人巨细胞病毒ppl50抗原区基因片段的克隆与表达

为了研制人巨细胞病毒(HCMV)核酸疫苗，根据HCMV基质磷蛋白pp150基因序列设计引物，利用高保真PCR从HCMV AD169株基因组DNA中扩增出编码pp150抗原决定簇区域的基因片段。序列分析结果显示其与发表的该段序列同源性为100％。将此基因片段克隆进原核表达质粒pET30a，重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达后经SDS-PAGE及Western blotting检测到约35ku的外源蛋白。表达产物免疫小鼠，所得抗体具有低滴度中和作用。     

保卫细胞中特异表达启动子片段缺失后表达载体的构建

iMyAP基因启动子的核心启动子370 bp片段能启动基因在保卫细胞中特异性表达。将其进行缺失,克隆得到370 bp、308bp和150 bp的启动子片段,与pMD18-T载体连接并进行序列分析后用BLAST软件作同源分析的结果显示,它们的核苷酸序列与GenBank中登陆的iMyAP启动子片段的核苷酸序列一致。将这3个启动子片段分别与pCAMBIA-1303质粒相连,构建得到表达载体。     

第六型人疱疹病毒糖蛋白H基因的确认和在大肠杆菌中的表达

新发现的一种DNA病毒(第六型人疱疹病毒,HHV-6),是疱疹病毒家族成员。用随机法对HHV-6 DNA BamHⅠ8Kb片段进行克隆,并测定其核苷酸序列后,与其它疱疹病毒对比,发现了HHV-6编码糖蛋白H(gH)的基因,它与人细胞肥大病毒(HCMV)的gH有高达46％的相似率。找出它的读码框架后,将其大部份克隆到质粒pET3CP并分别转染大肠杆菌株BL21、PLYSS和PLYSE.~(35)S甲硫氨基酸掺入试验表明,带有部份HHV-6gH基因片段的pET3CP质粒,可在上述大肠杆菌株表达。HHV-6gH基因的确定和表达,对今后研究HHV-6和其它疱疹病毒的诊断、治疗将有重要作用.     

新城疫病毒Mukteswar株F基因重组pGAPZα-F的构建

以RT-PCR扩增新城疫病毒Mukteswar株F基因F1片段和F2片段,以核酸内切酶Kpn I和Xba I对目的基因片段及质粒pCAPZαA进行酶切,连接酶切产物,转化E. coli DH5α.以PCR方法确定Mukteswar F1和Mukteswax F2的阳性重组子均为4个.对阳性重组子进行酶切鉴定及序列分析,结果,重组质粒pGAPZαA-F1、pGAPZαA-F2及质粒pGAPZαA的酶切电泳条带与试验设计大小相符;基因测序得到的重组子中F1和F2序列长度分别为1 198 bp、269 bp,与新城疫病毒Mukteswar株F基因序列比对,其序列长度和核苷酸排列完全一致.结果表明重组质粒中目的基因片段的核苷酸序列、大小和插入位置是正确的,为以酵母表达系统表达F1和F2,研究Mukteswar株与基因Ⅶ型毒株之间F蛋白的抗原性差异程度打下基础.     

鸡IL-2基因克隆及其重组质粒的构建与表达

利用一对自行设计的引物,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR),从ConA诱导的5周龄SPF鸡脾细胞中扩增出鸡白细胞介素2(IL-2)基因片段,其长度为439 bp,经酶切鉴定,初步确定为鸡IL-2基因.再将该IL-2基因片段定向插入真核表达质粒pcDNA3中,经DNA序列鉴定,表明构建的重组质粒含有IL-2基因,该基因的cDNA序列与Sundick报道的结果基本一致.然后,将IL-2基因片段插入原核表达载体pGEX-4T-1,并导入菌株BL21, 经诱导培养、蛋白提取和SDS-PAGE,获得分子量约为42 000的蛋白条带,表明所克隆的鸡IL-2基因在原核细胞中得到表达.     

马MxA基因真核载体表达重组质粒的构建与鉴定

从马外周血单核细胞中提取RNA后,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,获得了MxAcDNA.扩增的目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳回收,与pGEMR-T Easy栽体连接,转入大肠杆菌中筛选鉴定重组子.将质粒经酶切鉴定后.把酶切下的目的基因MxA cDNA进一步克隆到真核表达载体pCI-neo中,经PCR及序列鉴定,证实插入栽体pCI中的片段为含有目的基因的核苷酸序列.真核表达重组质粒DCI-neo MxA cDNA的构建成功,为进一步研究马MxA蛋白的抗病毒作用奠定了基础.     

禽流感病毒H5亚型HA1基因的原核表达及纯化

根据已报道的禽流感病毒H5 亚型HA1基因设计1对引物,利用RT-PCR技术扩增目的基因片段,将扩增片段插入到pPROEX-HTb表达载体上,并对重组表达质粒进行 PCR酶切鉴定,通过序列测定验证读码框,并在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中进行表达.结果表明:扩增出的1 000 bp的基因片段在大肠埃希氏菌中成功表达,...     

河南良杂猪白细胞介素-18成熟蛋白基因的克隆及表达载体的构建

采集6月龄河南良杂猪的脾脏,分离淋巴细胞后直接提取总RNA,进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,扩增产物进行T-A克隆、测序,获得了河南良杂猪IL-18基因成熟蛋白序列.序列测定表明,pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp,编码157个氨基酸.将该基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pQE30,构建重组质粒pQE-IL18,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确.     

新城疫病毒JZ05株F基因重组pGAPZα的构建

以RT-PCR扩增新城疫病毒JZ05株,基因F1片段和F2片段,以核酸内切酶κpnI和XbaI对目的基因片段及质粒pGAPZαA进行酶切,连接酶切产物,转化Eacterium coli DH5α.以PCR方法确定JZ05 F1的阳性重组子为2个,JZ05 F2的阳性重组子为4个.对阳性重组子进行酶切鉴定及序列分析,结果发现,重组质粒pGAPZαA-F1、pGAPZαA-F2及质粒pGAPZαA的酶切电泳条带与试验设计大小相符;基因测序得到的重组子中F1和F2序列长度分别为1198bp、269bp,与新域疫病毒JZ05株F基因序列比对,其序列长度和核苷酸排列完全一致.这表明重组质粒中目的基因片段的核苷酸序列、大小和插入位置是正确的,为以酵母表达系统表达F1和F2、研究强毒株与弱毒株F蛋白的抗原性差异程度及研制重组亚单位疫苗打下了基础.     

伪狂犬病毒粤A株gE基因真核表达质粒的构建

根据伪狂犬病毒(PRV)NLA-3和Rice株的gE基因序列，设计了1对含有起始密码子和HindⅢ、BarnHI酶切位点的引物，以PRV粤A毒株（PRV-YA)基因组为模板，利用聚合酶链反应(PCR)扩增获得gE基因片段，将这一片段克隆至PMDl8-T载体中，获得重组质粒PMID18-gE；用HindⅢ和BarnHI酶切该重组质粒，回收得到含有以上2个酶切位点粘端的gE基因，将此基因片段克隆至相同酶切、回收后的pcDNA3．1( )真核表达载体中，获得真核表达重组质粒pcDNA3．1-gE，经PCR鉴定、限制性内切酶分析和克隆片段的序列测定、比较，证实了克隆片段的可靠性。     

牛型布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因的克隆与原核表达

根据GenBank中登录的牛型布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因序列,设计了1对引物,采用PCR技术,牛流产病例分泌物为模板,扩增bp26的编码基因,得到1条753 bp的片段.将其连入Simple-T载体中进行酶切和测序鉴定.测序正确后,将该基因插入到pET-28a(+)载体中构建原核表达载体,将此重组质粒转化到Roset...     

胰蛋白酶抑制剂SKTI3基因的克隆及其植物表达载体的构建

以大豆基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了大豆胰蛋白酶抑制剂基因SKTI3的全长DNA片段,并将其构建到pMD18-T vector上。核苷酸序列测定结果表明:该基因片段全长654 bp,与已发表的SKTI3基因序列同源性达99%。将目的基因片段插入到pB I121 35S启动子下,构建重组质粒pB ISKTI3,采用冻融法将该重组质粒转入农杆菌EHA105中,获得了植物表达载体。     

猪传染性胃肠炎病毒N蛋白基因的克隆及其原核表达载体的构建

以本实验室从河北分离到的TGEV毒株,采用RT-PCR技术扩增了TGEV N基因,长为1149bp,并进行亚克隆重组到pMD18-T质粒载体上,连接,转化,鉴定后得到阳性重组质粒．命名为pTN．将重组质粒插入的片段进行序列分析和比较,结果表明TGEV河北分离株N基因与国外的Purdue-115、FS772/70、TO14、96-1933株均具有较高的同源性,达95％以上。推导的氨基酸序列同源性为95％以上。并将目的基因与原核表达载体pGEX-4T-3重组,成功构建了原核表达载体pGEX-N。pGEX-N表达载体的构建,为其蛋白质的表达提供重要依据。     

人肝再生增强因子基因的克隆和真核表达载体的构建

从6月龄流产的胎儿肝脏中提取总RNA,利用反转录-PCR(RT-PCR)技术扩增出人肝细胞再生增强因子hALR(Human augmenter of liver regeneration)基因片段,克隆于PET28a(+)载体,经进一步PCR及酶切鉴定,确定为此目的片段后进行序列分析,再将目的片段亚克隆于真核表达载体pcDNA3.1(+),用酶切方法鉴定重组子。采用RT-PCR技术成功地获得了hALR基因片段。序列分析表明,克隆的hALR基因与Genbank报道的人ALR核苷酸序列基本一致。完成了真核表达载体的构建,为hALR基因的真核表达奠定了基础。     

牛胰腺核糖核酸酶A的基因克隆、表达及初步鉴定

【目的】为了避免在制备基因治疗或基因免疫的质粒时使用动物源性的核糖核酸酶A（RNase A）。【方法】提取牛胰腺总RNA，利用RT-PCR扩增出牛核糖核酸酶A cDNA，RT-PCR产物克隆到pGEM-T载体测序验证后，将此cDNA亚克隆到大肠杆菌分泌型表达载体pEZZ18中。【结果】SDS-PAGE电泳显示其转化菌经温度诱导后能表达预计的大小为28 kD重组蛋白。用渗透法释放出表达产物，将其加入到经碱裂解粗提的质粒DNA中并孵育0.5 h，琼脂糖凝胶结果表明表达产物能很好地去除细菌的RNA并且不降解超螺旋质粒DNA。【结论】在质粒的纯化过程中，重组牛核糖核酸酶可以替代动物源性的RNase A。     

大肠杆菌K88菌毛蛋白faeG亚基基因克隆及表达

利用PCR技术,从致仔猪黄痢的大肠杆菌中扩增不含信号肽序列的K88菌毛蛋白faeG亚基基因片段,将其克隆到表达载体pGEX-6P-1中,构建该基因的原核表达载体pGEX-FaeG,通过测序证明序列正确后,导入大肠杆菌BL21,得到工程菌株PGEX-FaeG。IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析结果表明,融合蛋白（约53ku）在大肠杆菌BL21中得到高效表达,表达产物约占菌体蛋白的35％,免疫印记结果表明此融合蛋白与K88单抗反应。     

花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及反义表达载体的构建

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)是控制植物籽粒中蛋白质/油脂含量比例的关键酶.本研究利用RT-PCR技术,克隆PEPCase基因的cDNA片段,并将克隆的PEPCase基因片段反向连接替代植物表达载体PBI121的GUS基因.从花生栽培品种荔蒲大花生中克隆获得编码PEPCase基因的cDNA片段(886 bp),测序结果显示其核苷酸序列与已报道的花生(EU391629)、棉花(AY008939)、大豆(D10717)、拟南芥(AY210895)、豌豆(D64037)PEPCase基因对应部分的同源性分别为99.77%、84.37%、81.54%、81.25%、78.71%.构建的反义表达载体中PEPCase基因由35S启动子所控制,将构建的反义表达载体命名为pBGPEP.为通过反义抑制技术提高花生含油量提供了基因及表达载体.     

IBDV超强毒HZ株VP2基因的克隆和真核表达质粒的构建

利用反转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR) ,扩增克隆传染性法氏囊病病毒超强毒 (vv IBDV) HZ株 VP2基因 ,并对 VP2基因进行全序列测定、序列分析和聚类分析 ,同时将VP2基因与真核表达载体 pc DNA3相连接。结果克隆到 VP2基因全序列长 1 356bp,分析表明 HZ株与欧洲超强毒株 UK661高度相似 ,同时将 VP2基因正向插入 pc DNA3的 CMV启动子下游 ,得到了 VP2基因的真核表达质粒。为 IBDV分子流行病学和基因工程疫苗的研究奠定了物质基础     

猪附红细胞体特异性基因的克隆和序列分析

为分析吉林省流行的猪附红细胞体基因序列,根据发表的猪附红细胞体16S rRNA基因序列设计引物,扩增出长度约为541 bp的基因片段,并成功地将该基因克隆到pGEM-T Easy载体.将经Not Ⅰ酶切鉴定和PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序,与发表的附红细胞体基因序列进行比较,试验所获得的核苷酸序列与猪附红细胞体16S rRNA基因序列非常相近,同源性为97.8%～100%,从而证明吉林省所流行的猪附红细胞体属于16S rRNA基因群.     

鸡干扰素α受体Ⅱ胞外域的克隆及GST融合蛋白原核表达

应用RT-PCR技术扩增鸡干扰素α受体Ⅱ胞外域（CHIFNAR2 EC）基因片段,将扩增产物克隆至pMD-18T,转化J M109感受态。重组质粒与表达载体pGEX-6P-1经双酶切后构建重组表达质粒pGEX-6P-CHIF-NAR2EC,转入BL21,提取质粒酶切和测序鉴定。测序结果与参考序列比较,核苷酸同源性为99%。用IPTG诱导表达,对诱导条件进行初步优化,表达蛋白主要以包涵体的形式存在。通过切胶的方法进行纯化,获取具有较高纯度的融合蛋白。表达产物经SDS-PAGE和Western Blot检测显示融合蛋白分子量大小约为50 KD,采用抗GST抗体进行Western Blot,成功检测到特异性目的条带。