亚硝基谷胱甘肽还原酶 GSNOR1正调控植物对疫霉菌的抗性

疫霉属（ Phytophthora）卵菌引致马铃薯晚疫病等作物灾难性病害,严重威胁作物的可持续生产。由于病菌毒性变异,导致品种抗病性丧失问题突出。因此,挖掘植物广谱和持久抗病基因,并探索其在抗病育种中的有效利用具有重要的科学意义。亚硝基谷胱甘肽还原酶1（GSNOR1）是植物氮信号通路中高度保守的关键还原酶,其参与调节r基因介导的植物抗性和非寄主抗性。然而, GSNOR1参与抗疫霉菌的免疫功能和作用机理尚不清楚。本研究中,借助拟南芥与寄生疫霉菌互作的模式体系,首先发现拟南芥T-DNA插入突变体 gsnor1-3对寄生疫霉菌呈现感病表型。进一步利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）降低烟草叶片中 GSNOR1同源基因的表达量,在此基础上,通过抗病表型分析以及一系列抗性相关功能的检测,结果表明,沉默本氏烟草 GSNOR1同源基因能够在寄生疫霉菌侵染植物的过程中削弱植物体内的活性氧（ROS）迸发、病程相关基因（PR genes）的诱导表达以及MAPK信号转导,从而增强了植物对疫霉菌的感病性。本研究揭示了植物 GSNOR1对疫霉菌具有高度保守的抗性功能,并初步解析了 GSNOR1正调控植物抗疫霉菌的作用机理,为进一步探索 GSNOR1在马铃薯抗晚疫病中的功能及其在抗病育种中的有效利用奠定了重要的理论 基础。     

马铃薯类糖基转移酶基因StKOB1的克隆与功能分析

糖基转移酶通过参与多种物质糖基化修饰在植物抗逆胁迫方面发挥重要作用。为了解糖基转移酶基因在马铃薯晚疫病抗性中的作用,从马铃薯栽培种‘合作88’中克隆类糖基转移酶基因StKOB1,分析了该基因的表达特性及功能。通过实时定量PCR技术,分析StKOB1受晚疫病菌(Phytophthora infestans)、水杨酸、茉莉酸甲酯及乙烯利诱导表达模式,利用基因瞬时表达和病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术在本氏烟草中超量表达和沉默该基因,然后进行晚疫病抗性鉴定。结果表明,StKOB1蛋白结构域包含1个跨膜结构域(27～47 aa),1个糖基转移酶功能域(115～381 aa)。StKOB1基因受晚疫病菌和茉莉酸甲酯诱导表达。瞬时超量表达StKOB1基因未能增强植物抗病性,但与对照植株相比,Nb KOB1沉默植株的抗病性显著降低。上述结果说明StKOB1参与晚疫病抗性调控。     

广州地区茄疫病的发生及疫霉种鉴定

 1987～1999年,从广州地区茄的果实、茎、叶及根上分离得到疫霉菌,根据形态特征、培养性状及生理特性等方面研究结果,鉴定出4个种,其中以辣椒疫霉Phytophthora capsici Leon较为普遍,烟草疫霉P.nicotianae Van Breda de Haan次之, 掘氏疫霉P.drechsleri Tucker较少出现,致病疫霉P.infestans (Montagne) de Bary 仅见于春季;此外,种群分布与前作及不同季节有关。     

马铃薯 StMKK1基因RNAi干扰载体的构建及遗传转化

丝裂原活化蛋白激酶MAPK级联反应在植物响应生物与非生物胁迫中发挥着重要作用。为了获得转基因马铃薯,进一步探索 StMKK1在信号转导和胁迫响应中的功能,从四倍体栽培品种马铃薯Desiree 的cDNA中克隆到 StMKK1基因302 bp的目的片段,并将目的基因的正向片段利用EcoRⅠ和KpnⅠ,反向片段利用HindⅢ和XbaⅠ与重组载体35s-pART27进行连接,构建成35s- StMKK1-pART27-RNAi表达载体;利用农杆菌介导的遗传转化方法,将35s- StMKK1- pART27-RNAi载体导入马铃薯品种Desiree中,得到7株沉默的阳性马铃薯转基因植株,不同的转基因植株中 StMKK1基因的沉默效率经检测均在92%以上。     

一株烟草疫霉菌拮抗菌的筛选及应用潜力初探

从烟草疫霉病发病严重的烟田取健康植株根系土壤,通过平板对峙法筛选对烟草疫霉菌有拮抗作用的菌株,获得1株对烟草疫霉菌有明显抑制作用的菌株LZW-118,平板抑制率达到71.14％.通过形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析,该菌株为越南伯克霍尔德氏菌(Burkholderia vietnamiensis).促...     

致病疫霉菌无毒基因AVR3a的克隆与序列分析

根据GenBank中致病疫霉菌无毒基因AVR3a序列（AJ893357）及参考文献中的特异引物（Pex147F,Pex147R）,以致病疫霉菌基因组DNA为模板进行PCR扩增,得到了特异性扩增片段,并对特异片段进行纯化和测序。结果表明,该片段的长度为451bp,经序列分析表明,其氨基酸编码序列为441bp,共编码147个氨基酸。BLAST分析结果显示,该片段核苷酸序列与无毒基因AVR3a核苷酸序列的同源性为99．34％,氨基酸序列比对结果表明,氨基酸序列在第19、80和103位存在着差异,这些核苷酸序列差异以及某些关键氨基酸的改变有可能是导致不同菌株中AVR3a毒性变异的原因。     

致病疫霉菌RXLR效应蛋白AVR1-like寄主靶标的酵母双杂交筛选

由卵菌病原物致病疫霉菌引起的马铃薯晚疫病是造成马铃薯毁灭性损失的病害.为了筛选致病疫霉菌RXLR效应蛋白AVR1-like(AL)的寄主靶标,以致病疫霉菌88069菌株的DNA为模板,克隆致病疫霉菌效应蛋白AL,并将其成功构建到pGBKT7载体上,形成诱饵载体.将pGADT7和重组诱饵载体共转化到酵母感受态AH109中...     

致病疫霉菌RXLR效应蛋白AVR1-like寄主靶标的酵母双杂交筛选

由卵菌病原物致病疫霉菌引起的马铃薯晚疫病是造成马铃薯毁灭性损失的病害.为了筛选致病疫霉菌RXLR效应蛋白AVR1-Iike(AL)的寄主靶标,以致病疫霉菌88069菌株的DNA为模板,克隆致病疫霉菌效应蛋白AL,并将其成功构建到pGBKT7载体上,形成诱饵载体.将pGADT7和重组诱饵载体共转化到酵母感受态AH109中...     

马铃薯晚疫病生防细菌的筛选及鉴定

为明确从矮火绒草根内分离获得的内生细菌对致马铃薯晚疫病病菌的抑制作用,采用稀释平板法分离矮火绒草内生细菌,以对峙培养法和打孔法分别测试细菌菌株和发酵液滤液对晚疫病菌丝生长和孢子囊萌发的抑制作用,并对优势菌株进行分子生物学鉴定.结果表明,在分离的54株细菌中,有20株细菌对晚疫病病菌具明显拮抗作用,有6株抑菌率达80％以...     

以Ypt1基因为靶标的致病疫霉菌Phytophthora infestans的分子检测

三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白基因(Ypt1)是一个与原癌基因Ras(Rat sarcoma)相关的基因,在酵母中,该基因编码一个与Ras相关GTP结合蛋白。为了研究以Ypt1基因为分子靶标的致病疫霉菌(P.infestans)检测技术,比较了30种卵菌Ypt1基因的序列,以该序列为靶标设计了1对针对P.infestans的特异性PCR引物Pi1/Pi2。试验结果表明,在供试的55种不同疫霉菌和真菌的144个菌株中,利用这1对引物只能从P.infestans基因组DNA中分别扩增出1条分子量为369 bp的特异性条带,这1对引物的检测灵敏度为100 pg。以疫霉菌Ypt1通用引物Yph1F/Yph2R结合这1对特异引物进行套式PCR扩增,使引物Pi1/Pi2的检测灵敏度提高了10倍,检测到10 pg的基因组DNA。通过套式PCR,引物Pi1/Pi2对游动孢子和卵孢子的检测灵敏度分别为3个游动孢子和1个卵孢子;以Pi1/Pi2引物,分别采用单轮PCR和套式PCR可检测马铃薯发病组织和病田土壤的致病疫霉。以上结果证明Ypt1基因适合作为疫霉菌分子检测靶标。采用以这1对特异引物建立的以PCR技术为基础的分子检测方法,可对田间土壤和发病植物组织中的P.infestans进行快速、灵敏的检测。     

野生茄转化酶抑制子基因 StINH1的克隆与序列分析

以1个受黄萎病菌诱导的“托鲁巴姆”下调EST为种子序列,在NCBI进行同源搜索,经人工拼接、RT PCR克隆与序列分析验证,获得野生茄“托鲁巴姆”转化酶抑制子基因(INH)的全长cDNA序列,命名为 StINH1。该基因的开放阅读框全长531 bp,编码176个氨基酸,与电子克隆获得的序列完全相同。编码蛋白的分子质量为19.916 ku,理论等电点为5.14。序列分析表明,该基因属于植物PMEI超家族,编码的前体蛋白含有1个拥有19个氨基酸的前导肽,同时含有多个磷酸化位点。表达模式分析表明,在黄萎病菌侵染后, StINH1在“托鲁巴姆”根中呈下调表达。     

甘肃省马铃薯致病疫霉交配型组成及其对甲霜灵的抗药性

为了明确甘肃省马铃薯致病疫霉交配型组成与对甲霜灵的抗药性,采用生长速率法对2007-2012年采集标样中分离到186株致病疫霉菌进行甲霜灵抗药性测定,利用对峙培养法对147株代表性菌株进行交配型测定。结果表明:甘肃省马铃薯致病疫霉交配型由A1、A2、A1A2交配型和自育型菌株组成,分别占被测菌株的61.20%、20.40%、2.10%、16.30%;186株致病疫霉中28.50%的菌株对甲霜灵表现敏感,15.60%表现中抗,55.90%表现高抗。甘肃省马铃薯致病疫霉交配型组成复杂,各采集地组成差异较大,对甲霜灵表现抗药性的菌株普遍存在各采集地。     

根部内生真菌—寄生疫霉—拟南芥互作模式体系的构建与鉴定

为构建根部内生真菌—寄生疫霉—拟南芥三方互作模式研究体系,以影响马铃薯晚疫病害发生的潜在内生真菌雪球微座孢(Microdochium bolleyi)为例,利用WGA-Alexa Fluor^○R488染色和带有GFP标记的寄生疫霉(Phytophthora parasitica)转化菌株,通过荧光显微镜观察分析M.bolleyi侵染拟南芥根部以及M.bolleyi与寄生疫霉和拟南芥根部三方互作的细胞学特征;利用皿内平板拮抗测试初步分析内生真菌M.bolleyi对致病疫霉(Phytophthora infestans)的抑制效果,并进一步利用皿内拟南芥与真菌M.bolleyi和寄生疫霉三方互作体系,鉴定分析真菌M.bolleyi对植物与寄生疫霉亲和互作的影响。结果表明,真菌M.bolleyi可成功侵染并定殖于根组织,而未引发植物细胞坏死现象,说明M.bolleyi具有典型的内生真菌特征;相比于对照预处理,真菌M.bolleyi预处理能够抑制寄生疫霉在拟南芥根部的定殖和扩展,初步揭示真菌M.bolleyi在植物与疫霉菌互作中的影响作用;真菌M.bolleyi不仅对致病...     

红花CtMYB-TF1基因的克隆与表达分析

为了探索R2R3-MYB转录因子与植物类黄酮的次生代谢调控之关系,及对植物花青素合成代谢的作用,以红花花瓣为试验材料,采用RT-PCR结合RACE技术,从红花(Carthamus tinctorius)中克隆获得1个全长1 260 bp的调控花青素代谢的 CtMYB-TF1基因。结果表明,该基因序列可编码249个氨基酸,其蛋白质分子质量为28.08 ku;红花CtMYB-TF1蛋白分子式为C_(1220)H_(1930)N_(358)O_(378)S_(13),是一种不稳定的碱性亲水蛋白;由系统进化树分析可知,红花 CtMYB-TF1与葡萄 VvMYBPA1亲缘关系较近;通过RT-qPCR技术对表达体系进行基因表达量的检测分析,红花 CtMYB-TF1基因在花期的各个时期相对表达量均高于红花CtANS基因,并且随着花期的延长红花 CtMYB-TF1基因和CtANS基因的相对表达量也有增高,其中在花期的第5天红花 CtMYB-TF1基因的相对表达量出现峰值,说明 CtMYB-TF1基因对CtANS基因具明显的上调作用,可为构建高产、稳定的红花基因工程改良细胞株提供参考。     

河南省烟草黑胫病菌生理小种鉴定

在河南省宜阳、登封、渑池等15个烟叶主产区分离到烟草黑胫病菌36个,采用TTZ颜色反应和游动孢子悬浮液注射接种鉴别寄主两种方法鉴定其生理小种类型。结果表明:36个菌株在TTZ培养基上均呈现红色反应,有32个菌株对L8和NC1071都有较强的致病力,将其鉴定为1号生理小种,占供试菌株的88.9%,为河南省烟草黑胫病菌的优势小种;其他4个菌株有1个菌株对L8无致病力,2个菌株对其致病力较弱,1个菌株对NC1071无致病力,生理小种类型尚未确定。     

马铃薯StCYP83B1基因过表达载体构建及遗传转化

旨在为解析马铃薯StCYP83B1基因的免疫功能提供重要材料基础,从四倍体马铃薯栽培种‘大西洋’的cDNA中克隆到StCYP83B1基因,将其与融合mCherry标签的35S::pART27重组载体连接,构建p35S::StCYP83B1 mCherry植物过表达载体,并通过农杆菌介导的本氏烟瞬时表达体系确认该蛋白的表达;利用农杆菌介导的马铃薯遗传转化方法,将p35S::StCYP83B1 mCherry转入马铃薯中,随机挑选3株转基因植株进行鉴定：PCR检测证明StCYP83B1已整合到马铃薯基因组中,反转录实时定量PCR检测表明StCYP83B1在转化植株中的转录水平比未转化的对照植株上调40~49倍,免疫印迹检测表明StCYP83B1蛋白可以在转化植株中正常表达。同时,对转化马铃薯植株及微型薯的表型鉴定表明,StCYP83B1过量表达并不影响马铃薯的正常生长发育。该稳定转化马铃薯植株的获得为后续深入解析StCYP83B1基因的免疫功能及作用机制奠定了重要材料基础。     

茶树己糖激酶基因CsHXK1的克隆与表达分析

己糖激酶(HXK)是植物呼吸和代谢过程中的关键酶之一,不仅催化己糖磷酸化,而且参与植物糖感应和糖信号转导过程,在植物生长发育和逆境响应中发挥重要作用。试验以茶树‘龙井长叶’为材料,克隆获得了茶树己糖激酶基因 CsHXK1的cDNA序列,其包含一个1 488 bp的开放阅读框,编码495个氨基酸,预测蛋白分子质量为53.63 ku,理论等电点为5.96。蛋白序列分析结果显示,CsHXK1含有2个保守的磷酸化激酶域、1个底物结合域和1个ATP结合域,与拟南芥、苹果等HXK1亲缘关系较近。另外, CsHXK1基因启动子区域包含多种与逆境响应和糖信号转导相关的顺式作用元件,如ABA响应元件(ABRE)、脱水响应元件(MYBCORE)及糖信号转导相关元件(SREATMSD)等。qRT-PCR分析结果显示, CsHXK1基因表达受高温、干旱、低温及盐胁迫的诱导,其可能在茶树响应多种非生物胁迫过程中发挥重要作用。     

猕猴桃 AcNPR1基因克隆及抗病响应表达分析

为探究猕猴桃 AcNPR1基因在抗病响应中的作用及其在不同抗性猕猴桃品种间抗性差异机制,以高感病品种‘红阳’和抗病品种‘徐香’猕猴桃叶片为材料克隆 AcNPR1基因序列;利用ExPASy-ProtParam tool、MEGA 7.0 等对‘红阳’AcNPR1蛋白的理化性质进行分析、亚细胞定位进行预测、进化关系等进行分析;通过RT-qPCR分析 AcNPR1基因在不同品种猕猴桃植株中的组织表达模式以及病原菌和水杨酸（Salcylic acid,SA）对其诱导表达模式。结果表明, AcNPR1基因开放阅读框1 770 bp（Genbank 登录号MW881148）,编码589个氨基酸,理论等电点6.27,具有典型的BTB/POZ结构域、ANK重复序列、NPR-like等NPR1蛋白保守结构域,AcNPR1蛋白预测定位于细胞核中;蛋白质的二级结构以α螺旋和无规卷曲为主;系统进化显示其与茶树的亲缘关系最为密切,相似性为83.94%。组织特异性分析表明 AcNPR1基因在‘红阳’和‘徐香’品种叶片中的表达水平最高。在丁香假单胞杆菌猕猴桃致变种（Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa）处理下,抗病品种‘徐香’ AcNPR1基因的相对表达水平在处理0 h后迅速增加,为对照的3.6倍;而高感品种‘红阳’在48 h后显著增加,为对照的2.7倍。在SA+Psa处理下,‘徐香’ AcNPR1基因相对表达水平在24 h内达到最高水平,是对照的7.7倍;‘红阳’在72 h后达到最大值,仅为对照的1.6倍。 ‘徐香’ AcNPR1基因的抗病响应反应早于‘红阳’且更易受SA诱导表达。 AcNPR1基因在猕猴桃抗病胁迫方面具有一定作用,在不同抗性的猕猴桃品种抗病机制中存在差异。     

卵形鲳鲹 SST1基因的克隆与组织表达

为了解卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus） SST1基因的生物学信息、胚胎发育不同时期的表达水平及其在组织中的表达和分布情况,进而探讨 SST1基因可能的生理功能及作用机制。对卵形鲳鯵基因组（登录号: PRJNA574895）中的 SST1基因（ID:EVM0001630）进行生物信息学分析,并对其在卵形鲳鯵胚胎发育的不同时期及其在幼鱼不同组织中的表达情况进行定量分析。结果表明,卵形鲳鲹的 SST1基因全长1 155 bp,开放阅读框序列长1 104 bp,共编码368个氨基酸,蛋白分子质量为41.42 ku,理论等电点pI为8.47,属于带正电的疏水性蛋白。SST1蛋白无信号肽序列,亚细胞定位主要于细胞质膜,属于膜蛋白,包含17个磷酸化位点,存在7个跨膜结构域,三维结构主体为7段α-螺旋并列扭曲排列成的一柱状结构。序列比对和系统进化树分析显示,卵形鲳鲹与黄尾鰤和高体鰤共聚于一个分支,氨基酸序列同一性分别为98.39%和  98.37%。定量PCR分析结果表明, SST1在卵形鲳鲹胚胎发育的前13个时期微量表达,进入初孵仔期表达量迅速升高。 SST1在卵形鲳鲹幼鱼不同组织中的表达量差异极显著,其中在脑组织中表达量最高,其次是卵巢和精巢,在背鳍、皮肤、肌肉等其他11个组织中的表达量相对较低。说明 SST1在卵形鲳鲹神经内分泌、性腺发育及生殖细胞发生过程中可能发挥着重要作用。