猪血管紧张素转化酶2重组蛋白诱导表达和纯化条件的优化

[目的]本文旨在探索猪血管紧张素转化酶2(ACE2)在大肠杆菌中最佳表达条件和纯化蛋白的最佳方法。[方法]将已构建好的猪重组表达载体p ET-32a-ACE2转染至大肠杆菌BL21(DE3),通过改变IPTG诱导浓度以及诱导时间来对诱导表达条件进行筛选,实现目的蛋白高效表达后选用Ni~(2+)-NTA亲和层析和KCl染色切胶2种方法,对获得的重组猪p ET-32aACE2融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE和免疫印迹等分析鉴定表达产物。[结果]当IPTG浓度为1 mmol·m L-1、诱导时间为10 h时,ACE2蛋白在BL21(DE3)中表达量最高,以包涵体形式存在。表达产物的相对分子质量约为100×103,与预期目的蛋白大小相符。选用的Ni~(2+)-NTA亲和层析和KCl染色切胶2种方法纯化重组p ET-32a-ACE2融合蛋白包涵体,均能得到可溶性的重组蛋白,但KCl染色切胶法纯化获得的可溶性重组蛋白浓度及纯度都更佳,纯化蛋白经Western blot鉴定具有良好的抗原性。[结论]本试验建立猪p ET-32a-ACE2重组蛋白诱导表达的最佳条件:IPTG浓度1 mmol·m L-1,诱导时间为10 h。并且以KCl染色切胶法纯化该重组p ET-32a-ACE2融合蛋白包涵体效果更好。     

传染性法氏囊病毒VP2蛋白的高效表达与免疫原性分析

为了实现传染性法氏囊病毒(IBDV)B87毒株VP2蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达,将IBDV B87毒株VP2基因插入原核表达载体p ET-28a(+),构建重组质粒p ET28a-VP2,将其转化不同大肠杆菌基因工程菌株,通过IPTG诱导表达VP2外源蛋白。利用鸡传染性法氏囊病抗原快速检测试纸筛选,确定了BL21(DE3)为VP2可溶性蛋白的高效表达菌株。SDS-PAGE、Western blot分析表明,VP2实现了可溶性表达,且可溶性VP2蛋白具有良好的反应原性。将表达的重组蛋白利用琼脂扩散试验(AGP)分析,结果表明,VP2蛋白的AGP效价达到1∶64。将重组蛋白免疫接种SPF鸡,制备的抗血清AGP效价可达1∶16,说明表达的B87毒株VP2蛋白免疫原性良好。     

猪轮状病毒重组VP8*蛋白的原核表达及免疫原性分析

为了分析原核表达的猪轮状病毒(PRV)Gottfried株截短的VP8*(△VP8*aa 64-223)重组蛋白的免疫原性,通过构建原核表达载体p ET-28a-Gottfried-△VP8*(aa 64-223),转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达、经SDS-PAGE和Western blotting检测,并纯化后,肌肉免疫Balb/c小鼠,证明重组蛋白相对分子质量约25.0 k Da,以包涵体和可溶性两种形式存在,纯化的重组蛋白纯度在95%以上,可溶性蛋白产量可达14~15 mg·L-1。ELISA方法检测表明该重组蛋白可以诱导高滴度的特异性抗体,证明其具有良好的免疫原性,为进一步研制PRV亚单位疫苗及建立ELISA诊断方法奠定基础。     

利用NusA促溶标签原核表达Butelase 1蛋白

为获得可溶性Butelase 1蛋白,将Butelase 1基因插入到带有NusA促溶标签的原核表达载体上,将重组质粒转化至大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,用Ni-NTA亲和层析法纯化表达的可溶性蛋白,用SDS-PAGE和Western blot分析蛋白的表达情况。酶切和测序结果证实p ET21b-His6-NusA-Butelase 1原核表达载体构建成功。SDS-PAGE分析结果表明诱导后表达的融合蛋白大小为94.9 k D,主要为可溶性表达,部分为包涵体表达。Western blot检测结果显示,纯化得到的His6-NusA-Butelase 1融合蛋白用抗His6-Tag抗体鉴定时为特异性表达。     

利用NusA促溶标签原核表达Butelase 1蛋白

为获得可溶性Butelase 1蛋白,将Butelase 1基因插入到带有NusA促溶标签的原核表达载体上,将重组质粒转化至大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,用Ni-NTA亲和层析法纯化表达的可溶性蛋白,用SDS-PAGE和Western blot分析蛋白的表达情况。酶切和测序结果证实p ET21b-His6-NusA-Butelase 1原核表达载体构建成功。SDS-PAGE分析结果表明诱导后表达的融合蛋白大小为94.9 k D,主要为可溶性表达,部分为包涵体表达。Western blot检测结果显示,纯化得到的His6-NusA-Butelase 1融合蛋白用抗His6-Tag抗体鉴定时为特异性表达。     

非洲猪瘟病毒p30-54融合蛋白基因的构建、表达及其多克隆抗体制备

为了制备反应原性良好的非洲猪瘟病毒(ASFV)血清学诊断抗原,根据ASFV p30和p54基因序列,通过大肠杆菌密码子优化后分别体外合成全长的p30和p54基因,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)将2个基因片段串联,构建p30-54融合基因。将构建的融合基因片段克隆入p ET-28a(+)表达载体中,构建原核表达载体p ET-p30-54,转化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG诱导表达,检测融合蛋白的反应原性,并制备抗该融合蛋白的多克隆抗体。SDS-PAGE检测结果显示,表达的p30-54融合蛋白分子质量为47. 1 ku; Western blot分析显示,该融合蛋白可被ASFV阳性血清特异性识别,表明其具有良好的反应原性。将p30-54融合蛋白用Ni-NTA亲和层析柱纯化后免疫小鼠,成功制备了抗ASFV p30-54融合蛋白多克隆抗体。     

棉铃虫中肠钙黏蛋白Cry1A结合区编码基因的原核表达及多克隆抗体制备

通过RT-PCR扩增出棉铃虫中肠钙黏蛋白毒素结合区编码基因片段Cad-tb,将其克隆到pET-30a原核表达载体中,并在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,获得融合表达的包涵体,经过变性、Ni-NTA柱亲和纯化、复性等方法处理包涵体,获得可溶性纯化蛋白,用纯化后的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,利用ELISA检测其效价。结果显示,以pET-30a-Cad-tb表达载体转化BL21菌后,经IPTG诱导成功获得分子量为37 ku左右的重组蛋白,单抗-His的Western blot鉴定其正确表达。纯化后的蛋白成功免疫新西兰大白兔,获得了该蛋白的多克隆抗体,ELISA检测其效价高于1∶16 000。     

日本脑炎病毒E基因抗原域Ⅲ的克隆及高效表达

根据GenBank公布的日本脑炎病毒 (Japaneseencephalitisvirus ,JEV)SA14 14 2减毒株的核苷酸序列 ,设计并合成一对特异性引物 ,应用RT PCR方法扩增出编码JEV囊膜蛋白抗原域Ⅲ的基因 (EⅢ) ,将其连接入pMD18 T载体 ,经测序后克隆入原核表达载体pET 32a (+) ,构建原核表达载体pET EⅢ 。阳性质粒转化感受态大肠杆菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导 ,JEV EⅢ 基因获得表达 ,经细胞定位分析 ,目的蛋白以包涵体的形式存在于大肠杆菌中。通过改变IPTG的浓度和诱导时间 ,确定了表达EⅢ 蛋白的最佳诱导条件 :IPTG终浓度为 0 1mmol·L-1,诱导时间为 3h。在大肠杆菌中的最高表达量占菌体总蛋白的 5 4 9%。Western blot分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。利用纯化的表达产物作抗原包被酶标板 ,可以明显地区分JEV阴、阳性血清 ,并且不与猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒的阳性血清发生反应。结论 :重组JEVEⅢ 蛋白可以用于检测猪血清中JEV抗体水平。     

BVDV/IBRV主要抗原表位E2/gD基因串联表达及免疫原性

为开发研制牛病毒性腹泻-黏膜病毒(BVDV)及牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的联合亚单位疫苗,开展了BVDV E2蛋白、IBRV gD蛋白主要抗原表位串联表达及免疫原性研究。利用2步PCR法获得E2-gD基因,构建原核表达载体pET28a-E2-gD,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE结果显示重组蛋白表达,BCA工作盒测定纯化蛋白浓度为2.69 mg/mL;Western-blot结果显示其具有作为免疫原的特异性;免疫家兔制备抗血清,血清中和试验结果表明,中和抗体效价为44.7(IBRV)/22(BVDV)。这说明E2-gD蛋白免疫原性较好,可诱导产生较高效价的中和抗体。     

鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白在大肠杆菌细胞周质中的表达

[目的]利用大肠杆菌可溶性地表达鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2蛋白。[方法]根据IBDV vp2全长序列(Gen Bank登入号AY704912),设计一对缺失VP2蛋白N-端80个氨基酸残基的特异性引物,克隆IBDV HQ株的vp2基因,插入质粒p ET-22b中构建大肠杆菌周质表达质粒p ET-22b-vp2,经IPTG诱导后表达重组蛋白。[结果]在SDS-PAGE中可见大小约为39 k Da重组蛋白。重组蛋白纯化后,Western Blot检测表明其具有良好的反应原性。[结论]在大肠杆菌细胞周质中可以高效地可溶性地表达鸡传染性法氏囊病毒IBDV VP2蛋白,并且该重组蛋白有较好的免疫原性,可以为后续亚单位疫苗及检测试剂盒开发提供所需的蛋白。     

鼠疫杆菌YscF抗原基因在大肠杆菌中的表达及鉴定

为了克隆表达鼠疫耶尔森氏菌的YscF抗原基因,并对其免疫原性进行初步研究,将PCR扩增的YscF基因连接到pMD-18T载体,测序正确后再将YscF基因连接到表达载体PET32a,构建PET32a-YscF重组质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达;诱导表达蛋白采用Ni2+亲和层析法纯化,Western blot检测其免疫原性。结果显示,28 ku的PET32a-YscF融合蛋白能被兔抗鼠的多抗识别,说明表达产物具有良好的抗鼠疫抗原特异性。     

非洲猪瘟病毒UBCv1的原核表达及多抗制备

[目的]为研究非洲猪瘟病毒(ASFV)泛素结合酶(UBCv1)的生物学功能及致病机制奠定基础.[方法]以p3XFLAG-CMV-7.1-I215L质粒为模板,利用PCR方法扩增非洲猪瘟病毒I215L基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a,构建pET-28a-I215L重组质粒,并将其转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白.重组蛋白经His柱层析纯化后免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用ELISA方法检测抗体效价,Western blot检测抗体特异性.[结果]成功构建了重组质粒pET-28a-I215L,重组菌经IPTG诱导后能够可溶性表达重组蛋白,产物约28 kDa,与预测大小一致.用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA测定抗体效价为1∶7290000;Western blot结果显示抗体具有较好的特异性.[结论]成功表达纯化了ASFV的泛素结合酶并制备其多克隆抗体,为后期解析ASFV泛素结合酶的结构、功能及病毒相关致病机制提供了重要的生物材料.     

绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的表达条件优化、纯化及鉴定

为了将绿色荧光蛋白(GFP)引入大肠杆菌中表达并且进行蛋白的纯化,以提高GFP在大肠杆菌中的表达量,用于传统检测方法的改进及目的菌的应用研究.将人工重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),研究大肠杆菌菌株在温度、诱导时间以及诱导剂IPTG浓度等不同条件对HIS-GFP融合蛋白表达量的影响.结果:大肠杆菌菌株BL21(DE3)在37℃培养下,D600为0.6～0.8,使用终浓度为0.5 mmol/L的IPTG在15℃诱导培养12 h时,HIS-GFP融合蛋白表达量最高,表达的HIS-GFP融合蛋白可占细菌总蛋白的40％以上.用Ni-IDA亲和层析柱对HIS-GFP融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE分析表明HIS-GFP融合蛋白大小约为68 ku,与预计的分子量大小一致,Western blotting分析表明其能与Anti-HIS单克隆抗体起特异性反应.     

猪瘟病毒E2糖蛋白主要抗原域的原核表达及纯化

本实验利用PCR方法从pUC18-E2上扩增出E2基因的主要抗原域片段,长为601 bp,将该PCR产物克隆到原核表达载体pET32a上,得到pET32a-e2重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达,目的蛋白以包涵体形式表达,其分子量42KD左右;Ni亲和层析柱纯化融合蛋白,并通过Western blot检测.pET32a-e2重组子的构建及蛋白表达与纯化为进一步制备多克隆抗体或单克隆抗体打下了基础.     

小反刍兽疫病毒核衣壳蛋白(N)重组表达条件的优化

为获得更高含量的可溶性N蛋白,对构建的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(pET-32a-N)的表达条件(如诱导温度、诱导时间、IPTG浓度)进行了优化.结果表明:N蛋白最佳诱导表达条件为18℃诱导17h、IPTG浓度0.2 mmol/L;优化后可溶性N蛋白的表达量为22.1 mg/L,比优化前37℃、IPTG浓度1.0 mmol/L条件下诱导4h提高了58.5％.     

猪轮状病毒VP7蛋白在E.coli中的表达纯化

为制备猪轮状病毒VP7蛋白的多抗,构建大肠杆菌表达载体pQE-30-VP7,表达猪轮状病毒VP7蛋白,纯化重组蛋白VP7并对其进行鉴定。利用RT-PCR方法扩增出猪轮状病毒VP7全长基因1062 bp,克隆到pMD18-T载体中,利用SalⅠ和HindⅢ消化重组DNA进行酶切鉴定,定向克隆到表达载体pQE-30中,转化E.coli BL21(DE3)株,经PCR和酶切鉴定阳性质粒,经IPTG(终浓度为1 mmo L·L-1)37℃进行诱导,Western blot和间接免疫荧光检测目的蛋白的反应原性。酶切和序列表明成功构建原核表达系统,重组大肠杆菌经IPTG诱导后,我们发现该重组蛋白主要以包涵体形式存在于细菌中,大小约为43 KDa,Western blot和间接免疫荧光分析表明该VP7重组蛋白可与Po RV阳性血清发生了特异性反应。     

1型鸭甲型肝炎病毒3D基因的原核表达与多抗制备

根据血清1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)SH株3D基因序列设计并合成1对特异性引物,通过RT-PCR方法扩增3D基因,将其克隆入原核表达载体p ET-32a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导培养下重组蛋白获得了成功表达。SDS-PAGE显示重组蛋白的分子量约为68 k D,Western blot分析显示该重组蛋白能与多聚组氨酸标签单抗发生特异性反应。将切胶后纯化的目的蛋白免疫ICR小鼠,制备针对重组蛋白的多抗血清,Western blot结果显示制备的抗血清能够与DHAV-1感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,3D基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的多抗血清可以用于3D蛋白的检测,为3D蛋白的功能研究奠定了基础。     

不同诱导剂及培养条件对C型产气荚膜梭菌β_2毒素基因表达的影响

对产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)β2毒素基因的表达载体p ETXB2进行限制性核酸内切酶酶切鉴定,并用SDS-PAGE检测了不同培养条件下,该毒素基因在埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)工程菌株中的表达情况。结果表明,p ETXB2重组质粒中的β2毒素基因位于p ET-28c(+)表达盒中,且阅读框架和基因序列正确。以IPTG为诱导剂时,重组菌株BL21(DE3)(p ETXB2)的最佳培养条件为37℃,p H7.0,IPTG终浓度0.8 mmol·L-1,诱导4 h;以乳糖为诱导剂时,其最佳培养条件为37℃,p H 7.0,乳糖终浓度0.5 g·L-1,诱导5 h。     

牛病毒性腹泻黏膜病毒E2基因的原核表达与免疫原性分析

[目的]原核表达牛病毒性腹泻黏膜病毒(BVDV)E2基因编码蛋白。[方法]采用PCR方法从BVDV中扩增E2基因片段,与原核表达载体pET-32a连接,构建重组表达质粒pET-32a-E2,转化E.coli(Rosetta)感受态细胞,重组菌用1 mmol/L IPTG诱导表达E2蛋白,进行SDS-PAGE电泳,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白,经Western blot分析鉴定免疫原性。[结果]重组质粒pET-32aE2经PCR及酶切鉴定证明构建正确,重组质粒能够在大肠杆菌中大量表达,表达产物的分子质量大小约为58 kDa,纯化后E2重组蛋白浓度0.521 mg/mL,Western blot分析表明,其能被BVDV阳性血清识别,具有很好的免疫原性。[结论]E2蛋白成功表达,为后续建立BVDV检测方法奠定了基础。     

O型口蹄疫病毒VP0和VP1蛋白的可溶性表达与反应原性分析

为了高效可溶性表达O型口蹄疫病毒(FMDV)VP0、VP1结构蛋白,根据大肠杆菌密码子的偏爱性优化合成VP0和VP1基因片段,并将其克隆到p E-SUMO载体中,构建重组质粒SUMOVP0和SUMO-VP1,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,并优化诱导温度、时间和IPTG浓度等表达条件。结果显示,SUMO-VP0可溶性蛋白表达的最佳条件为:20℃条件下,0.1 mmol/L IPTG诱导表达8 h;SUMO-VP1可溶性蛋白表达的最佳条件为:37℃条件下,0.1 mmol/L IPTG诱导表达12 h。SDS-PAGE电泳和Western blot结果表明,表达的SUMOVP0、SUMO-VP1可溶性蛋白能够被抗FMDV的阳性血清识别,具有很好的反应原性。