DNA条形码与FTIR在石斛分析中的联用

目前市面上石斛种类混淆和以次充好现象的频发。为建立石斛快速分析鉴定体系,测试常用的植物DNA条形码能否适用于石斛鉴定,并探讨DNA条形码与FTIR联用的可行性,本研究选择常用的植物DNA条形码并结合FTIR技术对市面上常见的9种石斛进行了分析。结果表明,9种石斛的ITS2序列的种间遗传距离最小值大于种内遗传距离最大值,且平均种间遗传距离为平均种内遗传距离的58倍。ITS2序列具有作为石斛鉴定DNA条形码的潜能,且优于psb A-trn H序列的石斛鉴别能力。此外,基于FTIR还获取了9种石斛的特异性红外光谱,并基于峰形、峰高、峰强等进行了简单的组分分析,发现金钗石斛、铁皮石斛、铜皮石斛和密花石斛具有相对较高的含糖量。本研究首次将DNA条形码与FTIR技术联用,为石斛的快速分析鉴定提供了可能。     

鲤鱼品系的部分线粒体序列的遗传变异

运用PCR测序法,以9个我国常见鲤鱼（Cyprinus carpio）养殖品种和2个野生群体为研究材料,分析线粒体DNA的16S rRNA、Cyt b和D-loop序列片段,用于分析的序列共有1 457 个位点,其中变异位点32个,简约信息位点21个,共有单倍型16个。分别利用以上3个基因片段以及合并后的序列, 构建NJ和MP进化树。由不同方法获得相似的进化树,由不同基因片段得到的进化树均为两支,其中贝尔湖野鲤（BE）单独成支,其它群体聚为1支,只是由D-loop得到的进化关系更为详细,而由合并后的序列构建的进化树也与利用不同基因序列所得到的进化树并不矛盾。各品系间的分化时间约为3.03×104～1.21×105年前。根据序列的特征,16S rRNA的1个变异位点、Cyt b基因的4个变异位点和D-loop的14个变异位点可以作为鉴定不同的养殖品系和野生群体的SNP,证明mtDNA序列分析可以应用于品系的鉴定。     

结晶纤维素降解细菌的筛选、分离与鉴定

采用以结晶纤维素（Avicel）为唯一碳源的平板活性筛选法,从60份森林腐殖土、腐术样品中分离得到2株在pH5．0、37℃条件下高效降解结晶纤维素的细菌菌株GXN152和GXN153。以菌株的总DNA基因为模板,用细菌的16S rRNA基因的通用引物扩增得到菌株GXN152和GXN153的16S rRNA基因序列。测序分析表明菌株GXN152的16S rRNA基因序列和洋葱假单胞菌（Burkholderia cepacia）菌株CNR22的16S rRNA基因序列的同源性最高,具有98％的同源性,生理生化特性检测表明菌株GXN152具有洋葱假单胞菌的鉴别特征,将结晶纤维素降解菌GXN152鉴定为洋葱假单胞菌。菌株GXN153的16S rRNA基因序列和类芽孢杆菌（Paenibacillus favisporus）菌株GMP01的16S rRNA基因序列的同源性最高,具有99％的同源性,生理生化特性检测表明菌株GXN153具有类芽孢杆菌的鉴别特征,将纤维素降解菌GXN153鉴定为类芽孢杆菌。     

DNA条形码研究进展

DNA条形码是应用有足够变异的标准化短基因片段对物种进行快速、准确鉴定的新的生物身份识别系统。2003年,加拿大Guelph大学Hebert等首次正式提出了DNA条形码概念,2004年成立了生物条形码联盟,目前有来自50个国家的两百多个组织成为其成员,2007年5月加拿大Guelph大学组建了世界上第一个DNAbarcoding鉴定中心,2009年1月正式启动“国际生命条形码计划”,中国科学院代表中国与加拿大、美国和欧盟共同为iBOL4个中心节点。线粒体细胞色素C氧化酶基因COI具有引物通用性高和进化速率快等优点,是理想的动物DNA条形码,不过,COI在植物中应用效果较差,因此,核糖体ITS序列和质体rbcL、matK和trnH—psbA等序列也相继被引入植物的DNA条形码研究。虽然DNA条形码研究还处于起步阶段,面临巨大挑战,但是,越来越多的研究表明DNA条形码可以广泛应用于生物的分类和鉴定,是一种简便、高效、准确的物种鉴定技术,已经在动物、植物和微生物等研究中取得了显著成果,是生命科学领域发展最快的学科前沿之一。本文从DNA条形码的开发、应用、国内相关文献研究现状、DNA条形码面临的挑战以及发展前景等进行了综合分析,以期推动我国DNA条形码和分类学研究的发展。     

基于cpDNA条形码鉴定铁皮石斛种质资源

为选择适合鉴定铁皮石斛的条形码,以5份铁皮石斛种质资源和1份串珠石斛(外类群)为试验材料,采用cpDNA条形码技术进行分子鉴定。结果表明,5个条形码序列(matK、rbcL、trnH-psbA、petApsbJ和rpl32-trnL)种间遗传距离均远高于种内遗传距离,符合作为条形码的基本要求,其中petA-psbJ变异位点最多(8.03%),说明其进化速率亦最快,petA-psbJ可作为石斛属候选条形码之一;单个条形码鉴定率均较低(60%),核心条形码matK+rbcL鉴定率亦较低(68.75%),而在核心条形码基础上结合其它序列(≥3)却可以显著提高鉴定率(≥81.25%),matK+rbcL+petA-psbJ鉴定率达到100%,可作为铁皮石斛分子鉴定的最适条形码组合。综上,利用cpDNA条形码技术,可将不同种质资源的铁皮石斛区分开,基本上可将不同采集地的铁皮石斛聚类;同时,建议matK+rbcL+petA-psbJ作为铁皮石斛种质资源鉴定的DNA条形码。本研究结果为铁皮石斛种质资源的快速鉴定提供了一定的参考。     

武夷红樱分类地位的修订

为了重新确定武夷红樱的分类地位,以16个野生樱属种为材料,利用SSR分子标记技术进行聚类分析,结合形态观测和DNA条形码分子鉴定技术进行辅助分类学研究.为了获得3个种间的亲缘关系,利用4个叶绿体基因序列和)进行DNA条形码分析,结果表明,武夷红樱(PcW1和PcW2)与华中樱4个基因序列差异明显,小于与钟花樱之间的差异...     

一株抗真菌海洋放线菌的筛选、分离和多相分类鉴定

为开发利用宁波近海潮间带药用微生物资源,本研究自宁波慈溪海塘采集7份海泥样品,从中筛选、分离抗真菌放线菌,并对目标菌株进行多相分类鉴定,包括16S rRNA、gyrB基因序列分析、形态观察、生理生化鉴定及细胞化学组成分析。通过筛选培养获得了25个菌株,其中2P-4对白色念珠菌、黑曲霉表现出抑制生长的作用。细胞化学组成鉴定分析了2P-4全细胞糖、氨基酸、极性脂质、甲基萘醌和脂肪酸组成,结果表明,2P-4属于链霉菌属。2P-4的16S rRNA、gyrB基因序列分析也表明2P-4属于链霉菌属,并且与毒三链霉菌的关系最密切,其16S rRNA基因序列与Streptomyces toxytricini NBRC 13194^T的相似度为99.56%,gyrB基因序列与Streptomyces toxytricini NRRL B-5426^T的相似度为99.04%,但16S rRNA、gyrB基因序列在系统进化树上均形成独立分枝,支持2P-4与毒三链霉菌分属不同的种;此外,2P-4与其近缘种Streptomyces toxytricini NBRC 13194^T相比,两者在形态和生理生化特征方面存在明显差异。基于以上分析,初步鉴定2P-4为链霉菌属的一个新种。本研究为进一步探究2P-4抗真菌代谢产物提供了理论依据。     

天山云杉林下土壤放线菌的分离与DNA指纹分析方法的初步研究

新疆天山土壤放线菌的分离和鉴定工作,对全面了解该地区放线菌分布状况具有重要意义。使用7种典型的放线菌分离培养基对土样中的放线菌进行分离,共得到8个属的放线菌分离株,并对分离培养基的分离效果进行比较。使用MseI、AluI、PstI和HhaI 4种限制性内切酶对20株链霉菌分离株的16S rRNA基因进行了PCR-RFLP分析。使用BOX-PCR方法构建了9株稀有放线菌菌株的指纹图谱。PCR-RFLP和BOX-PCR聚类分析结果分别与16S rRNA基因全序列聚类分析结果具有一致性。因此,PCR-RFLP和BOX-PCR指纹分析技术可在一定程度上代替16S rRNA基因全序列分析,用于新疆天山土壤放线菌的快速鉴定和多样性研究。     

基于核糖体DNA第二内部转录间隔区(ITS2)序列鉴定四季青及其近缘种和混伪品

中药材四季青(Ilicis Chinensis Folium)的基原植物冬青(Ilex chinensis)是重要的园林观赏物种。利用DNA条形码技术可以快速、准确鉴定四季青及其近缘种和混伪品。本研究以冬青、铁冬青(Ilex rotunda)、秤星树(Ilex asprella)、枸骨(Ilex cornuta)和女贞(Ligustrum lucium)等37份植物样本为实验材料,提取全基因组DNA,扩增核糖体DNA第二内部转录间隔区(internal transcribed spacer 2,ITS2)序列并进行双向测序。测序结果利用Codon Code Aligner 4.2.7进行序列拼接,获得高质量ITS2序列。同时从Gen Bank中获得28条冬青的同属近缘种以及混伪品女贞、四川山矾(Symplocos setchuensis)的ITS2序列。基于隐马尔科夫模型(hidden Markov model,HMM)注释5.8S和28S,获得完整的ITS2区域,进而应用MEGA6.0(molecular evolutionary genetics analysis)进行冬青种间和种内序列分析,计算种内种间K2P(Kimura 2-parameter)遗传距离,构建邻接树(neighbor-joining tree,NJ tree)。结果表明,琼脂糖凝胶电泳得到清晰明亮的均一条带,说明利用通用的ITS2引物可以成功扩增到用于测序的PCR产物。通过PCR产物测序、数据处理和序列分析可知,冬青种内ITS2长度经过比对后为239 bp,全部样品的种间ITS2比对后长度为269 bp。冬青种内有4个变异位点以及6个单倍型,种间有143个变异位点,远远多于其种内变异位点。MEGA6.0分析结果表明,种间最小K2P遗传距离(0.094)大于种内最大K2P遗传距离(0.013)。邻接树显示,女贞和四川山矾分别以100%的自展支持率分别聚类,表现出良好的单系性,冬青属物种聚为一大支。冬青在冬青属下可以单独聚为一支,可以进行区分。冬青属其他物种以同一亚属聚为一支。研究结果表明,作为一种快速、准确、简便的分子生物学鉴定方法,ITS2可以应用于冬青及其近缘种和混伪品的鉴定,同时对于准确鉴定冬青属物种亦有巨大潜力,可为冬青属植物在临床上的用药安全和开发应用提供科学依据。     

西藏牦牛mtDNA 16S rRNA基因的克隆及其遗传多样性分析

本研究首次通过克隆、测序获得了11个西藏牦牛类群共111头个体的mtDNA 16S rRNA基因全序列,并分析了西藏牦牛的遗传多样性、分类关系、起源和分化,为进一步保护和合理利用西藏牦牛遗传资源以及探讨牦牛类群的划分提供分子依据。结果表明：西藏牦牛16S rRNA基因全序列长度为1571 bp或1570 bp（LWQ4）;G＋C平均含量37.8%,具有明显的碱基偏倚性;平均核苷酸多样性（Pi）为0.00291,平均单倍型多样性（Hd）为0.8501±0.0009,111个样本共发现48种单倍型并聚为2簇,表明西藏牦牛具有较高的遗传多样性并存在2个母系起源;Kimura双参数遗传距离范围为0.00098-0.00694,11个西藏牦牛类群划分为2大类：嘉黎牦牛、巴青牦牛、丁青牦牛、工布江达牦牛、帕里牦牛、斯布牦牛、康布牦牛、桑桑牦牛、江达牦牛、桑日牦牛为一类,类乌齐牦牛单独为一类。本研究发现类乌齐牦牛具有较丰富的遗传多样性,并且发现了一个序列特异个体LWQ4,需要对其进行更深入的研究。牛种间的聚类结果显示,西藏牦牛与美洲野牛的亲缘关系最近,与普通牛、水牛的亲缘关系相对较远,本研究支持将牦牛从牛属（Bos taurus）中分离出来,作为一个独立的牦牛属（Poephagus）的观点。     

黄颡鱼微卫星标记筛选及特征分析

通过磁珠富集法首次筛选黄颡鱼微卫星标记并对其特征进行分析。用生物素标记的寡核苷酸探针(AC)8、(CT)8、(AT)7、(GATA)8、(GATT)7进行微卫星片断的富集,挑选部分阳性克隆测序获得38个含有微卫星的DNA序列,总计设计并合成了22对微卫星引物。以普通黄颡鱼基因组DNA为模板,进行PCR扩增,结果筛选出18个多态性微卫星标记,每对引物等位基因数2-8个（平均3.78）,遗传杂合度0.2225-0.8101（平均0.5755）,多态信息含量0.3425-0.7900（平均0.5336）。此外18对多态性微卫星引物中有16对在黄颡鱼属其它4种鱼类具有通用性,13对在鲇形目中的3种鱼类具有通用性。因此,可以推断筛选的多态性微卫星标记可用于黄颡鱼属和鲇形目鱼类的遗传分析。     

一种快速鉴定半滑舌鳎遗传性别的方法

半滑舌鳎(Cynoglossus semiliaevis)遗传性别快速准确鉴定的方法是性别控制与高雌苗种培育的基础,其性别决定机制为ZW型,遗传雌鱼为异型染色体ZW,遗传雄鱼为同型染色体ZZ.本研究在半滑舌鳎全基因组测序结果的基础上,通过分析Z染色体和W染色体差异序列,设计一对跨Z/W染色体同源差异DNA片段的引物CS-SEX-F和CS-SEX-R,取半滑舌鳎部分鳍条通过碱煮沸方法获得的DNA为模板,采用PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳方法鉴定半滑舌鳎遗传性别.通过该方法在遗传雄鱼(ZZ)个体中可以扩增出366 bp的DNA条带,遗传雌鱼(ZW)个体中可以扩增出366和253 bp两种DNA条带.本研究建立了一种新的成本低廉、操作快速、结果准确可靠的鉴定半滑舌鳎遗传性别的方法,该方法与已有方法相比,操作简便省时,为半滑舌鳎遗传学研究与性别控制育种相关研究提供了可靠分子标记,在半滑舌鳎遗传性别鉴定和养殖场所内伪雄鱼快速检测方面具有广阔的应用前景.     

中国家鸭的分子遗传多样性及其起源探讨

本研究测定了我国重点保护的8个家鸭品种及斑嘴野鸭的线粒体DNA D-loop区667bp序列,分析了这8种家鸭的遗传多态性和起源。遗传多态性分析结果显示A、G、C、T碱基平均含量分别为25.5%,15.3%,33.4%,25.8%;变异类型为转换和颠换,未发现缺失与插入。确定了20种单倍型,Hap2（A7）为家鸭的主体单倍型型,平均单倍型多样度为0.67136,平均核苷酸多样度为0.00192,攸县麻鸭单倍型多样度、核苷酸多样度最高,8个品种之间双参数遗传距离为0.00056-0.00414,其中连城白鸭和攸县麻鸭之间遗传距离最大。38种单倍型系统发生研究表明,8种家鸭都单一地起源于绿头鸭。     

一株动性球菌对苜蓿的促生和缓解 NaHCO3胁迫作用

为改良和利用盐碱地,以大庆草原盐碱土为材料,筛选耐盐碱细菌,对筛选纯化后的细菌用 16S rRNA基因序列对其进行分子生物学鉴定,并对其能力进行分析;设置 2种处理(CK1:无菌蒸馏水;S1:菌液),对苜蓿种子进行发芽实验,比较不同处理下种子的发芽率、苗长和鲜重;同样,设置 2种处理(CK2:无菌蒸馏水;S2:菌液),采用蛭石浇灌营养液的培养方式进行试验,分析不同处理下的 NaHCO 3胁迫苜蓿生长特性及其抗氧化活性变化。结果表明,实验共分离获得 43株菌,其中,一株编号为 38的菌株(S38),基于 16S rRNA基因序列鉴定发现,该菌为动性球菌( Planococcus)属的菌株,具有固氮和产 ACC脱氨酶的能力;S1相比 CK1处理,显著提高了苜蓿种子的萌发率、苗长和鲜重;S2相比 CK2处理,地上部和地下部生物量分别提高 32%和 50%,Chla、Chlb和 Chla+Chlb含量分别增加了1.33、1.15和 1.28倍,而可溶性糖含量、抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性均有所降低,同时也影响了 K +吸收和分布。由此可见,S38对苜蓿种子有促生的作用,可影响 NaCO 3胁迫下苜蓿幼苗生长形态、根形态建成、光合作用等,降低苜蓿对盐的吸收,从而促进幼苗生长。综上,S38在缓解 NaHCO 3对植物的伤害方面有着重要的作用。     

三叶青突变体的理化成分评价与分子鉴定

为探究三叶青品种泽青1号是否产生药理成分突变,对26份三叶青样本的可溶性多糖、总酮、总皂苷、总酚、蛋白质、矿物质及游离氨基酸进行了理化评价与相关性分析,并检测了其ITS序列的位点突变情况。结果筛选出103、107、109、112、113、125、126、127、130、131、132等优异突变体。泽青1号突变体类群与其23个近缘崖爬藤属种间同源性为49%、平均遗传距离为0.54、组间距离为0.993;泽青1号突变体间同源性为93%~99%、配对距离为0.006 40~0.116 96、组内距离为0.060 70,成功构建了基于ITS种属鉴定的突变体DNA条形码。本研究初步筛选出11个具有多元化定向育种应用价值的突变体,为解决三叶青种质资源稀缺、退化的问题提供了材料基础;同时基于ITS分子标记成功鉴定并区分泽青1号突变体类群与其他近缘崖爬藤属物种,筛选出突变类群的突变位点,为三叶青突变体种质资源评价提供了技术支撑。     

多位点基因打靶技术的鳜鱼体内实验研究

在转基因动物的研究中,一般采用随机插入的方法。基因在受体动物的基因组中随机整合,严重制约了转基因动物外源基因的稳定遗传,是转基因动物研究亟待解决的问题。转基因定点整合技术,即基因打靶技术是解决上述问题的重要途径,但是基因打靶存在打靶效率太低的问题。本研究小组已建立了体外动物细胞的多位点基因打靶技术,并构建了用于鳜鱼的体内多位点基因打靶的打靶载体,本文开展多位点基因打靶技术的鳜鱼体内实验研究。以鳜鱼rDNA基因(编码rRNA的基因)及其间隔序列作为同源重组引导序列,构建含干扰素基因的打靶载体,以其间隔序列为靶位点,针对鱼类胚胎发育特点,采用精子介导技术进行多位点基因打靶,最终获得定点整合干扰素基因的鳜鱼,并建立一套适用于动物的基因定点敲入的体内基因打靶技术。主要研究内容如下:(1)采用组织培养方法,获得鳜鱼头肾淋巴细胞和脾淋巴细胞,采用脂质体介导法使多位点基因打靶载体在鳜鱼的细胞上实行基因转移。采用正负筛选方法,利用筛选药物G418和GCV(更昔洛韦)筛选转染后的细胞两周后,对存活细胞进行DNA水平和RNA水平鉴定。结果证明了干扰素基因在鳜鱼细胞上实现了定点整合和稳定表达。(2)利用精子介导法将经线性化处理后的多位点基因打靶载体在鳜鱼的胚胎上实行基因转移。(3)根据靶位点定点整合的正负筛选原理,利用筛选药物G418和GCV筛选与富集定点整合后的阳性鱼胚或鱼苗,结果成功孵化出106尾转基因鳜鱼鱼苗。(4)培育6个月后,取20尾转基因鳜鱼进行鉴定。采用PCR、RT-PCR、测序等方法进行定点整合的鉴定。结果表明:6尾检测到已转入的基因——干扰素基因,其中有3尾实现了定点整合并表达。本研究率先将多位点基因打靶技术应用到转基因鱼的研究中,建立一套适用于鱼类的高效、安全的多位点基因打靶技术,并获得外源基因定点整合并表达的鳜鱼。     

基于ISSR指纹的甘薯食用品种的遗传多样性分析

运用ISSR分子指纹技术检测甘薯基因组DNA的多态性,是鉴定甘薯遗传多样性和亲缘关系有效的方法之一。本研究选用6个ISSR标记对17份甘薯品种进行了DNA指纹扩增,共扩增出55条谱带,其中多态性谱带50条,多态性水平为90.91%;UBC825引物扩增出带型最多,有16种;根据Nei’s遗传距离计算获得的聚类树状图表明,在GS为0.625时,参试的17份甘薯品种分为4个组群;遗传相似性分析表明,顶芽菜用品种间遗传相似系数最高0.877,叶柄食用品种和烤薯型品种之内的遗传相似系数分别为0.778和0.740。结果表明甘薯主要食用间具有较好的遗传多样性,但同类型品种间却又有较高的遗传相似性,这类品种需要引进或创制新资源。     

红三叶根际促生菌中具生防效果菌株筛选、鉴定及特性研究

【目的】 从岷山红三叶根际分离的109株促生菌,鉴定、筛选了具有生防能力的菌种资源并研究其生防特性,为生产应用提供服务。 【方法】 采用平板对峙法筛选优良生防菌株,对其产铁载体能力进行定性、定量测定和16S rRNA基因序列分析鉴定。 【结果】 平板对峙试验显示,109株促生菌中有8株促生菌对3种病原真菌 (立枯丝核菌、黄瓜枯萎菌、西瓜尖镰孢菌) 具有拮抗效果,分别是菌株MHS3、MHS7、MHS9、MHS27、MHS31、MHS38、MHS39和MHS48。其中,菌株MHS27、MHS31发酵液对立枯丝核菌抑菌率分别为40.1%、47.1%;菌株MHS7和MHS48发酵液对黄瓜枯萎菌抑菌率分别为26.1%、22.8%;菌株MHS27和MHS31发酵液对西瓜尖镰孢菌抑制率分别为34.0%、30.5%;产嗜铁素是生防菌 (MHS7、MHS27、MHS31、MHS48) 拮抗3种病原真菌的主要途径之一。经16S rRNA基因序列分析初步鉴定,菌株MHS7为特基拉芽孢杆菌 (Bacillus tequilensis),菌株MHS27为溶蛋白芽孢杆菌 (Bacillus proteolyticus),菌株MHS31为Pseudomonas paralactis,菌株MHS48为克雷伯氏菌 (Klebsiella oxytoca)。 【结论】 从岷山红三叶根际分离筛选出4株具有优良生防作用的PGPR菌株,为今后生物菌肥应用推广提供了菌种资源支持。      

不同基因型刺梨及其近缘种亲缘关系的RAPD分析*

采用RAPD标记，对刺梨(Rosa roxburghii Tratt)7个基因型及8个近缘种(类型)进行鉴定和亲缘关系分析。结果表明，筛选出的16个随机引物可扩增出137条480bp到3.3kb大小的清晰。DNA片段，其中95条为多态性片段，为总数的69．3％；每个引物平均产生8．6条。由OPB-11、OPAF-16和OPW-02扩增的14条特异DNA片段，可有效地将普通刺梨7个基因型和无籽刺梨区分开来。基于遗传距离矩阵，采用IJPGMA法对15个供试样品的亲缘关系进行了聚类分析，文中还就无籽刺梨及重瓣刺梨的可能来源进行了探讨。     

一株拮抗放线菌的鉴定及其对黄瓜枯萎病的生防效应研究

鉴定从土壤中分离的一株拮抗放线菌(编号CT205),探索其防治植物病害的潜能.通过形态特征、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析研究菌株CT205的分类地位,采用平板对峙法测定其抗菌活性,利用连作致病土盆栽试验评价其对黄瓜枯萎病的防治作用.初步鉴定菌株CT205为白刺链霉菌(Streptomyces albospinus),菌株CT205对供试的枯草杆菌、啤酒酵母、小麦纹枯、土豆青枯等植物病原菌均有不同程度的抑制作用,其中对黄瓜枯萎病、西瓜枯萎病、烟草疫霉3种供试病原真菌的抑制作用较强.盆栽试验表明,施用放线菌CT205对黄瓜生长有一定的促生作用,对黄瓜枯萎病防治效果为51.85％,放线菌CT205菌液和有机肥复合制作成生物有机肥,防治效果达81.85％.研究表明,放线菌CT205具有潜在的应用价值.