传染性鼻气管炎病毒gD基因表位的原核表达与纯化

[目的]对牛传染性鼻气管炎病-毒(IBRV) gD基因表位进行原核表达,并对表达产物进行纯化鉴定.[方法]利用PCR扩增出gD基因3段表位即gD-A、gD-B、gD-C,并构建原核表达重组质粒pET-28a-gD.将其转入BI21(DE3)表达菌中,IPTG诱导表达.表达的gD重组蛋白经亲和层析纯化后,进行Western blot分析.[结果]重组表达质粒pET-28a-gD经PCR、双酶切及测序证明构建正确.SDS-PAGE表明,gD蛋白在大肠埃希菌中高效表达,表达的重组蛋白相对分子量约48 ku,与预期的蛋白分子量一致.纯化后的gD重组蛋白浓度为0.128mg//ml,免疫印迹结果显示纯化后的gD重组蛋白能与IBR标准阳性血清发生特异性反应,说明其免疫原性良好.[结论]成功表达了gD基因表位蛋白,该蛋白具有良好的反应原性,可作为预防IBR基因工程亚单位疫苗的候选抗原.     

BVDV/IBRV主要抗原表位E2/gD基因串联表达及免疫原性

为开发研制牛病毒性腹泻-黏膜病毒(BVDV)及牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的联合亚单位疫苗,开展了BVDV E2蛋白、IBRV gD蛋白主要抗原表位串联表达及免疫原性研究。利用2步PCR法获得E2-gD基因,构建原核表达载体pET28a-E2-gD,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE结果显示重组蛋白表达,BCA工作盒测定纯化蛋白浓度为2.69 mg/mL;Western-blot结果显示其具有作为免疫原的特异性;免疫家兔制备抗血清,血清中和试验结果表明,中和抗体效价为44.7(IBRV)/22(BVDV)。这说明E2-gD蛋白免疫原性较好,可诱导产生较高效价的中和抗体。     

传染性鼻气管炎病毒gE基因的表达与免疫原性

[目的]对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gE基因表位进行原核表达,并对表达产物进行免疫原性鉴定。[方法]利用PCR扩增出gE基因2段表位(gE-A、gE-B),并构建原核表达重组质粒pET-32a-gE。将其转化BL21(DE3)表达菌中,IPTG诱导表达。表达的gE重组蛋白经亲和层析纯化后,进行Westernblot分析。[结果]重组表达质粒pET-32a-gE经过PCR、双酶切及测序证明成功构建重组质粒。SDS-PAGE结果表明,gE蛋白在大肠埃希菌中高效表达,表达的重组蛋白相对分子量约52ku,与预期蛋白分子量一致。纯化后的gE重组蛋白浓度为0.254mg/mL。免疫印迹结果表明,纯化后的gE重组蛋白能与IBR标准阳性血清发生特异性反应,说明其免疫原性良好。[结论]成功表达了gE基因表位蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性,可作为检测IBRV的gE抗体的候选抗原。     

牛传染性鼻气管炎病毒部分gB蛋白的原核表达及抗原性分析

为对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gB基因进行原核表达,并对表达产物进行抗原性分析,利用笔者所在实验室已构建好的gB-BL21重组阳性菌落,进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并对培养及诱导表达条件(IPTG最佳浓度、作用时间)等影响表达的因素进行优化,然后将表达的gB重组蛋白进行亲和层析纯化。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果表明,gB蛋白在大肠杆菌中高效表达,表达蛋白的相对分子量约为32.4 ku,与预期的蛋白大小一致。经BCA(聚氰基丙烯酸正丁酯)蛋白含量测定试剂盒测定,gB重组蛋白浓度为1.84 mg/mL。Western Blot结果显示,纯化后的gB重组蛋白能被标准IBR阳性血清识别,说明表达的目的蛋白具有良好的反应原性,可作为IBRV检测的特异性抗原。试验为建立牛传染性鼻气管炎诊断方法及研究gB蛋白的功能特性提供了材料和技术理论支持。     

基于gB蛋白的牛传染性鼻气管炎间接ELISA检测方法的建立

为建立一种针对牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotrachetitis virus,IBRV）的早期快速检测方法,并能判定免疫后是否再次发生感染,本研究利用原核表达IBRV gB蛋白,并通过SDS-PAGE和Western blot检测gB蛋白的表达,并初步建立基于gB蛋白检测IBRV的间接ELISA方法。结果表明：1）对IBRV标准阳性血清,本试验方法的最低检测限度为1∶4 096,说明建立的gB-ELISA检测方法具有较高的敏感性。2）该方法对其他4种常见的牛疫病阳性血清检测均为阴性,不存在交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。3）在对200头牛的临床样品的检测中,该方法与IDEXX(IBRV gB X3)抗体检测试剂盒符合率高达97.5%。综上,本研究建立的gB-ELISA检测方法敏感性高,特异性好,该方法为开发一种在感染早期快速对疾病进行诊断,并可以判定疫苗免疫后是否再次发生IBRV感染的试剂盒奠定基础。     

猪轮状病毒重组VP8*蛋白的原核表达及免疫原性分析

为了分析原核表达的猪轮状病毒(PRV)Gottfried株截短的VP8*(△VP8*aa 64-223)重组蛋白的免疫原性,通过构建原核表达载体p ET-28a-Gottfried-△VP8*(aa 64-223),转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达、经SDS-PAGE和Western blotting检测,并纯化后,肌肉免疫Balb/c小鼠,证明重组蛋白相对分子质量约25.0 k Da,以包涵体和可溶性两种形式存在,纯化的重组蛋白纯度在95%以上,可溶性蛋白产量可达14~15 mg·L-1。ELISA方法检测表明该重组蛋白可以诱导高滴度的特异性抗体,证明其具有良好的免疫原性,为进一步研制PRV亚单位疫苗及建立ELISA诊断方法奠定基础。     

牛坏死杆菌43K OMP多克隆抗体的制备

为了评价牛坏死杆菌外膜蛋白43K OMP的免疫原性,试验利用大肠杆菌原核表达系统对牛坏死杆菌43K OMP基因进行表达,纯化目的蛋白免疫兔,制备牛坏死杆菌43K OMP多克隆抗体,并对其进行鉴定。对基因序列进行预测分析后,针对大肠杆菌稀有密码子优化合成该基因序列,克隆至pET-32a原核表达载体上,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达及镍柱进行纯化,获得重组蛋白大小约为59 ku。重组蛋白经Western blotting鉴定后免疫兔,制备多克隆抗体。Western blot检测牛坏死杆菌43K OMP多克隆抗体与43K OMP重组蛋白具有很好的免疫原性。研究成功制备了牛坏死杆菌43K OMP多克隆抗体,为以43K OMP蛋白为基础的疫苗研究奠定基础。     

牛病毒性腹泻黏膜病毒E2基因的原核表达与免疫原性分析

[目的]原核表达牛病毒性腹泻黏膜病毒(BVDV)E2基因编码蛋白。[方法]采用PCR方法从BVDV中扩增E2基因片段,与原核表达载体pET-32a连接,构建重组表达质粒pET-32a-E2,转化E.coli(Rosetta)感受态细胞,重组菌用1 mmol/L IPTG诱导表达E2蛋白,进行SDS-PAGE电泳,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白,经Western blot分析鉴定免疫原性。[结果]重组质粒pET-32aE2经PCR及酶切鉴定证明构建正确,重组质粒能够在大肠杆菌中大量表达,表达产物的分子质量大小约为58 kDa,纯化后E2重组蛋白浓度0.521 mg/mL,Western blot分析表明,其能被BVDV阳性血清识别,具有很好的免疫原性。[结论]E2蛋白成功表达,为后续建立BVDV检测方法奠定了基础。     

鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白在大肠杆菌细胞周质中的表达

[目的]利用大肠杆菌可溶性地表达鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2蛋白。[方法]根据IBDV vp2全长序列(Gen Bank登入号AY704912),设计一对缺失VP2蛋白N-端80个氨基酸残基的特异性引物,克隆IBDV HQ株的vp2基因,插入质粒p ET-22b中构建大肠杆菌周质表达质粒p ET-22b-vp2,经IPTG诱导后表达重组蛋白。[结果]在SDS-PAGE中可见大小约为39 k Da重组蛋白。重组蛋白纯化后,Western Blot检测表明其具有良好的反应原性。[结论]在大肠杆菌细胞周质中可以高效地可溶性地表达鸡传染性法氏囊病毒IBDV VP2蛋白,并且该重组蛋白有较好的免疫原性,可以为后续亚单位疫苗及检测试剂盒开发提供所需的蛋白。     

大肠杆菌O157:H7 eaeA基因的原核表达

将含广东分离株大肠杆菌O157: H7 021210 eaeA基因的克隆质粒双酶切后,亚克隆至原核表达载体pET-28a( ),经PCR鉴定、酶切鉴定及核苷酸序列测定,正确构建了原核重组表达质粒pET-eaeA.再将该重组质粒转化E.coli BL21 (DE3) pLysS, 经IPTG诱导, 进行SDS-PAGE,结果显示,目的蛋白的相对分子质量约为94 000,与 eaeA基因蛋白的理论值相符.破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形式存在.表达蛋白经初步纯化,3次免疫新西兰兔,获得抗 eaeA蛋白的多克隆血清.经琼脂扩散试验和Western-blotting试验,表明该蛋白具有较好的免疫原性和反应原性.     

水稻L-半乳糖内酯脱氢酶基因的克隆和原核表达及抗体的制备

应用RT-PCR技术从水稻叶片中克隆了水稻L-半乳糖内酯脱氢酶(GLDH)的全长基因.序列分析表明,水稻GLDH基因全长1752bp,亚克隆其部分成熟蛋白编码基因(789bp),利用基因重组技术构建了E.coli/pET30a-GLDHe,经酶切鉴定,DNA测序,证实重组质粒构建正确;将重组质粒转化大肠杆菌Rosseta,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析证实表达出相对分子质量约为36000的蛋白.用原核表达蛋白作为抗原免疫家兔制备抗体,用Westernblot检测抗体的特异性及效价,结果表明,抗体血清效价为1∶1000,在加IPTG诱导后的菌液中可以检测到相应的蛋白条带((相对分子质量为36000)),在水稻叶片样品中能检测到1条相对分子质量为36000的蛋白条带.     

锦鲤疱疹病毒ORF30和ORF131蛋白的原核表达及纯化

重组质粒经PCR鉴定及测序,证明构建正确;表达重组ORF30蛋白相对分子质量约29 400Da,ORF131蛋白相对分子质量约55000Da,经SDS-PAGE分析,均以可溶性形式表达,表达量分别占菌体总蛋白的22.8%和33%。纯化后获得的重组蛋白ORF30和ORF131纯度均达到90%以上。已成功在大肠埃希菌中表达并纯化了重组蛋白ORF30和ORF131,为鲤鱼疱疹病毒(KHV)免疫制剂的研究奠定了基础。     

鹅坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅰ的原核表达及免疫原性鉴定

【目的】明确鹅坦布苏病毒（GTUMV）E蛋白结构域I的原核表达及免疫原性,为进一步研究GTMUV E蛋白结构的生物学特性、免疫学功能等奠定基础。【方法】通过人工合成方法获得GTMUV E蛋白结构域I的编码基因（EI基因）,并与携带GST标签的p GEX-4t-1载体连接,转入大肠杆菌后经诱导表达获得融合蛋白,并以Western blotting鉴定融合蛋白是否有免疫原性。【结果】合成获得的E1基因片段为411 bp,将其插入p GEX-4t-1载体可构建重组表达质粒p GEX-4t-1-EI。阳性重组菌经1 mmol/L IPTG诱导5 h后,融合蛋白的表达量达最高峰,且以包涵体形式存在,分子量约41.0 k Da。Western blotting鉴定结果显示,融合蛋白与GST标签抗体和E蛋白阳性血清均可发生特异性反应,检测到预期的目的条带。【结论】GTMUV E蛋白结构域I可在大肠杆菌中成功诱导表达,且获得的融合蛋白具有良好的免疫原性,可用于GTMUV血清学检测试剂盒的研发。     

塞尼卡谷病毒3ABC蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

为了开发塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus,SVV)的检测试剂盒,克隆3ABC基因进行原核表达和纯化,并将纯化的3ABC蛋白免疫大鼠,制备抗3ABC蛋白的多克隆抗体。通过Western blot鉴定制备的多克隆抗体与表达的3ABC蛋白的特异性识别能力,通过ELISA测定多克隆抗体的效价。结果显示,3ABC基因在大肠杆菌中大量表达,且主要以包涵体形式表达,重组蛋白分子质量约为55 ku,经纯化后得到单一条带。免疫大鼠制备的多克隆抗体效价大于1∶64 000,且与表达的3ABC重组蛋白发生特异性反应。综上,在大肠杆菌中成功表达了SVV 3ABC蛋白,且表达的重组蛋白具有免疫原性。     

锦鲤疱疹病毒ORF30和ORF131蛋白的原核表达及纯化

重组质粒经PCR鉴定及测序,证明构建正确;表达重组ORF30蛋白相对分子质量约29 400Da,ORF131蛋白相对分子质量约55000Da,经SDS-PAGE分析,均以可溶性形式表达,表达量分别占菌体总蛋白的22.8%和33%。纯化后获得的重组蛋白ORF30和ORF131纯度均达到90%以上。已成功在大肠埃希菌中表达并纯化了重组蛋白ORF30和ORF131,为鲤鱼疱疹病毒(KHV)免疫制剂的研究奠定了基础。     

猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ主要抗原表位区原核表达及其间接ELISA方法的建立(英文)

[目的]以原核表达的重组蛋白作为检测抗原,建立间接ELISA方法用来检测猪血清中APP抗体。[方法]将猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ主要抗原表位区基因片段克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建重组质粒pETApxⅡA1。将重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中进行表达。通过Western-blot分析重组蛋白免疫原性。用纯化的重组蛋白作为包被抗原建立检测猪APP抗体的间接ELISA方法,并优化反应条件,确定抗原的最佳包被量和血清的最佳稀释度。[结果]经PCR双酶切及测序鉴定,重组质粒构建成功,诱导表达纯化后,重组蛋白可被APP阳性血清特异性的识别,表明表达产物具有良好的免疫原性。用纯化的重组蛋白初步建立了检测APP抗体的间接ELISA方法,用该方法与商品化ApxⅣ抗体检测试剂盒分别对94份临床非免疫血清样品进行检测,结果两者的符合率为90.4%。[结论]所建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,为流行病学调查和疫苗免疫效果评估提供了技术手段。     

牛传染性鼻气管炎病毒糖蛋白gB和gD的研究进展

牛传染性鼻气管炎（Infectious bovine rhinotracheitis,IBR）是牛的重要传染病，临床以呼吸道症状为主，伴有结膜炎、乳腺炎、流产等症状。其病原是牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV），又称牛疱疹病毒1型（Bovine herpesvirus 1,BHV-1），共编码30～40种结构蛋白，其中11种为囊膜糖蛋白。糖蛋白在病毒吸附、侵入宿主细胞的过程中发挥重要作用。糖蛋白gB对病毒侵入宿主细胞、在细胞间扩散及复制至关重要；糖蛋白gD在病毒复制、传播和感染机制方面作用重大，具有良好的免疫原性，是诱导产生中和抗体的主要糖蛋白。对gB、gD的研究不仅可从蛋白层面解析病毒侵染机制，还能够为牛传染性鼻气管炎的临床诊断和预防提供理论依据。本文针对牛传染性鼻气管炎病毒的主要糖蛋白gB、gD的研究结果进行综述，分析其生物学功能以及在疫苗和诊断方面的应用，以期为牛传染性鼻气管炎侵染机制和防控提供参考。     

日本血吸虫22.6 ku膜相关蛋白基因的克隆及原核表达

为了得到重组的日本血吸虫22.6 ku膜相关蛋白,研究设计了1对引物,以日本血吸虫mRNA为模板,用RT-PCR方法克隆了576 bp的22.6 ku膜相关蛋白基因片段,测序结果表明,该片段与已公布的Sj22.6基因序列(U75510)同源性达到99%。将该基因片段插入原核表达载体pGEX-KG构建了原核表达质粒pGEX-Sj22.6,在大肠杆菌BL21 codn plus中表达获得了约48 ku的融合蛋白,经Western-blot检测,该重组蛋白具有良好的免疫原性。     

绵羊肺炎支原体多表位融合基因MO-meAg1的构建、表达及重组蛋白免疫原性分析

为获得具有良好免疫原性的绵羊肺炎支原体(MO)重组蛋白,利用ABCpred等软件预测分析MO EF-P、PDHA、P97相似蛋白和EF-Ts蛋白的优势线性抗原表位,构建多表位融合基因MO-meAg1,合成后将其亚克隆至表达载体pET-32a(+),构建原核表达载体pET-32a(+)-MO-meAg1。将pET-32a(+)-MOmeAg1转化至感受态细胞E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达后检测重组蛋白反应原性和免疫原性。SDSPAGE结果显示,MO-meAg1重组蛋白分子质量约34.5ku;Western blot分析结果显示,该重组蛋白可被MO阳性血清特异性识别,具有良好的反应原性。小鼠免疫试验结果表明,重组蛋白MO-meAg1具有较强的免疫原性,诱导机体产生的抗血清其间接血凝效价可达1∶128以上。获得的多表位融合蛋白MO-meAg1为绵羊支原体肺炎的免疫学诊断及新型疫苗研究奠定基础。     

牛白细胞介素15基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

根据GenBankTM中发表的牛IL-15基因序列设计并合成了特异性引物,以经LPS和ConA刺激的牛外周血单个核细胞提取的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出长度约500 bp的目的基因片段,并将该基因克隆到pMD18-T载体上.酶切、PCR及序列测定结果表明,获得了牛IL-15全长基因的克隆.进一步通过PCR方法得到缺失其N端48个氨基酸的信号肽序列的牛IL-15成熟蛋白基因,将其亚克隆到原核表达载体pET-32a上,构建重组表达质粒pET-IL-15,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,该菌表达以包涵体形式存在的相对分子质量约为33 000的融合蛋白.用Ni螯合层析方法纯化表达的蛋白.Western-blot试验显示表达的重组融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体发生反应,同时也能与鼠抗猪IL-15的多克隆抗体发生明显交叉反应.