鸡传染性喉气管炎病毒微滴式数字PCR定量检测方法的建立

旨在建立检测鸡传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus, ILTV)绝对定量方法。根据已发表的鸡ILTV的TK基因序列,针对其保守区域分别设计1对特异引物和1条探针,建立检测鸡ILTV的微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果显示,建立方法的最佳引物浓度为20μmol/μL,最佳探针浓度为10μmol/μL,最佳退火温度为56℃。特异性检测结果显示,建立的方法只检出ILTV,没有检出其他病原株。敏感性检测结果显示,采用建立的方法定量检出ILTV重组质粒标准品的最低限为4.6拷贝/μL。对3个连续稀释的pMD18-ILTV重组质粒DNA进行检测,3次重复检测结果的变异系数均小于5%。对83份病鸡喉拭子、肺及脾组织样品进行检测,采用建立的ddPCR检出ILTV阳性样品10份,荧光定量PCR检出ILTV阳性样品9份,ddPCR的阳性检出率(12.05%)高于荧光定量PCR的阳性检出率(10.84%)。结果表明,建立的ddPCR方法定量检测ILTV特异性强、敏感性高、重复性好...     

猪圆环病毒3型微滴式数字PCR检测方法的建立与应用

为建立能灵敏、高效、准确诊断猪圆环病毒3型(PCV3)的检测方法,并运用该方法研究PCV3传播特性及组织嗜性,根据GenBank中PCV3 ORF2基因(MF631813.1)的核苷酸序列,设计合成PCV3的引物和探针,通过退火温度以及引物、探针用量和特异性等优化,建立了PCV3微滴式数字PCR检测方法.试验结果表明建立的猪圆环病毒3型微滴式数字PCR检测方法具有较好高的灵敏性、重复性和特异性,最低能检测到1μl 16.35拷贝的质粒标准品,可用于猪圆环病毒3型的早期诊断.     

猪圆环病毒PCR检测方法的建立

本研究建立了检测猪圆环病毒的PCR方法,并对该方法进行了标准化研究.该方法具有快速、敏感、特异性强等特点,从PCV2感染的细胞中町最低扩增到0.1 ng的DNA,且对其它病原微生物如PRV、PPV不能检出.可对病料、血清提取DNA进行检测,所有程序在5 h内得出结果.该方法可用于PCV2感染猪的快速诊断,引种检疫,分子流行病学调查.     

鸭瘟病毒PCR检测方法的建立

根据GenBank 发表的鸭瘟病毒(DPV)的基因序列,设计了针对DPV UL6 UL7保守区1对特异性引物。通过对反应条件的优化,建立了鸭瘟病毒快速鉴别诊断的PCR方法,扩增片段大小为1 293 bp。试验结果表明PCR法具有很强的特异性,且敏感性较高,最低DNA模板检出量为15 pg/mL。对鸭瘟的临床病料检测证明,该方法具有特异、快速和敏感的特点,可有效鉴别DPV。     

马铃薯3种病毒的多重PCR检测方法构建

[目的]构建马铃薯A病毒（Potato virus A,PVA）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）3种马铃薯主要易受感染的病毒多重PRC（multiplex PCR）检测方法。[方法]根据GenBank公布的PVA、TMV、PVY基因序列分别设计引物,建立3种马铃薯病毒的多重PCR方法;通过构建3种病毒PCR扩增目的基因的质粒用于制备标准品进行敏感性验证,利用PVX（Potato virus X）、PVM（Potato virus M）、PVS（Potato virus S）、PVV（Potato virus V）,CMV（Cucumber mosaic virus）等其他马铃薯病毒进行特异性试验;并对11份疑似发生病毒病的马铃薯块茎采集样品进行了检测。[结果]研究中构建的马铃薯3种病毒多重PCR检测方法,最低检测下限：PVA为100 copies/2μl,PVY为100 copies/2μl,TMV为1 000 copies/2μl,与PVX、PVM、PVV、PVS、CMV等其他马铃薯病毒无交叉反应,具有良好的特异性;11份疑似发生病毒病的马铃薯块茎中7份样品检出3种病毒感染阳性。[结论]该研究成功构建了马铃薯PVA、TMV、PVY病毒的多重PCR方法,为马铃薯病毒检测技术应用奠定一定基础。     

猪圆环病毒多重PCR检测方法的建立

为建立PCV1和PCV2混合感染快速检测的PCR方法,根据GenBank已发表PCV1和PCV2全基因组序列,设计合成4条引物,通过PCV1和PCV2阳性质粒的构建、反应条件的优化、敏感性试验和特异性试验,建立了PCV多重PCR检测方法,可扩增出PCV1和PCV2长度分别为726 bp和433 bp特异性目的基因片段。结果显示,建立的PCV多重PCR可检测到5×101个拷贝的PCV1和PCV2目的基因,HCV、PRV、PPV核酸扩增均为阴性,具有良好的特异性和敏感性。并初步应用建立的方法对42份采自四川省部分地区的样品进行检测,结果表明,PCV1阳性率为33.3%,PCV2阳性率为45.2%,其中PCV1和PCV2混合感染阳性率为16.6%。     

转基因马铃薯PCR检测方法

本文针对国际上商业化种植的3种转基因马铃薯的1种国内大田实验的转基因马铃薯，确定了使用PCR方法检测商品化转基因马铃薯的技术路线。在本研究中，选取马铃薯种属特异性的内源蛋白ptatatin基因片断为内对照，用以检验蝗取的样品DNA质量，有效避免假阴性并确定检测样品的种源，选取FMV35S启动子、CaMV35S启动子、NOS终止子、NPTⅡ选择基因作为筛选基因，选取外源目的基因PLRVrep、PVYcp作为鉴定品系的鉴定基因，同时筛选出检测以上基因的最佳引物序列，并优化了PCR反应条件，实验结果表明，各对引物特异性强且工作良好；PCR反应条件稳定可靠。本方法适用于进出口检验检疫部门和农业部门对转基因马铃薯的检测监控。     

运用微滴式数字PCR技术检测转基因玉米品系的研究

[目的]运用微滴式数字PCR技术检测转基因玉米品系。[方法]基于微滴式数字PCR平台,建立3种转基因玉米品系TC1507、MIR162、MIR604的二重微滴式数字PCR(dd PCR)检测方法。[结果]特异性试验结果显示,该法只有特定品系的靶序列才有扩增信号。灵敏度试验表明,该方法在10 pg基因组DNA用量时可定量检测到2~16个拷贝。[结论]该研究建立的3种转基因玉米品系定量检测方法特异性强、灵敏度高,可用于进出口农产品中3种转基因玉米品系成分的定量检测。     

马铃薯Y病毒的RT—PCR检测

通过两种方法提取了烟草病叶中PVY病毒的RNA,然后针对PVY~N的CP基因序列,设计合成了一对特异性引物,运用反转录PCR技术对提取的PVY－RNA进行了体外扩增,结果得到与预期大小相一致的780bp片段,而对照未得到任何产物,从而建立了运用RT－PCR手段检测植物中PVY的又一有效途径,并运用此方法对东北三省部分地区马铃薯种薯中PVY的带毒情况进行了检测。     

检测猪圆环病毒2型PCR方法的建立

[目的]为快速诊断猪圆环病毒病提供参考。[方法]根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)的核苷酸序列设计并合成1对特异性引物,建立诊断PCV-2地方分离株的PCR方法。[结果]各物质在PCR反应中最佳浓度分别为:dNTP 220 pmol/ml,Taq酶0.1 U/μl,引物20 pmol/μl。从PCV-2阳性病料中提取DNA,在优化条件下进行PCR扩增,获得预期的494 bp特异性条带。用该PCR方法对PCV-2、PRRSV、HCVS、IV、PPV进行检测,PCV-2为阳性,而PRRSV、HCV、SIV、PPV检测均为阴性,未出现交叉反应,说明该PCR方法对PCV-2具有良好的特异性。该PCR方法可检出1.25 ng模板DNA,具备较高的敏感性。[结论]使用该PCR方法检测PCV-2是切实可行的。     

鸭黄病毒巢式PCR检测方法的建立和应用

参照GeneBank已登录的黄病毒基因序列设计通用引物,建立基于黄病毒通用引物的巢式PCR检测体系,为黄病毒特别是新发黄病毒提供了高效的检测方法。该方法通过基因组的比对,选择NS5基因保守区设计了4条通用简并引物Flav P1～Flav P4,在此基础上建立了巢式PCR反应体系,并应用到鸭黄病毒的检测中。该体系仅能扩增鸭黄病毒目的基因而不能扩增其他病毒,且敏感性达到90copies.μL-1,比普通PCR高出1 000倍。同源性和进化分析表明,鸭黄病毒属蚊媒黄病毒类恩塔亚病毒群,与坦布苏病毒及近期发现的BYD病毒关系最近。以上结果表明,设计的黄病毒引物具有良好的通用性和特异性,其巢式PCR敏感性高,该体系成功地进行了鸭黄病毒的检测,验证了该方法的敏感性和特异性。     

羊口疮病毒PCR检测方法的建立与应用

根据羊口疮病毒(ORFV)H2L基因序列,设计合成1对引物,通过确定最佳的PCR反应条件,建立了检测羊口疮病毒DNA的PCR检测方法.结果显示,用这1对引物均能扩增出羊口疮病毒507 bp的特异性片段,同时检测口蹄疫病毒和山羊痘病毒,结果均为阴性,最小检出量为5 pg.该方法具有良好的特异性和敏感性,可对临床组织病料中的ORFV进行快速检测.     

虹彩病毒蛙病毒属病毒实时荧光PCR检测方法的建立

在GenBank 中搜寻虹彩病毒蛙病毒属主衣壳蛋白(MCP)基因序列并进行多重比较后,利用其中的保守序列,设计引物和Taqman探针,建立了虹彩病毒蛙病毒属实时荧光PCR检测方法.对荧光PCR反应条件进行优化,评估该检测方法的特异性、稳定性和重复性,利用10倍系列稀释法检验其灵敏度并与常规PCR做了比较.结果显示,该方法对虹彩病毒蛙病毒属成员(新加坡石斑鱼虹彩病毒除外)的检测有高度的特异性,与淋巴囊肿病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒、真鲷虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒等其他水生动物病毒之间均无交叉反应,有良好的特异性,检测总DNA灵敏度为4.5×10-3pg/μL,比传统PCR的敏感度高出100倍,可对低病毒含量的样品进行准确检测.制作的标准曲线有极好的线性关系,且线性范围宽,相关系数为0.998 4.组内和组间重复试验的Ct值标准偏差分别为1.2%和1.6%,有良好的重复性.与常规的PCR相比较,该方法具有快速、特异、敏感、可定量、可同时检测大量样品等优点,可用于出入境检疫和动物防疫监督部门对虹彩病毒蛙病毒属的疫情监测.     

鳗鲡圆环病毒PCR检测方法的建立及应用

鳗鲡圆环病毒(Eel circovirus,EeCV)是引起鳗鲡病毒性疾病的病原之一。根据GenBank已经发表的EeCV基因序列,设计一对特异性引物,对PCR反应条件优化,进行特异性、敏感性和重复性试验,建立了EeCV的PCR检测方法,并应用该方法对从福建省不同地区采集的160份疑似鳗鲡病毒性疾病病料进行了检测,其中65份表现为阳性,阳性率可达40.6%。结果表明,建立的PCR方法特异性强、敏感度高、重复性好,可以应用于EeCV引起的病害检测。     

非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快捷高效的非洲猪瘟病毒(ASFV)的检测方法,本研究根据GenBank中登录的ASFV B646L基因保守区序列设计引物和探针,通过优化PCR反应体系和反应条件,建立了非洲猪瘟Taqman荧光定量(ASFV-qPCR)检测方法,验证其特异性、灵敏性和重复性。结果显示：本研究所建立的检测方法特异性强,与猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均无交叉反应;灵敏度高,能检出10拷贝阳性质粒DNA;重复性好,组内和组间重复试验变异系数均小于1.5%。本研究为非洲猪瘟快速诊断提供了有力技术支撑,为进一步开发ASFV多重荧光PCR检测技术奠定了坚实的基础。     

RT- PCR检测鸡传染性支气管炎病毒方法的建立

根据Genbank中鸡传染性支气管炎病毒(IBV)核蛋白(NP)基因序列,设计了1对引物,通过鸡胚繁殖IBV,纯化鸡胚尿囊液中的IBV,提取病毒RNA,建立了检测传染性支气管炎病毒的RT-PCR方法。对IBV各毒株(M41,H52,H120,Aust-T以及野毒株等)检测,结果均为阳性,而对鸡的其他病毒性疾病病毒(IBDV,AIV,NDV)进行检测,结果均为阴性。初步结果表明所建立的RT-PCR技术可用于鸡传染性支气管炎病毒各血清型毒株的检测。     

猪瘟病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中5′端非编码区的靶序列设计了用于TaqMan荧光定量PCR的1对引物及TaqMan探针,以猪瘟活疫苗病毒为模板,在常规PCR的基础上优化了TaqMan荧光定量PCR反应条件,建立了猪瘟病毒（CSFV）TaqMan荧光定量PCR检测方法。其敏感性和特异性试验结果表明,所建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法对CSFV具有很高的特异性,其检测灵敏度可达5.03×10-2μg/μL。说明TaqMan荧光定量PCR适用于CSFV的快速检测。     

猪瘟疫苗病毒荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种检测猪瘟疫苗病毒(HCLV)含量的荧光定量PCR方法。【方法】用RT-PCR方法扩增HCLV基因200bp片段,构建含有该基因片段的重组质粒,对此重组质粒进行系列稀释后作为SYBR GreenⅠ荧光定量PCR模板,绘制定量检测HCLV的标准曲线。【结果】在(6.4×107~6.4×102)copies/μL模板浓度范围内,荧光定量PCR的扩增效率为92.2%,标准曲线的决定系数为0.9997。该方法的精确灵敏度为640copies/μL,重复性试验的变异系数小于2%,对牛病毒性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等的检测结果均为阴性。临床检测结果显示,不同商品猪瘟疫苗之间的病毒载量存在明显差异。【结论】建立了1种具有良好特异性与敏感性的HCLV荧光定量PCR检测方法。     

犬博卡病毒PCR检测方法的建立及其应用

[目的]建立犬博卡病毒(Canine bocavirus,CBo V)的PCR检测方法,了解其流行情况。[方法]根据Gen Bank数据库上CBo V的VP2基因序列合成1对引物,建立PCR检测方法,并运用该方法对临床样品进行检测。[结果]特异性试验中,除CBo V有目的条带出现外,犬细小病毒(CPV)、犬瘟热病毒(CDV)、犬传染性肝炎(ICHV)、犬副流感病毒(CPIV)、猫瘟热(FDV)等均无条带出现。敏感性试验表明,此检测方法对CBo V的最低检测量为4.806 2 pg/μL。重复性试验表明,多次重复试验结果一致,表明此方法重复性好。425份样品中仅有1份样品扩增出目的条带,经测序比对鉴定为CBo V。初步的流行病学调查结果表明,CBo V在犬中的流行率与感染率极低。[结论]建立的PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、可重复性强等特点。