高速逆流色谱法分离制备辛夷中的表木兰脂素A

应用高速逆流色谱法从辛夷中快速分离化合物表木兰脂素A。两相溶剂系统:正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=(4∶6∶4∶6,v/v/v/v),以系统的上相为固定相,下相为流动相,转速为880r/min,流速为1.2mL/min,从50mg辛夷粗提物中分离得20mg纯度在94.2%以上的化合物,通过核磁鉴定为表木兰脂素A。     

预防性给予生物活性肽对巨噬细胞抵御LPS刺激的调节作用

预防性给予巨噬细胞(RAW264.7细胞)不同浓度的生物活性肽Gln-Glu-Pro-Val(QEPV)后,用脂多糖(LPS)刺激细胞,通过检测细胞因子表达和炎性蛋白基因转录,观察生物活性肽QEPV对细胞抵御LPS刺激的调节作用。结果表明,0.1g/L的QEPV有显著的促进细胞增殖作用,0.5g/L浓度以下的QEPV对RAW264.7细胞无增殖抑制作用。0.5g/L QEPV预处理RAW264.7细胞后,用LPS刺激细胞,其IL-6、IL-12等促炎细胞因子的分泌降低,抗炎细胞因子IL-10分泌提前,分泌量增加,COX-2、iNOS基因的转录水平降低,说明乳源性生物活性肽QEPV对RAW264.7细胞抵御LPS刺激起正向调节作用。     

益生菌Lactobacillus Casei Zhang对巨噬细胞中NO/iNOS表达的影响及其机制

目的:研究益生菌L.Casei Zhang对巨噬细胞RAW264.7中NO/iNOS表达的影响及探讨相关机制。方法:1×10~6CFU益生菌L.Casei Zhang与巨噬细胞RAW264.7细胞共培养2h,6h,12h,24h。收集细胞培养上清,检测NO的表达变化。通过Real-rime PCR检测iNOS、TLR2和TLR4表达的变化。L.Casei Zhang与RAW264.7共培养3h后,以LPS、CpG和PolyI:C刺激细胞,检测NO和iNOS表达的变化。结果:益生菌L.Casei Zhang促进了巨噬细胞中NO分泌和iNOS的表达。与TLR2的本底表达相比,L.Casei Zhang上调了RAW264.7细胞中TLR2的表达。TLR4 mRNA的表达在L.Casei Zhang与RAW264.7细胞共培养后2h显著增高。LPS和PolyI:C活化的巨噬细胞在L.Casei Zhang预处理后,NO/iNOS的表达水平显著降低。结论:益生菌L.Casei Zhang促进巨噬细胞中NO/iNOS的表达与促进TLR2和TLR4的表达有关。L.Casei Zhang抑制了LPS和PolyI:C诱导的巨噬细胞中NO/iNOS的表达。该研究为进一步阐明益生菌的免疫调节作用奠定了基础。     

高速逆流色谱分离金花葵花黄酮类化合物的条件研究

应用高速逆流色谱法分离金花葵花中2种黄酮类化合物.以乙酸乙酯-甲醇-水(10∶0.4∶10,V/V)作为两相溶剂体系,在主机转速900r/min、流动相流速2.0mL/min、水浴温度为30℃的条件下,从100.3mg金花葵花总黄酮纯化物中分离得到金丝桃苷10.07mg,纯度达94.194%;葛根素13.5mg,纯度达94.579%.     

高速逆流色谱分离紫苏酮的研究

紫苏酮是一种对试验动物肺部具有潜在毒性的物质. 该文采用高速逆流色谱分离法从紫苏叶中分离出了紫苏酮. 结果表明,以V(正己烷)∶V(乙醇)∶V(水)＝6∶5∶1 为溶剂系统,上相为固定相,下相为流动相,转速为 800 r/min,流动相流速为 1.2 mL/min,进样 1 g 粗提物,6 h 后分离出 280 mg 紫苏酮,经气相色谱测定,组分纯度达到 98.8%,并用核磁共振等方法进行了结构鉴定.      

刺五加对巨噬细胞产生NO与肿瘤坏死因子-α的抑制作用

用不同浓度刺五加提取物培养RAW264.7巨噬细胞,采用LPS与IFN-γ作为诱导剂,37℃培养24h,Griess试剂检测培养上清液中的NO含量,ELISA法检测培养上清液中的TNF-α含量。结果表明:刺五加提取物在浓度10～1000mg/L内对RAW264.7巨噬细胞分泌的NO具有极显著抑制作用(P<0.01),且呈剂量和时间依赖关系;刺五加提取物对TNF-α的分泌没有影响。这表明刺五加提取物可以显著抑制RAW264.7巨噬细胞产生的NO,而对肿瘤坏死因子-α的产生无明显抑制作用。     

辣椒素提取方法的比较研究

以干红辣椒皮籽为原料,采用有机溶剂提取辣椒素,研究了索氏提取、微波提取和超声波提取3种方法对提取率和提取效率的影响．采用氢氧化钠溶液作溶剂、微波辅助提取的工艺提取辣椒素,通过正交试验优化了工艺参数,对比分析了不同工艺对辣椒素提取的影响．结果表明,其它条件相同时,达到相同的提取率索氏提取需要4h,超声波提取需要50min,微波提取只需要3min．采用有机溶剂提取工艺得到的辣椒素的纯度为70％左右,采用氢氧化钠为溶剂、微波辅助提取的工艺所得到的辣椒素的纯度达到83％．这种工艺的优化条件为：质量分数5％氢氧化钠、400W微波功率、固液比为1：8．5（质量比）、提取时间为3min．     

塑化剂DEHP暴露对小鼠巨噬细胞的免疫毒性作用

为了研究邻苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)对巨噬细胞的免疫毒性,采用不同浓度剂量DEHP处理小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞和腹腔巨噬细胞,通过检测细胞吞噬、细胞因子分泌及活性氧水平变化探讨DEHP暴露对免疫系统的毒性作用。结果表明:高浓度(20、40、80 mg·L-1)DEHP处理48 h后对RAW264.7细胞可造成急性损伤。低浓度(1、5、10 mg·L-1)DEHP连续染毒处理10代后,RAW264.7细胞吞噬红细胞百分率及吞噬指数显著抑制(P0.05)。RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-12和IL-23等细胞因子能力明显降低,并表现出一定的剂量-效应关系。随着DEHP暴露浓度的增加,DEHP染毒造成RAW264.7细胞内活性氧产生,受损加剧。除此之外,DEHP暴露还能明显抑制小鼠腹腔巨噬细胞对红细胞的吞噬能力(P0.05)。以上结果表明,DEHP暴露对巨噬细胞具有免疫抑制作用,损伤了巨噬细胞正常免疫功能发挥。     

圆齿野鸦椿果皮总多酚的提取及其抗炎作用

采用超声波法提取圆齿野鸦椿果皮总多酚(TPEP),通过Box-behnken法对提取工艺进行优化,获得TPEP提取工艺:乙醇浓度45%,液料比31∶1,提取温度50℃,提取时间70 min,超声功率300 W.此条件下TPEP提取率高达(8.28±0.14)%.以脂多糖诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7构建体外炎症细胞模型,测定TPEP作用下细胞上清液中IL-6、PGE_2、TNF-α、NO的分泌量,发现TPEP可显著抑制这些炎性因子的表达,体现了良好的抗炎能力.     

超声波辅助提取鲜红辣椒中辣椒素工艺优化

以鲜红辣椒S06为材料，采用超声波法从鲜红辣椒S06中提取辣椒素，通过单因素试验得出较佳的乙醇–石油醚溶剂混合比、料液比、提取温度和时间，再通过L9(34)正交试验优化辣椒素的提取工艺。结果表明：提取率最高的条件为乙醇–石油醚溶剂混合比为3∶7，料液比为1∶5.5，温度为60 ℃，时间为2.0 h；纯度最高的条件为乙醇–石油醚溶剂混合比为3∶7，料液比为1∶5.5，温度为65 ℃，时间为1.5 h；与传统的乙醇提取法相比较，提取率和纯度分别提高了27.8%和53.8%，辣椒素提取率达(4.961±0.232)‰，辣椒素纯度达(8.568±0.245)%。该方法能提高辣椒素的提取率，降低提取成本，改良生产工艺。     

野生蒙古口蘑多糖通过NFE2L2通路对LPS诱导的巨噬细胞发挥抗炎和抗氧化调节作用

目的:研究蒙古口蘑多糖提取物对脂多糖诱导小鼠单核巨噬细胞的抗炎和抗氧化保护作用的机理。方法与结果:蒙古口蘑多糖提取物对RAW264.7的作用与LPS模型组相比,蒙古口蘑多糖提取物在下列浓度0.01、0.1、1、10μg/mL均能有效抑制NO、TNF-α和IL-6的产生;在浓度为10μg/ml的蒙古口蘑多糖提取物作用下,除NF-κB外NFE2L2、iNOS和HO-1的mRNA的表达量均显著升高;免疫印迹的结果表明,除NF-κB外NFE2L2、iNOS和HO-1的蛋白的表达量均有不同程度的升高。结论:蒙古口蘑多糖提取物对LPS诱导的RAW264.7具有保护作用,其抗炎抗氧化的机制通过NFE2L2和i NOS信号通路实现,而不主要通过NF-κB信号通路发挥作用。     

MiR-155在脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应中的表达研究

[目的]探讨miR-155在脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应中的表达及糖皮质激素(GCs)的干预影响。[方法]体外培养RAW 264.7巨噬细胞,分别用浓度为10.0、1.0、0.1μg/ml LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞,于2、6、12、24、36 h 5个时间点收集上清用ELISA检测白介素-6(IL-6)蛋白浓度;实时定量-PCR检测miR-155在2、6、12、36 h 4个时间点的表达变化。[结果]IL-6在各浓度LPS处理组、各时间点其含量均高于对照组(CK);miR-155的表达在各时间点LPS组均高于LPS+GCs和CK。[结论]LPS可以诱导RAW264.7巨噬细胞的炎症反应,炎症反应时miR-155高表达,糖皮质激素可抑制miR-155的表达。     

兽用吲哚美辛注射液的含量测定及热稳定性考察

目的:为控制其质量,建立了测定兽用吲哚美辛注射液含量的HPLC方法,并初步考察了该注射液的热稳定性.方法:采用高效液相色谱法测定含量,其含量测定的色谱条件是:色谱柱Ultimate XB-C18,流动相为0.1mol/L冰醋酸溶液-甲醇(20∶80),流速为1.00mL/min,柱温为室温,检测波长为228nm;热稳定性试验采用初均速法.结果:在该条件下测得兽用吲哚美辛注射液的含量为18.648±0.295mg/mL,在25℃下的有效期为2.21年.结论:该方法准确,可用于测定兽用吲哚美辛注射液的含量.     

γ-亚麻酸在RAW264.7细胞中的抗炎症作用机制

[目的]探讨γ-亚麻酸（GLA）对脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7细胞产生炎症介质的影响及其机制。[方法]以体外培养的巨噬细胞系RAW264.7细胞为研究对象,待细胞生长至融合状态后加入不同浓度（0、12.5、25、50μmol/L）的GLA预孵4 h,利用100 ng/m l的脂多糖（LPS）刺激12.0 h或0.5 h,同时设空白对照和LPS对照,利用蛋白印迹法检测诱生型一氧化氮合酶（iNOS）、环加氧酶-2（COX-2）蛋白的表达以及对IκBα、p-JNK/SAPK（Thr183/Tyr185）、p38 MAPK、p-p38 MAPK（Thr 180/Tyr182）、ERK1/2、p-ERK1/2的影响。[结果]GLA可以显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中iNOS和COX-2的蛋白表达（P〈0.05）,且在0~50μmol/L GLA浓度范围内存在剂量依赖关系。GLA可以显著抑制IκBα的降解（P〈0.05）,从而抑制NFκ-B的激活。GLA可以显著抑制LPS诱导的JNK1/2以及ERK1/2的磷酸化（P〈0.05）,对p38的磷酸化没有显著影响。[结论]GLA具有很好的消炎功效。抑制JNK1/2和ERK1/2的磷酸化、抑制NF-κB的激活可能是GLA发挥生物学效应的重要机制。     

刺梨总三萜的免疫活性研究

【目的】探究刺梨总三萜对免疫抑制小鼠及小鼠RAW264.7巨噬细胞的影响,综合评价刺梨总三萜的免疫活性。【方法】制备刺梨总三萜（TR）,给SPF级健康昆明小鼠腹腔注射环磷酰胺（CTX）构建免疫抑制模型,灌胃给予高（200 mg/kg）、中（100 mg/kg）、低（50 mg/kg）剂量刺梨总三萜,每天1次,连续灌胃14 d,试验同时设置空白对照组（不注射CTX,灌胃生理盐水）、模型组（灌胃生理盐水）、阳性对照组（灌胃3 mg/kg香菇多糖片）,采集血样及胸腺和脾脏,测算全血白细胞数、胸腺和脾脏指数、血清细胞因子（IL-2、IL-4、IL-6和TNF-α）水平及酸性磷酸酶（ACP）和乳酸脱氢酶（LDH）活力、脾脏组织丙二醛（MDA）含量和过氧化氢酶（CAT）活力;制作小鼠脾脏组织切片,HE染色后观察。检测0（空白对照组）,1.25,2.5,5,10,20 μg/mL（终质量浓度）刺梨总三萜对RAW264.7小鼠巨噬细胞增殖的影响,研究低、中、高剂量刺梨总三萜（终质量浓度分别为1.25,2.5,5 μg/mL）对经脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞NO分泌量的影响。【结果】与模型组相比,不同剂量刺梨总三萜处理小鼠全血白细胞数量、胸腺和脾脏指数均显著或极显著升高,血清中的IL-2、IL-4、IL-6和TNF-α水平大多显著或极显著升高,ACP和LDH活力极显著提高（除低、中剂量组LDH活力外）;脾脏MDA含量极显著降低（P＜0.01）,CAT活力极显著升高（P＜0.01）;脾脏组织细胞数量和排列情况均得到了较大改善。1.25~5 μg/mL刺梨总三萜能显著或极显著促进RAW264.7小鼠巨噬细胞增殖,5 μg/mL总三萜可显著抑制LPS诱导的巨噬细胞NO的分泌。【结论】刺梨总三萜能改善由CTX诱导的免疫功能抑制,提高机体抗氧化应激能力,促进小鼠RAW264.7巨噬细胞增殖,抑制LPS诱导的巨噬细胞NO分泌,具有潜在的抗炎免疫活性。     

昆仑雪菊中2个黄酮类化合物的分离鉴定及其抗氧化活性评价

从昆仑雪菊中分离纯化具有抗氧化活性的单体化合物。以抗氧化活性为指标,采用活性追踪的方法,筛选最佳的昆仑雪菊黄酮类化合物提取溶剂并对粗提物进行分离纯化得到单体化合物,并采用铁离子还原/抗氧化力测定法(FRAP法)、1,1-二苯基-2-硝基苯肼自由基清除法(DPPH法)和2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐自由基清除法(ABTS法)对化合物进行活性评价。结果表明:最佳的提取溶剂为甲醇,利用常压硅胶柱层析和Sephedex LH-20柱层析从粗提物中分离得到2个单体化合物;采用核磁共振(NMR)和电喷雾质谱(ESIMS)鉴定其化学结构:化合物1为2',3,4,4'-四羟基查尔酮,化合物2为4,2',4'-三羟基查尔酮。抗氧化活性测试结果表明,化合物1和化合物2的FRAP值均小于阳性对照α-生育酚,对DPPH自由基清除率的半数抑制浓度(IC50)分别为(45.32±0.26)μmol·L-1和(64.78±0.79)μmol·L-1,均低于阳性对照α-生育酚,对ABTS自由基清除率的IC50分别为(27.49±0.86)μmol·L-1和(32.13±2.79)μmol·L-1,均低于阳性对照α-生育酚。结论:从昆仑雪菊中分离得到的2个黄酮类化合物均具有很强的抗氧化活性。     

山豆根多糖对PRRSV感染RAW264.7细胞存活率及分泌炎性因子的影响

[目的]探讨山豆根多糖(SSP)对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)体外感染RAW264.7细胞存活率及分泌炎性因子水平的影响,为研发出治疗猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的新型兽药提供参考依据.[方法]以50、100、200和400 μg/mL SSP作用于PRRSV体外感染8h的RAW264.7细胞,通过MTT法评价SSP对PRRSV感染RAW264.7细胞存活率,ELISA检测SSP对PRRSV体外感染RAW264.7细胞培养上清液中的炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和MCP-1.[结果]PRRSV感染RAW264.7细胞8h极显著降低了细胞存活率(P<0.01,下同),而200~400 μg/mL SSP能极显著升高PRRSV感染RAW264.7细胞存活率.PRRSV感染RAW264.7细胞8h可极显著升高细胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和MCP-1水平,而SSP能有效降低PRRSV感染RAW264.7细胞分泌上述炎性因子水平,其中以200~400μg/mL SSP的抑制效果最佳.[结论]SSP通过提高炎症细胞存活率及抑制其分泌炎性因子水平,从而有效干预PRRSV感染免疫细胞的炎性反应.     

棉油皂脚中棉酚的提取分析及鉴定

采用有机溶剂法研究超声波辅助下,从棉油皂脚中提取、重结晶制备药用醋酸棉酚过程。结果显示,当超声萃取时间为40 min、酸浓度为1.4 mol/L、超声结晶时间为20~30 min时,可以得到含量为89.6%的0.63 g醋酸棉酚粗品,重结晶纯化后,经熔点、元素分析、紫外光谱、红外光谱、氢核磁共振光谱验证结果与标准品相同,其重结晶品纯度可达99.5%,具有药用功能。说明这种超声波辅助溶剂法提取、制备醋酸棉酚的工艺可行。     

巨噬细胞RAW264.7的培养及电转染条件的优化

为了建立最优的巨噬细胞RAW264.7培养方法和电转染条件,在细胞培养时采用两种方法了解细胞的培养特性并进行电转染条件的优化,建立并验证RAW264.7细胞快速、无血清培养体系的电转染方法。以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,进一步优化巨噬细胞电穿孔的条件。通过控制电压(250~420 V)、脉冲时间、电击次数、温度、电击缓冲液等转染条件,采用不同的条件组合,用电穿孔法将质粒pEGFP-C1转染于培养的RAW 264.7细胞。通过荧光显微镜分析转染效率,可见:用胰酶和细胞刮刀消化RAW264.7细胞,细胞损伤小,形态好。利用优化的电转染条件得出最佳转染条件是:电压350 V、脉冲时间30 ms、电击1次、电击缓冲液成分为cell盐和options且V(cell盐)∶V(options)=3∶1、最佳温度4℃。     

霍山石斛多糖的半仿生提取工艺优化与抗炎活性评价

[目的]优化霍山石斛多糖的半仿生提取工艺,并评价所提多糖的抗炎活性。[方法]以多糖得率为指标,采用单因素试验和正交试验方法对提取工艺进行优化,以LPS诱导的RAW264.7细胞为体外炎症模型,评价多糖的抗炎活性。[结果]半仿生提取法最佳工艺条件为:料液比1∶30、提取温度80℃、模拟胃液提取时间1.5 h、模拟肠液提取时间2.5 h,在此条件下多糖的得率为(60.9±1.2)mg/g,较传统水提法的多糖得率提高16.55%。细胞试验表明,霍山石斛多糖能抑制RAW264.7细胞NO及IL-1β的分泌,降低i NOS和IL-1βm RNA的表达。[结论]优化后的提取工艺合理可行,提取率高,所提多糖的抗炎活性优于传统方法制备的多糖。