海岛棉纤维均一化酵母双杂交文库的构建与GbTCP5互作蛋白的筛选

为探究转录因子在海岛棉纤维中的生物学功能,以海岛棉8个时期的纤维为研究对象,利用SMART技术合成ds-cDNA,经DSN进行均一化处理,构建以pGADT7为载体的海岛棉纤维均一化酵母cDNA文库,利用酵母双杂交系统筛选与海岛棉GbTCP5互作的蛋白。根据克隆得到的GbTCP5基因的CDS区设计含有NcoⅠ、EcoRI酶切位点的引物,构建诱饵载体pGBKT7- GbTCP5。经自激活和毒性检测后共转化酵母菌株Y2HGold,筛选与GbTCP5互作的蛋白。实时荧光定量PCR显示,GbTCP5基因在纤维发育起始期和伸长期的表达量较高,且在花瓣和花萼中的表达量高于其他组织。文库的质量检测显示,构建的均一化cDNA文库库容为9.15×10⁷ cfu·mL^-1,重组率为100%,插入片段大小在500~2 000 bp之间。诱饵载体pGBKT7-GbTCP5通过酵母双杂交系统多次筛选、回转验证,最终确定了4个互作的蛋白,分别是GbTCP20、GbTCP42、GbTCP45和GbAHP1蛋白。海岛棉纤维均一化cDNA文库的构建和筛选,为进一步研究海岛棉TCP转录因子及其互作蛋白在纤维发育时期中的作用机制奠定了基础。     

外源NO对棉胚珠离体培养色素积累和纤维发育的影响

为探究外源NO对棉花色素合成和纤维发育的影响,以棕色棉和白色棉花后2 d的胚珠为材料,利用NO供体硝普钠(SNP)处理棉纤维,测定纤维发育中的相关生理生化指标及与色素合成相关基因的表达量。结果表明,100μmol·L-1SNP处理促进了棕色棉胚珠鲜质量的增加和白色棉纤维的伸长;DMACA染色显示,原花青素(PAs)分布在棕色棉胚珠种皮和纤维中,而白色棉则仅在种皮中存在;外源NO促进了白色棉和棕色棉胚珠纤维中总黄酮和PAs的合成,但抑制了棕色棉纤维素的合成;色素合成关键酶基因(Gh CHS、Gh F3H、Gh DFR、Gh ANS、Gh ANR)在离体过程中整体呈下降趋势,但SNP处理上调了棕色棉中各基因的表达;外源NO促进了棕色棉胚珠纤维中Gh TT12的表达;外源NO在纤维发育早期(10 DAC、15 DAC)抑制了棕色棉胚珠纤维中Gh Exp1的表达,促进了白色棉胚珠纤维中Gh Exp1的表达。本研究结果为进一步揭示外源NO对棉花色素合成和纤维发育提供了参考。     

亚洲棉中与棕色素合成相关基因GaTT12a的克隆及表达特征

棕色棉具有典型的自然棕色纤维,在纺织及加工过程中无需漂染,是真正的“生态”、“环保”棉.克隆并了解棉花纤维棕色素合成相关基因对于揭示棉花纤维色素发育的分子机理具有重要的意义.本研究选取亚洲棉(Gossypium arboreum)棕色纤维慈溪紫棉和白棉余姚中棉纤维发育不同阶段RNA,采用Gene Fishing技术,获得1条仅在亚洲棉棕色棉纤维中特异表达的约500bp的PCR扩增产物,根据测序结果和生物信息学分析发现,该基因在核苷酸序列上与拟南芥(Arab idopsis thaliana)种皮棕色素合成TT12基因存在76％的序列同源性.随后利用RT-PCR的方法克隆了该基因,命名为GaTT12a(GenBank登录号:JX013908),该基因编码490个氨基酸残基,分子量约52.7 kD,属于MATE超基因家族中的一个成员.利用荧光定量PCR分析了GaTT12a基因在发育不同阶段纤维、种皮的表达特征,结果表明,GaTT12a基因在棕色纤维、白色棉种皮和棕色棉种皮中均优势表达,在白色棉纤维中几乎不表达,说明该基因参与纤维棕色素的形成,结果暗示棉花种皮棕色素和纤维棕色素可能分享相似的合成代谢途径.研究结果为进一步了解GaTT12a基因参与棕色棉纤维色素形成、棕色棉纤维色素与种皮棕色素合成之间的关系提供了基础研究资料.     

海岛棉 GbRac1基因过量表达提高转基因烟草离体叶片对赤星病的抗性

利用简并引物PCR和3’RACE，克隆了海岛棉(Gossypium barbadense)GbRac1的编码基因。Northern—blot分析表明，海岛棉GbRac1基因在转录水平上受棉花黄萎病菌(Verticillium dehliae)的诱导，诱导后mRNA表达量显著增加。构建组成型植物表达载体pRac，转化烟草(Nicotiana tabacum)品种NC89，离体叶片抗病性鉴定表明，转GbRac1基因烟草对烟草赤星病(Altemaria altemata)的抗性明显提高。这暗示GbRac1在植物抗病基因工程中具有潜在的应用价值。     

海岛棉GbXET基因的克隆及过量表达对酵母细胞伸长的影响

XET是一类重要且与细胞的伸长密切相关的细胞壁松弛酶。鉴于海岛棉纤维品质较优，以海岛棉（Gossypium barbadense）7124为材料，利用PCR和RACE技术得到了海岛棉XET的全长基因GbXET。氨基酸同源性比较表明，GbXET与已报道的其它植物的XET蛋白有较高的同源性，且含有XET的活性催化位点EIDFE。利用裂殖酵母系统对该基因的功能进行了活体研究，GbXET在裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）qh的过量表达促使细胞伸长约1倍，且细胞为单核，暗示GbX-ET对细胞伸长的促进作用是由于细胞壁的松弛而引起的。     

棉花水通道蛋白基因(GhAQP2)的表达特征及功能初步分析

水通道蛋白(aquaporin,AQP)是位于生物膜上的一类古老的通道蛋白,能够高效地运输水分,在整个植物生长发育过程中发挥重要作用。本研究从棉(Gossypium hirsutum)纤维细胞中分离出1个编码水通道蛋白的基因,该基因序列中有3个内含子和4个外显子,开放阅读框为837 bp,编码一个含278个氨基酸残基的多肽。序列比对和进化分析表明该基因与烟草NtPIP2;1同源性最高(86%),属于PIP2水通道蛋白,将该蛋白编码的基因命名为GhAQP2(GenBank登录号:KJ920936)。利用半定量RT-PCR对GhAQP2基因在棉花不同器官和不同发育阶段纤维中的表达模式进行分析,发现该基因在纤维细胞中优势表达,其表达量在开花后随着纤维的发育逐渐升高,在开花后6~18 d的纤维细胞中持续高表达,然后下降。将GhAQP2基因转化BY-2烟草(Nicotiana tobacum)悬浮细胞对其功能进行初步分析,发现该基因在BY-2细胞中过量表达使细胞形态发生显著变化,由圆球状变为长条状,且细胞由聚集变为松散状态。这些结果提示GhAQP2可能在棉花纤维伸长过程中起重要作用。     

不同量化RT-PCR的方法在棉花纤维GhCAD基因表达中的研究

以陆地棉（Gossypium hirsutum L.）高代品系CJ01在开花后5、10、15、20、25d（DPA）共5个不同发育时期的棉花纤维为材料,分别利用常规半定量RT-PCR法、QuantumRNA™18S内标相对定量法以及实时荧光定量 RT-PCR法,对棉花肉桂醇脱氢酶（GhCAD）基因在棉花纤维不同发育时期中的表达进行相对定量分析,并测定了内标表达的稳定性。结果表明3种方法获得相似的结果,GhCAD基因在5～15DPA时表达量较低,20、25 DPA时表达量升高。3种方法虽各有利弊,但均为研究基因量化表达的有力工具。     

巴西橡胶树HbNAC33基因的克隆和表达分析

植物特有的NAC转录因子在植物的生长发育、胁迫应答和激素调节等方面具有重要功能。本研究从橡胶树胶乳cDNA中克隆了HbNAC33基因,生物信息学分析显示该基因的完整开放阅读框（ORF）为1 092 bp,编码363个氨基酸。HbNAC33蛋白的N-端第3～156位氨基酸之间含有一个典型的NAC结构域,酵母试验表明,HbNAC33具有转录激活活性,转录激活区在C-端,具备了NAC转录因子的基本特征。序列比对和系统进化分析表明HbNAC33蛋白属于NAC转录因子家族中的ANAC011亚族。实时荧光定量PCR分析表明,HbNAC33在叶中的表达量显著高于其他部位;割胶,乙烯利（ET）和茉莉酸（JA）处理均能诱导HbNAC33的表达上调。以上结果表明,HbNAC33可能参与植物的生长发育和胁迫应答过程。     

玉米NAC转录因子基因ZmNAM的克隆及表达分析

为探究候选基因ZmNAM的功能,本研究从甜玉米自交系1132及其变异系704中克隆得到该基因。生物信息学分析表明,ZmNAM的c DNA长度为1 548 bp,开放阅读框(ORF)为1 302 bp,编码一个由433个氨基酸残基组成的蛋白,蛋白具有亲水性,N-末端具有保守的NAC结构域,定位于细胞核中,具有9个糖基化位点和35个磷酸化位点;与自交系1132相比,变异系在非编码区与编码区中的C-末端转录激活功能域对应核苷酸序列中存在差异,可导致多个氨基酸发生变异。系统进化分析结果表明,玉米ZmNAM蛋白属于NAC转录因子家族中的VND亚族,与拟南芥中的At VND3亲缘关系最近;时空特异性表达分析表明,不同发育时期内ZmNAM在根中的表达量明显高于其他器官,说明ZmNAM基因可能在调控玉米根部的生长发育过程中发挥着重要作用。变异系704中ZmNAM在各个发育时期和发育器官中表达水平基本都明显高于自交系1132,其中在根中的表达水平差异最明显。本研究结果为深入研究ZmNAM基因在玉米生长发育过程中的作用提供了理论支持。     

棉花甲基化酶基因COMT和CCoAOMT的组织特异性表达分析

本研究利用半定量RT-PCR分析方法探索了陆地棉(Gossypium hirsutum L.)木质素合成途径中甲基化酶基因家族COMT和CCoAOMT在不同组织和不同发育时期纤维中的表达情况。结果表明COMT1,COMT2,COMT3和CCoAOMT1,CCoAOMT2在棉花的7个组织器官(根、茎、叶、子叶、花瓣、雄蕊、胚珠)中都有表达,其中COMT1和CCoAOMT1在各组织中的表达趋势类似,COMT2,COMT3和CCoAOMT2表达趋势各异。在5～25d的棉纤维发育过程中,COMT1和COMT3表达稳定,COMT2表达量逐渐增加。而CCoAOMT基因家族的2个基因的表达量变化相对明显,CCoAOMT1在25d出现表达高峰,CCoAOMT2则在10d和15d呈现高表达量。本研究表明甲基化酶基因家族COMT和CCoAOMT在棉花的根,茎等维管组织中具有相对一致的高表达量,而在其他组织和发育纤维中则呈现出明显的组织特异性和纤维发育时期特异性。     

不同海岛棉品种土壤水分动态变化研究

通过对5个海岛棉品种土壤水分动态变化分析研究,结果表明,不同海岛棉品种各生育期土壤含水量、土壤蓄水量以及水分利用效率存在差异。含水量最高的土层是80~100 cm,最低的是0~20 cm。这种规律性变化与棉花根系的发育特点、吸收特点有关。新海21是节水型品种,能够较充分的利用有限的灌溉水,在干旱半干旱地区具有强大的优势。     

应用Solexa测序技术分析棉花不同抗病品种的数字表达谱

棉花枯萎病是一种危害严重的世界性病害,构建棉花枯萎病不同抗病品种的基因表达谱将为进一步研究棉花抗枯萎病的分子调控机制及筛选抗枯萎病相关基因奠定基础.本研究选用高抗枯萎病的陆地棉品种中棉所12和高感枯萎病的陆地棉品种新陆早7号为材料,利用Solexa高通量测序技术分析棉花幼苗根部组织中的基因表达情况.Solexa高通量测序后构建了多达350万个reads的标签文库,根据已知序列信息,显著差异表达基因1 080个,其中上调基因302个,下调基因778个.基因功能分析表明,已注释的显著差异表达基因可划分为分子功能、生物过程和细胞组件3个功能注释本体,并进一步细分为37个功能类别.鉴定出112条代谢通路,注释了1 238个显著差异表达基因,共涉及氨基酸代谢、多糖的生物合成和代谢、脂类代谢、能量代谢及信号转导等方面.在植物激素信号转导通路分析中,涉及到26个已知功能基因,4个基因编码AP2/ERF转录因子,4个基因与LRR类受体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶或蛋白激酶有关,5个基因与蛋白磷酸酶2C有关,而这些基因都参与植物的抗病反应.随机抽取5个基因进行实时荧光定量PCR验证,其结果与测序结果一致.本研究初步揭示了棉花枯萎病抗感品种在转录组水平上的表达差异,获得了大量差异表达基因.     

花生果种皮发育相关特异基因的克隆和表达分析

本实验从花生果皮种仁抑制消减文库中筛选出了一个255bp的EST序列并进行了研究。构建了花生果种皮全长cDNA库并从中筛选出该基因的全长,命名为AhPSG8。此基因全长1118bp,开放阅读框第33～833个碱基,编码266个氨基酸残基组成的多肽。由生物信息学分析表明该基因编码多个活性位点蛋白,可能与细胞内DNA的转录有关;结构分析揭示出AhPSG8具有一个跨膜区,N端是一个由20个氨基酸组成的信号肽;该基因与已发表的基因序列没有明显的同源性,为一新基因;RT—PCR研究该基因在花生中的表达,结果显示该基因在果种皮中特异表达,10～40d果皮中丰富表达,推测为与花生果种皮发育相关基因。     

棕色棉GhANS基因的克隆与表达分析

本研究以15DPA棕色棉及其白色近等基因系为材料,蛋白质双向凝胶电泳结合质谱分析,鉴定出其中一个差异表达的蛋白为花色素合成酶(ANS)。以15DPA棕色棉纤维细胞cDNA为模板,电子克隆获得了编码该蛋白基因的全长cDNA序列,序列分析发现,该基因的开放阅读框为1062 bp,编码354个氨基酸,属于花色素还原酶2-酮戊二酸加氧酶亚家族,将该基因命名为GhANS。构建GhANS基因GFP融合植物表达载体转化烟草,荧光共聚焦显微镜观察发现GhANS基因定位于烟草细胞质内。实时荧光定量PCR分析表明,GhANS基因在棉花中组成型表达,该基因在纤维细胞发育的各个时期在棕色棉中表达量均高于其白色近等基因系,推测GhANS基因在棕色棉纤维色素合成过程中起重要作用。     

我国转Bt抗虫基因棉杀虫活性的时间与空间动态分析

利用我国研制的转Ｂｔ抗虫基因棉ＧＫ－１２品系,系统测定了对棉铃虫杀虫活性的时间与空间动态。结果表明,转Ｂｔ抗虫基因棉相同部位叶片的杀虫活性随着棉花的生育期呈下降的趋势,并在盛花期之后显著降低;各花器的杀虫活性在田间棉铃虫第三代期明显高于第四代期;在模拟棉铃虫田间自然取食的条件下,第四代期的幼虫世代存活率明显高于二代期,有０．４％的幼虫可以发育至蛹期。转Ｂｔ抗虫基因棉不同器官杀虫活性的顺序为：叶〉蕾     

棉花GhMYB146基因克隆及亚细胞定位分析

MYB转录因子是发育、代谢、生物和非生物胁迫应答调控网络中的关键因子。为了分析棉花Gh MYB146转录因子的亚细胞定位,通过RT-PCR和RACE方法从棉花纤维中克隆了1个棉花MYB转录因子Gh MYB146的c DNA序列,采用生物信息学方法分析了Gh MYB146的氨基酸序列,构建了Gh MYB146基因的亚细胞定位载体并进行了亚细胞定位分析。结果表明,克隆的R2R3-MYB基因Gh MYB146的c DNA全长1 027 bp,开放阅读框长879 bp,编码292个氨基酸,蛋白质预测分子量约为33.151 k D,等电点为7.9;推测的氨基酸序列中含有2个高度保守的SANT结构域;Gh MYB146基因组包含3个外显子和2个内含子。进化树分析表明,Gh MYB146和Gh MYB5分为一个分支;亚细胞定位结果表明,Gh MYB146:GFP融合蛋白定位于细胞核中。本试验结果为进一步研究Gh MYB146基因的生物学功能奠定了基础。     

棉花莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶基因(GhHCT)的克隆、生物信息学分析及表达特性

莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶(shikimate/quinate hydroxycinnamoyl transferase,HCT)是木质素生物合成途径中影响木质素G/S-单体生物合成的关键酶之一,棉纤维中木质素含量与纤维品质密切相关。本研究以开花后16 d(16 DPA)的棕色棉(Gossypium hirsutum L.)品种新彩棉6号纤维为材料,克隆了1个木质素代谢相关HCT类似基因,命名为GhHCT(GenBank登录号:KF749428)。并通过实时荧光定量PCR技术检测了该基因在棉花不同器官及组织中的相对表达量。序列分析结果表明,该基因的开放读框(open reading frame,ORF)为1 500 bp,编码499个氨基酸。生物信息学分析显示,推定的GhHCT蛋白质相对分子质量为55.2 kD,等电点为5.69。该蛋白氨基酸序列同其他物种HCT蛋白显示出很高同源性(82%～95%)。GhHCT氨基酸序列包含一个HHAAD酰基转移酶功能结构域以及一个BAHD酰基转移酶基因家族的DFGWG区。系统进化树分析显示,GhHCT与槿麻(Hibiscus cannabinus)HcHCT基因有最近的亲缘关系(94.9%)。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测结果显示,GhHCT在新彩棉6号不同组织中都有表达,但在16 DPA的胚珠中表达最高,其次在花和茎中也有较高表达,在叶片中的表达量最低。本研究为进一步研究GhHCT基因的生物学功能及棉纤维中木质素生物合成代谢的作用机制研究提供前期基础资料,同时也为利用基因工程技术对天然彩色棉纤维品质进行遗传改良提供一定的线索及理论依据。     

棉花转录因子基因(GhMYB11)的克隆与表达分析

MYB基因家族在植物应对外界生物和非生物胁迫的过程中有重要的调控作用.本研究利用二倍体雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)基因组数据库,从陆地棉(G.hirsutum)品种鲁棉研32号中克隆到一个新的MYB转录因子GhMYB111(GenBank登录号:HQ234875.1),Cdna全长1 001 bp,开放阅读框828bp.通过与模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)和主要作物小麦(Triticum aestivum L.)、玉米(Zea mays L.)、水稻(Oryza sativa L.) MYB蛋白的氨基酸序列比对发现,GhMYB 11蛋白与拟南芥中脱落酸(abscisic acid,ABA)合成和信号传导的重要基因AtMYB13/14编码的蛋白高度相似(E值分别为7e-83和1e-90),含两个高度保守的MYB结构域R2R3及一个转录激活结构域.实时定量PCR分析发现,GhMYB 11基因在黄萎病菌(Verticillium dahliae)侵染、干旱、盐和氧化胁迫处理后的棉花幼苗叶片中表达显著上调.GhMYB11基因可能在棉花生物和非生物胁迫反应中起重要调控作用,是陆地棉品种抗逆性遗传改良的重要候选基因.本研究为利用基因工程手段提高棉花抗逆性提供了基础材料     

陆地棉小GTP结合蛋白基因GhROP6的克隆及表达初步分析

为探究ROP基因在棉花抵御逆境胁迫中的生物学功能,利用同源克隆的方法获得一个陆地棉GhROP6基因,通过生物信息学方法分析其理化性质、结构及进化关系,利用实时荧光定量PCR(qRTPCR)技术探究GhROP6基因的组织表达特异性及不同逆境胁迫和外源激素处理下的表达模式,构建GhROP6基因的VIGS载体并转化棉花,利用qRT-PCR技术检测其沉默效率。结果显示,GhROP6基因开放阅读框（ORF）为597 bp,编码一个含198个氨基酸的I类ROP蛋白;多重序列比对结果显示,GhROP6符合ROP蛋白结构特征,且与其他物种ROP蛋白高度同源;进化树分析结果显示GhROP6蛋白与拟南芥AtROP6蛋白同源性最高;GhROP6基因在棉花根、茎、真叶及子叶中均有表达,且在真叶中表达量最高;GhROP6基因对干旱、高盐、低温、高温等胁迫和外源脱落酸（ABA）、生长素（IAA）处理均有不同程度的响应,可能在棉花抗逆反应中扮演着重要角色。GhROP6在棉花的叶片和根部均得到有效沉默,表明已获得GhROP6基因沉默植株。本研究为进一步了解GhROP6基因的分子生物学功能奠定了基础。