(Mg2+、引物、dNTP、模板DNA、Taq酶)进行浓度优化,确定了荷花ISSR反应的25μL最佳扩增体系为:10×Taq Buffer 2.5μL,Mg2+3.0 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,引物1.0μmol/L,Taq酶1.00 U,模板DNA 40 ng。筛选出8条扩增条带较好的ISSR引物,并对其引物进行梯度PCR试验,筛选出各引物对应的最佳退火温度,扩增共计获得61条ISSR条带。     

杞柳AFLP反应体系的建立与引物筛选

以杞柳F1群体为试验材料,采用改良的CTAB法提取基因组DNA,经过酶切、连接、预扩增和选择性扩增,建立杞柳AFLP的反应体系,筛选EcoRI和MseI各16条选择性扩增引物组成256对引物组合。结果表明:320 ng基因组DNA采用5U EcoRI和MseI双酶切6 h,20℃连接12 h,连接产物稀释10倍进行预扩增,预扩增产物稀释15倍进行选择性扩增,选择性扩增产物采用ABI-3130检测,可获得条带清晰的指纹图;从256对引物组合中共筛选出98对多态性较高的引物组合。     

黄瓜基因组DNA提取及AFLP体系优化研究

［目的］提取黄瓜基因组DNA,并对AFLP体系进行优化。［方法］以黄瓜嫩叶为材料,利用改进的CTAB法提取高质量的黄瓜叶片总DNA,通过优化酶切连接、预扩增、选择性扩增等试验条件建立适合黄瓜的AFLP银染体系,得到清晰的黄瓜AFLP指纹图谱。［结果］DNA 模板的质量影响酶切以及后续的连接扩增反应,改良的CTAB 提取法可用于黄瓜AFLP 分析,形成清晰的AFLP 指纹。优化的酶切连接体系为：以37 ℃酶切连接12 h为宜,酶切连接的基因组DNA用量为200 ng,预扩增时Taq酶用量为0.5 U/20 μl体系,预扩增产物稀释40倍作为选择性扩增的模板。在此优化的体系下引物E41M47扩增出清晰的条带。［结论］为黄瓜品种的分子标记和黄瓜品种间亲缘关系等研究奠定了基础。     

硅胶干燥旱稻叶片制备DNA样品及其RAPD反应体系的建立

进行了硅胶干燥制备DNA样品和RAPD反应体优化的研究。结果表明：①用硅胶干燥的旱稻叶片可制备出高质量的DNA样品。所提取的DNA样品的OD260／OD280（对波长260nm与280nm光线的吸光度的比值）为1.7-1.9，OD260／OD230＞2，DNA分子质量为30.6Mu左右，产率在50－170μg/g，DNA完整性较好，能够成功用于RAPD扩增。②确立旱稻最佳的PCR反应体系是50－100ng DNA模板，1.2U的Taq酶，2.5mmol/L的Mg^2 ，0.25mmol/L的dNTPs，0.5μmol/L引物，10mmol/L Tris-Cl(pH8.0），50mmol/L KC,0 .1％明胶，反应终体积20μL。     

桃甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术体系的建立

为建立适合桃的甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplification polymorphism,简称MSAP)反应体系,以桃PCM-1R、PCM-1G为材料,对MSAP技术中的关键因素进行优化。结果表明,500 ng基因组DNA用EcoRⅠ、HapⅡ或MspⅠ各10 U(0.5μL,2 000 U/m L),37℃保温12 h,即可酶切完全;25μL选择性扩增体系中,含有2μL10倍稀释的预扩增产物、各1μL上下游引物、2.5μL 10×Taq buffer、2.5μL d NTP mix(各0.2 mmol/L)、2.5μL25 mmol/L MgCl_2、0.25μL Taq DNA聚合酶。在该体系下选用256对引物对桃叶片进行甲基化模式分析,经筛选获得23对扩增条带清晰、重复性好的引物,PCM-1R、PCM-1G总甲基化率分别为28.0%、25.7%。     

油茶AFLP分子标记体系的建立

以油茶DNA为材料,对AFLP分析中的基因组DNA酶切用量、连接液稀释倍数、预扩增产物稀释倍数、Mg(2+)浓度等4个因素进行优化比较.结果表明,用EcoR I和Mse I双酶切500ng基因组DNA效果最好,酶切产物加接头后稀释10倍进行预扩增效果较好.在Mg(2+)浓度为50μmol/L时,预扩增产物稀释90倍作为...     

蜡梅AFLP-银染体系的建立与优化

为了建立蜡梅AFLP-银染的优化体系,采用EcoRI和MseI 2种限制性内切酶酶切组合,对该2种酶的用量、酶切时间、预扩增与选择扩增中的Mg2 浓度、Taq DNA聚合酶的用量、引物的浓度以及预扩增产物的稀释倍数等因素进行了多水平的筛选,同时探讨了温度及聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的电流强度等因素对胶图的影响。结果表明:用5 U限制性内切酶酶切4 h便能在40μL的反应体系中完全切割500 ng的总DNA,酶切连接产物稀释10倍后在含有1.5 mmol/L Mg2 1、U Taq、预扩增引物E A和M C分别为40 ng的20μL反应体系中进行预扩增,将预扩增产物稀释30倍后在含有1.5 mmol/L Mg2 、0.6 U Taq、选择扩增引物E 3为30 ng、M 3为60 ng的20μL的体系中进行选择性扩增,能够得到质量比较好的AFLP胶图。此外,在进行PAGE电泳和硝酸银染色,将电泳的温度控制在50℃左右,电流控制在45~60 mA左右能提高胶图的质量。利用这种优化的反应体系,成功地评价了40个蜡梅基因型的遗传多样性,6对选择扩增引物组合表现出较高的稳定性、清晰度和多态性,它们分别是:E-AAC/M-CCC,E-ATC/M-CCC,E-AGA/M-CAG,E-AAA/M-CAC,E-ATA/M-CCA,E-ATT/M-CCA。     

青稞AFLP体系的建立及优化

本文以青稞为材料,对AFLP酶切连接、预扩增、选择性扩增过程进行优化。结果表明,酶切反应条件为DNA模板200 ng、限制性内切酶Eco RI/Mse I 4U、酶切时间4h;连接反应条件为连接温度16℃,T4连接酶3 U,连接时间12 h以上;预扩增反应条件为r Taq聚合酶3 U、dNTP 4 mmol/L、镁离子浓度1.00 mmol/L;选择性扩增反应条件为r Taq聚合酶4 U、d NTP 4 mmol/L、镁离子浓度1.25 mmol/L及预扩产物稀释10倍。利用优化后的AFLP体系,以藏青2000、冬青18这2个供试材料的基因组为模板,从100对引物组合中筛选出10对重复性好、稳定性强、扩增条带清晰、分布均匀、多态性高的引物组合,为青稞种质资源鉴定及遗传多样性分析提供了基础。     

胡枝子属ISSR-PCR反应体系的建立与优化

在利用ISSR技术对胡枝子属种质资源遗传多样性进行研究的实验过程中,对影响PCR扩增效果的一些因素如DNA的提取、模板DNA质量浓度、Taq酶用量、引物用量、dNTP的用量以及退火温度等指标进行筛选和优化,筛选优化出可用于胡枝子属ISSR-PCR分析较适宜的PCR反应条件:Taq酶1.0 U,2μL的10×Buffer(200 mM Tris-HC l;200 mM KC l;100 mM(NH4)2SO4;15 mM MgC l2),模板DNA 40 ng,dNTP 0.2 m mol/L,引物0.2μmol/L.     

药用植物草珊瑚AFLP反应体系的建立

从草珊瑚(Sarcandra glabra)的幼嫩叶片中提取基因组DNA,建立草珊瑚AFLP反应体系,对AFLP反应体系中模板DNA的浓度、基因组DNA的双酶切时间、预扩增产物的稀释倍数和引物组合的筛选等关键因素进行摸索.优化的草珊瑚AFLP反应体系为模板DNA的用量20 ng/μL、酶切反应时间4h、预扩增产物稀释15倍,初步筛选出8对较为适合草珊瑚AFLP分析的引物组合.     

蒙古冰草SRAP反应体系建立

研究以蒙古冰草为材料,通过单因子Mg2+、dNTP、Taq酶、引物、DNA试验;2×Taq PCR Master Mix、引物、DNA正交试验建立了蒙古冰草SRAP反应的优化体系。结果表明:最佳反应体系为10uL:2uL 2×Taq PCR Master Mix、0.4umol/L引物、60ng模板DNA。该体系对蒙古冰草扩增效果好,电泳结果显示扩增条带清晰,多态性高,而且操作简单,为SRAP标记技术在蒙古冰草相关研究中的应用提供条件。     

利用CODEHOP设计简并引物克隆镰刀菌果胶酶基因片段

利用CODEHOP(Consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers)设计真菌果胶酶基因片段的简并引物,并对设计的多对引物进行筛选,比较了普通PCR和Touchdown-PCR(TD-PCR)程序的扩增效果,并对产物进行了测序、比对和分析。结果表明:利用CODEHOP设计简并引物可信性强,阳性率高,能够从供试菌株中获得与目的片段大小相近的产物。利用TD-PCR程序扩增比普通PCR扩增效果好。扩增产物序列BLASTX比对和分析结果表明,产物片段编码的氨基酸序列与镰刀菌属来源的果胶酶氨基酸片段相似性均超过90%,说明所扩增的序列即为镰刀菌果胶酶基因片段。