橡胶树HbFCA启动子在转基因烟草中的功能缺失分析

利用5′缺失设计一系列引物,扩增HbFCA启动子质粒,获得5个启动子缺失片段,用这些片段分别替换PBI121载体中的CaMV35S启动子,得到5个HbFCA的5′缺失表达载体,即pA、pB、pC、pD和pE。利用农杆菌介导叶盘法进行烟草遗传转化,对组培瓶内生根较好的烟草叶片GUS染色,结果发现,长度为最小片段的276 bp的pE可以较好地实现HbFCA启动子的功能。对橡胶树体细胞胚瞬时表达检测发现,pE片段也能启动表达,有较好的GUS活性,可以实现HbFCA启动子的功能。     

陆地棉叶片特异性表达启动子的克隆与表达分析

【目的】本研究旨在获得叶片特异表达启动子的全长并进行表达分析,为抗逆转基因育种提供重要顺式作用元件。【方法】通过基因芯片及RT-PCR筛选鉴定出1个高活性的棉花叶片特异性表达基因,通过电子克隆及PCR获得了该基因全长,并通过染色体步移法(Genome walking)经过3次步移成功获得翻译起始位点上游2kb左右的DNA片段,将其命名为叶片特异性表达启动子LSP(leaf specific promoter)。【结果】生物信息学分析表明,该序列含有启动子的基本元件TATA-box、CAAT-box及多个顺势作用元件。通过构建该启动子驱动GUS的植物表达载体p Ghlsp∷GUS,并经农杆菌花絮侵染法转化拟南芥,对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色观察,结果显示该基因主要在叶片中特异性表达,而根部以及茎部几乎不表达。【结论】LSP是一个全新的叶片特异性表达启动子,为研究外源基因在棉花叶片中的定位表达奠定基础。基因工程中利用此类启动子可以在改良棉花性状的同时减少对棉花生理方面的副作用,在棉花抗逆转基因育种方面有广泛的应用前景。     

籽粒高效特异性表达启动子的克隆与表达分析

启动子是调控基因表达的重要元件,本研究从燕麦中克隆了燕麦球蛋白基因的启动子序列,经过比对发现新克隆的启动子序列长960 bp,与参考序列AY795082存在9个SNPs.对启动子组成元件进行分析表明,该启动子含有胚乳特异表达所必须的5个Skn-1(GTCAT)基序;在启动子的正链第622 bp和830 bp处存在胚乳表...     

橡胶树红根病菌Fip-gpo基因的克隆及启动子分析

为预测橡胶树红根病菌(Ganoderma pseudoferreum)真菌免疫调节蛋白基因的序列特点和表达模式,采用同源克隆获得Fipgpo的c DNA和DNA的全长序列。结果表明:该基因编码区全长934 bp,编码111个氨基酸残基,分子量为12.54 k D,等电点4.66,有4个ATM磷酸化位点,与赤灵芝(G.lucidum)的Fip序列相似性为91%;其启动子区域含有59 bp的内含子,除了含有TATA-box、CAAT-box基本元件外,还含有参与光应答/调控元件、赤霉素响应元件、茉莉酸甲酯应答元件、厌氧诱导作用元件、调控在胚乳中特异表达的顺式作用元件、分生组织特异激活顺式元件及生长素反应元件。推测Fip-gpo基因的表达受激素、非生物诱导、光照等的调控。     

橡胶树Lhcb2基因的克隆与表达特性分析

基于从基因组中获得的基因序列,应用RT-PCR技术从橡胶树叶片中分离得到1条849bp的cDNA;该cDNA包含1个798bp的ORF,编码265个氨基酸,理论分子量为2866kD,等电点为542,属于叶绿体定位的类囊体膜蛋白;蛋白含有3个跨膜螺旋,2个C端螺旋,1个保守的捕光叶绿素a/b结合蛋白结构域,1个三聚化基序,以及多个类胡萝卜素和叶绿素结合位点,根据进化关系可归为LHCB2亚家族;蛋白与蓖麻、野草莓、可可、葡萄和棉花中同源蛋白的一致性均接近95%,在进化上显示出高度的保守性,将基因命名为HbLhcb21。表达分析显示,HbLhcb21倾向于在叶片中表达,且其转录水平随着叶片的成熟而逐渐增加,但随着叶片的衰老而明显下调。     

巴西橡胶树HbRALF34的克隆及表达分析

依据橡胶树胶乳转录组数据,利用RT–PCR技术鉴定了一个快速碱化因子(rapid alkalinization factor,RALF)家族基因cDNA序列。该cDNA长度为767 bp,开放阅读框长度为411 bp,编码136个氨基酸。序列比对显示该RALF基因与AtRALF34有较高相似性,因而命名为HbRALF34。以热研7–33–97无性系橡胶树为材料,采用实时荧光定量PCR对不同组织及乙烯、茉莉酸、伤害、过氧化氢、高盐、低温、干旱等处理下HbRALF34的表达模式进行分析。结果表明:HbRALF34在橡胶树叶片、花、树皮以及胶乳中均有表达,其中胶乳中表达量最高;与健康橡胶树相比,HbRALF34在死皮橡胶树胶乳及树皮中的表达量显著上调;乙烯、茉莉酸、过氧化氢及伤害处理能诱导该基因表达,而低温、干旱及高盐处理则抑制该基因表达,表明HbRALF34可能参与橡胶树的信号传导、产排胶调控以及胁迫响应。     

洋葱ANS基因启动子的克隆与瞬时表达分析

通过PCR方法对洋葱花青素合成酶基因(AcANS)上游启动子序列进行扩增,获得长度为1.8 kb和2.2 kb的两种片段,命名为ANSPM1和ANSPM2。序列分析表明,克隆到的两个启动子除含有多个TATA-box、CAAT-box等基本启动子元件,还含有与MYB转录因子结合的元件,以及参与光响应、逆境、激素应答的顺式作用元件。同时构建ANSPM1和ANSPM2驱动GUS报告基因的植物表达载体,通过洋葱表皮细胞瞬时表达分析,表明两个启动子均有活性。     

橡胶树乳管细胞GPPS基因的克隆与表达分析

[目的]克隆橡胶树乳管细胞短链异戊烯基合酶(GPPS)基因,分析其表达特性和编码蛋白的相互作用,为解析该类基因在天然橡胶和萜类合成中的作用提供理论参考.[方法]采用逆转录PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速克隆(RACE)从橡胶树乳管细胞胶乳中克隆GPPS基因(HbGPPS1和HbGPPS2),利用生物信息学分析其编码蛋白的特性;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测HbGPPS1和HbGPPS2在树皮和胶乳中的组织表达特异性、在不同橡胶树品系中的表达模式及其对割胶和外源茉莉酸甲酯(MeJA)处理的响应模式,并在原核细胞中进行表达分析;通过酵母双杂交技术检测HbGPPS1和HbGPPS2蛋白的相互作用关系.[结果]从橡胶树乳管细胞乳胶中克隆获得HbGPPS1和HbGPPS2基因,其中HbGPPS1基因编码框长度为1248 bp,编码415个氨基酸,蛋白分子量为45.9 kD,理论等电点为6.77;HbGPPS2基因编码框长度为1239 bp,编码412个氨基酸,蛋白分子量为45.6 kD,理论等电点为6.77.二者的核苷酸序列相似性为89%,且编码蛋白均含有2个典型的异戊烯基转移酶活性结构域DDXXD(D),定位于叶绿体和线粒体.HbGPPS1蛋白自身及其与HbGPPS2蛋白均能形成较弱相互作用的二聚体.qRT-PCR检测结果显示,Hb-GPPS1和HbGPPS2基因在胶乳中的表达量高于树皮,但均以HbGPPS2基因表达量较高,表明二者表达存在组织特异性.经MeJA处理后橡胶树胶乳中HbGPPS1和HbGPPS2基因表达量较对照高,即外源MeJA可促进内源茉莉酸的合成,激活乳管细胞内的茉莉酸信号从而上调HbGPPS1和HbGPPS2基因表达.在5个橡胶树栽培品系中,HbGPPS2基因的表达量均明显高于HbGPPS1基因,且与PR107、热研7-20-59、RRIM600和热研7-33-97干胶含量趋势一致,但二者仅在热研8-79和热研7-33-97的表达模式存在差异.HbGPPS2基因能在大肠杆菌中成功表达.[结论]HbGPPS2基因可能是乳管细胞中参与天然橡胶和萜类合成的主效基因,而HbGPPS1基因可能是功能冗余基因.HbGPPS2和Hb-GPPS1基因在不同橡胶树品系中的表达模式与各品系干胶含量呈正相关,可用作为干胶含量评估的筛选标记.     

橡胶树乳管HbPMP1基因的克隆与表达分析

过氧化物酶体膜蛋白PMP是ABC转运蛋白ABCD亚家族蛋白之一．存在于过氧化物酶体膜上。研究表明．拟南芥中的ABCD亚家族ABC转运蛋白AtABCD1主要通过参与部分物质运输进入过氧化物酶体．其中包括茉莉酸合成的前体OPDA。本研究通过RACE技术克隆了一个ABCD亚家族ABC转运蛋白基因HbPMP1．并进行表达分析。结果表明：HbPMP1全长4011bp．编码1337个氨基酸残基,其表达产物与拟南芥AtABCDl有较高的相似性（氨基酸一致性为78％）：该基因在伤害及外源茉莉酸诱导下呈上调表达．推测其可能参与内源茉莉酸合成相关物质时的运输．     

水稻OsSPL3启动子克隆及表达分析

OsSPL转录因子在水稻（Oryza sativa）根系、叶片、花器官、穗等发育与逆境响应过程中起重要作用。本文通过对OsSPL3启动子的分析,探究了OsSPL3转录因子在水稻中的表达模式及其对干旱胁迫的响应方式。利用PLACE和Plant CARE在线软件分析OsSPL3启动子区的顺式作用元件,并构建OsSPL3启动子与β-葡糖醛酸糖苷酶（β-glucuronidase, GUS）基因的重组表达载体,转化‘中花11’(ZH11)水稻愈伤组织,筛选获得阳性转基因植株,且对p OsSPL3-GUS转基因植株的GUS表达活性以及在干旱胁迫与脱落酸（abscisic acid, ABA）处理下的表达方式进行检测。启动子分析结果表明,OsSPL3启动子区除包含必要的转录起始核心元件与光响应元件外,还包括3个MYB参与的干旱诱导元件、3个赤霉素响应元件、2个厌氧诱导必需作用元件、1个低温响应作用元件、1个胚乳表达调控元件、1个玉米醇溶蛋白代谢调控元件和1个分生组织表达相关调控元件。GUS染色结果显示,GUS基因在新生叶片、茎鞘、胚芽鞘等幼嫩组织及根冠、分生区、伸长区等根系旺盛生长部位中表达活性较...     

水稻OsFAH基因启动子的克隆及表达分析

以湘晚籼13号为材料,克隆了水稻OsFAH基因启动子,构建了OsFAH启动子与GUS基因融合表达载体,并转化拟南芥。序列分析结果表明,该启动子包含了启动子核心序列TATA–box和CAAT–box以及光响应元件等。GUS染色结果表明：在拟南芥幼嫩的子叶、下胚轴和真叶中,GUS的表达较强;随着叶片的衰老,GUS表达减弱;在根中,GUS主要在主根的维管柱内表达;黑暗处理会使GUS表达减弱;在黑暗条件下,OsFAH基因表达下调。     

枳PtMLP1启动子的克隆和表达分析

【目的】基因工程是柑橘品种改良的一种重要手段。本研究基于枳根消减文库中主要乳胶蛋白基因PtMLP1片段,克隆根特异启动子序列,为研究外源基因在柑橘根组织的特异表达奠定基础。【方法】同源克隆PtMLP1及启动子序列。利用ExPASy、PSIPRED、SWISS-MODEL等在线软件对PtMLP1编码蛋白的理化特征、二级结构和三级结构进行生物信息学分析,利用PlantCARE数据库对PtMLP1启动子的顺式作用元件进行预测。实时荧光定量PCR法对PtMLP1在不同树龄枳根和叶中的表达进行分析。构建PtMLP1启动子与GUS标记基因的融合载体,利用根癌农杆菌转化法转化枳上胚轴,GUS染色观察标记基因的表达部位。【结果】枳PtMLP1含2个外显子和1个内含子,开放阅读框长471 bp。PtMLP1蛋白由156个氨基酸组成,分子量17.63 kDa,等电点5.49,含Bet v I功能域。其二级结构含3个α-螺旋和7个β-折叠,三级结构包含一个保守疏水基结合位点和一个富含甘氨酸的回环结构。5′端1 666 bp的上游调控序列不仅有TATA-box、CAAT-box等启动子结构的核心元件,还具有多...     

橡胶树PEPC基因的克隆、生物信息学和表达分析

【目的】克隆橡胶树磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的全长cDNA,通过生物信息学和基因表达分析,为基因功能研究奠定基础。【方法】根据橡胶树PEPC基因片段序列设计引物,通过RACE获得cDNA全长,用DNAMAN软件预测编码多肽序列,用Prot Param工具分析多肽基本理化性质,用NCBI-Blast工具搜索同源的核酸及多肽序列,用Clustal X2.0软件比对不同植物来源的多肽序列,并用MEGA 6.06软件构建系统进化树,用Real-time RT-PCR分析基因表达模式。【结果】从橡胶树胶乳中克隆到一个新的PEPC基因的全长cDNA,其长度为3206 bp,包含一个2898 bp的开放读码框(ORF),112 bp的5’UTR和196 bp的3’UTR。预测该基因编码965个氨基酸的多肽(HbPPC2),其分子量为110.35 kDa,等电点为5.76;该基因的编码区核苷酸序列和其编码多肽氨基酸序列分别与早期克隆的橡胶树HbPPC1基因(KJ721228)的编码区和编码多肽序列有81.3%和92.1%的同源性。预测HbPPC2定位于细胞质,为不稳定蛋白,其活性受多种因素调控。预测HbPPC2酶活性中心是其第172位残基His,磷酸化位点是其第11位残基Ser,单泛素化位点是其第628位残基Lys。其第178、179、226和366位残基Arg在三维结构中靠近,构成葡萄糖-6-磷酸(G6P)的结合位点;其第450、641、753、767位残基Arg在三维结构中靠近,构成PEP的结合位点。HbPPC2基因在叶片、树皮、胶乳、雄花、雌花均有表达,在胶乳表达量最高;乙烯利处理显著下调该基因在胶乳的表达。【结论】本研究可为橡胶树PEPC功能研究提供理论基础。     

巴西橡胶树HbNTL2基因的克隆和表达分析

利用RT–PCR和实时荧光定量PCR技术,对巴西橡胶树膜结合转录因子HbNTL2进行克隆和表达,并通过酵母试验进行转录激活功能分析。结果表明,HbNTL2基因的开放阅读框为1 380 bp,编码一个由459个氨基酸组成的蛋白,该蛋白属于NAC转录因子家族中的ANAC001亚族;在第6～172位氨基酸之间含有典型的NAC结构域,第433~453位氨基酸具有跨膜结构域,是膜结合NAC转录因子;HbNTL2具有转录激活功能,转录激活区在C–末端;HbNTL2在叶片的表达高于在橡胶树的其他部位,受割胶、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)处理以及低温胁迫诱导。综合分析结果表明,HbNTL2可能参与调控巴西橡胶树的生长发育和胁迫应答过程。     

橡胶树半胱氨酸蛋白酶基因HbCP2的克隆与表达特性分析

根据EST和基因组序列设计引物,应用RT-PCR技术从橡胶树的根组织中分离到1条长1056bp的cDNA,该序列包含了1023bp的开放读码框（ORF）,17bp的5’ UTR和16bp的3’ UTR;ORF预测编码340个氨基酸,理论分子量为3752kD,等电点为525,属于液泡定位的分泌型蛋白;蛋白含有1个Inhibitor_I29和1个Peptidase_C1A结构域,隶属于木瓜蛋白酶C1家族;蛋白与蓖麻、杨树中同源蛋白的相似性均在80%以上,将基因命名为HbCP2。表达分析显示,在所分析的根、树皮、木质部、芽、叶片、叶柄和乳管等组织中,HbCP2仅在根中被检测到,表现出明显的组织特异性。     

橡胶树叶片衰老相关基因HbLEA3的克隆与表达分析

为揭示HbLEA3的序列特征和转录调控模式,研究以橡胶树衰老叶片为材料,利用RT-PCR技术克隆了该基因652 bp的cDNA序列,其中包含173 bp的5′UTR、303 bp的ORF以及176 bp的3′UTR。结果表明:基因编码100个氨基酸,理论分子量为11.61 kDa,等电点为9.07,GRAVY为-0.498,含有一个LEA_3家族特有的保守结构域,线粒体定位;蛋白与木薯、蓖麻、麻疯树和可可树中同源蛋白的相似性均在60%以上,而在拟南芥和水稻中亲缘关系最近为AtLEA3和OsLEA10,相似性分别为36.0%和41.1%;HbLEA3主要在叶片中表达,并随着叶片的成熟而稳步上调,但在衰老早期短暂下调,随后在衰老中期显著上调;此外,基因的表达还受低温、PEG、NaCl、H_2O_2、ABA、乙烯利、茉莉酸甲酯和水杨酸等多种非生物胁迫和逆境相关植物生长调节剂的诱导。因此,HbLEA3是一个与橡胶树叶片发育和胁迫响应相关的胚胎发育晚期丰富蛋白基因。     

巴西橡胶树逆境响应基因HbPRX53 的克隆与表达分析

在干旱胁迫下,橡胶树过氧化物酶活性显著增加。为了研究干旱响应的过氧化物酶基因功能,从橡胶树中克隆了HbPRX53全长DNA。生物信息学分析结果表明,HbPRX53含有334个氨基酸和1个植物过氧化物酶结构域。聚类分析结果发现,其与拟南芥过氧化物酶At PRX53最相近。HbPRX53在橡胶树树皮、叶片、胶乳和花中均有表达,但在叶片中表达量最高,白粉菌侵染、机械伤害和干旱显著上调叶片中HbPRX53的表达。此外,吲哚乙酸、脱落酸、水杨酸乙烯、过氧化氢和茉莉酸处理也会上调HbPRX53表达。这说明HbPRX53与橡胶树对生物和非生物胁迫的响应密切相关。     

巴西橡胶树HbMYBs转录因子的克隆及表达分析

通过同源序列比对,笔者克隆了巴西橡胶树5个与抗逆相关的HbMYBs基因,根据其与拟南芥同源基因的相似性,分别命名为HbMYB15,HbMYB21,HbMYB24,HbMYB35和HbMYB75,其阅读框长度分别为651,984,999,1 095,933 bp。生物信息学分析结果表明,这5个HbMYBs基因编码的蛋白序列都包含MYB家族结构域,属于R2R3类MYB转录因子。酵母自激活实验结果显示这5个HbMYBs蛋白均具有转录活性,具有转录因子特征。荧光定量PCR分析结果表明,创伤、乙烯处理和茉莉酸处理对这5个HbMYBs基因中有不同程度的诱导作用,这些基因有可能参与乙烯和茉莉酸信号相关的植物防御应答。     

巴西橡胶树HbICE2基因的克隆及表达分析

ICE(inducer of CBF expression)介导的非依赖ABA信号传导途径在植物应对低温胁迫反应中起重要的调节作用。采用RT-PCR技术从橡胶树无性系热研8-79的叶片中扩增到1条全长c DNA,共1 677 bp,包括1 593 bp的开放阅读框,编码530个氨基酸,含有bHLH结构域,其中包含19个特征性的保守KMDRASILGDAI(D/E)YLKELL氨基酸序列,命名为HbICE2(Gene Bank登陆号:KY406163)。该基因编码的蛋白分子质量为58.02 KDa,理论等电点为5.95。荧光定量PCR分析结果表明,HbICE2主要在叶片和树皮中表达,而且在原生皮中的表达量显著高于再生皮,在抗寒性较强的橡胶树无性系PR107的树皮中表达量显著高于抗寒性弱的橡胶树无性系热研8-79。HbICE2可能在橡胶树树皮应对低温胁迫的反应中起重要的调节作用。     

橡胶树半胱氨酸蛋白酶基因HbCP3的克隆与表达特性分析

半胱氨酸蛋白酶是一类重要蛋白水解酶,其广泛参与植物的生长发育及各种生物与非生物胁迫的应答。根据EST序列信息设计引物,从橡胶树的根中分离到1条1 056 bp的c DNA。该序列包含1个1 023 bp的开放阅读框(ORF),13 bp的5'UTR和20 bp的3'UTR。ORF预测编码340个氨基酸,相对分子质量为37 350,等电点为5.24,属于液泡定位的分泌型蛋白。该蛋白含有1个Inhibitor_I29和1个Peptidase_C1A结构域,可归为木瓜蛋白酶C1家族。该蛋白与蓖麻(Ricinus communis)和杨树(Populus trichocarpa)中同源蛋白的相似性都在80%以上,将基因命名为Hb CP3。表达分析显示,在橡胶树的根、树皮、木质部、芽、叶片、叶柄和乳管等组织中,基因仅在根中表达。