牛PSMA5基因RNA干扰载体的构建与筛选及在奶牛乳腺上皮细胞中的表达

设计4条待选的shRNA序列以及1条阴性对照序列,构建RNA干扰载体,然后转染到奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)中,最后利用实时荧光定量PCR和Western blotting技术分别检测蛋白酶体α5亚基(PSMA5)在奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)中mRNA和蛋白水平的表达。结果显示:转染shRNA-1组,shRNA-3组和shRNA-4组的PSMA5基因相对表达量显著低于阴性对照组(P0.05),且shRNA-4组的PSMA5基因相对表达量最低。结果表明:本试验成功构建并筛选出了PSMA5基因RNA干扰载体,并在奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)中成功表达。     

家兔Zfx基因shRNA干扰载体构建及验证

研究主要是为了构建出针对家兔Zfx基因的shRNA重组载体及效果验证。根据家兔Zfx基因mRNA序列特征,设计出3条shRNA片段,再与线性化的pLL 3.7载体进行连接重组,最后经过qRT-PCR检测Zfx基因mRNA表达量筛选出有效重组表达载体并通过体内试验进行效果验证。结果表明:试验组shRNA-c和shRNA-f干扰效率分别为74%和67%,与空白对照组相比差异极显著(P<0.01);试验组shRNA-e干扰效果为17%,与空白对照组相比差异不显著(P>0.05)。用shRNA-c和shRNA-f进行体内试验,结果显示,两试验组雄性率分别为44.92%(P>0.05)和33.16%(P<0.01)。本试验成功构建针对家兔Zfx基因的重组载体,体内试验显示子一代出现性别偏移,说明Zfx基因对动物的性别决定有一定作用,关于导致体内验证出现反转的原因仍需进一步验证。     

靶向akirin2基因shRNA真核表达载体的构建及其干扰效率的测定

为了抑制C2C12细胞中akirin2基因的表达,试验采用siRNA表达载体法构建了靶向akirin2基因的RNA干扰(RNAi)真核表达载体。首先针对akirin2基因设计并合成了相应的干扰序列,退火后将其与RNAi表达载体psiRNA-h7SKGFPzeo进行连接,构建成干扰载体akirin2-pshRNA0、akirin2-pshRNA1。将构建好的载体通过Turbofect转染试剂转染小鼠成肌细胞C2C12,通过荧光定量PCR检测其干扰效率,经酶切和测序鉴定所构建的akirin2基因RNA干扰载体与设计序列完全相符。结果表明:重组干扰载体akirin2-pshRNA0和akirin2-pshRNA1构建成功。将重组RNAi载体转染C2C12细胞,与正常对照组相比,转染akirin2-pshRNA1组的akirin2基因mRNA相对表达量显著降低,表达量下调了60.62%(P0.05)。说明试验构建的靶向akirin2基因的RNAi载体akirin2-pshRNA1可以有效地抑制C2C12细胞中akirin2基因的表达。     

CIRP对冷应激小鼠血清生化指标、相关细胞免疫因子及能量代谢的影响

将45只6周龄体质量(18±2)g SPF级雄性SD小鼠随机分为5组(n=5),常温对照组5只(A组);低温对照组冷刺激4、8h各5只(B组);冷诱导RNA结合蛋白(cold-inducible RNA binding protein,CIRP)过表达组冷刺激4、8h各5只(C组),注射CIRP过表达慢病毒液0.1mL;CIRP干扰组冷刺激4、8h各5只(D组),注射CIRP干扰病毒液0.1mL;阴性对照组冷刺激4、8h各5只(E组),注射空载体病毒液0.1mL。A组置于常温(21±0.1)℃条件下饲养,后4组置于低温(4±0.1)℃环境饲养,分别在4h及8h后通过摘除眼球的方法采取血液。采用ELISA法检测血清中IL-1、IL-2、IL-6、GSH-PX、SOD、T-AOC、MDA、丙酮酸、PFK-1、LDH的含量。结果显示:(1)冷应激处理后,小鼠血清中相关细胞因子水平出现明显变化,人为的致使CIRP在小鼠体内出现不同的表达对血清中相关细胞因子的影响差异显著(P0.05);(2)冷应激处理后,小鼠血清中氧化还原指标GSH-PX、SOD、T-AOC、MDA变化非常明显,人为的致使CIRP在小鼠体内出现不同的表达对血清中相关氧化还原指标的影响差异极显著(P0.01);(3)冷应激处理后,血清当中能量代谢相关指标无明显变化,人为的致使CIRP在小鼠体内出现不同的表达对血清中相关能量代谢指标的影响差异不显著(P0.05)。结果表明:在不影响动物机体能量代谢的情况下,CIRP可以有效地抑制细胞内氧自由基的生成,从而提高小鼠抗氧化能力,以及调节动物机体的相关免疫因子,对小鼠抵抗低温应激起到积极地保护作用。     

SIRT1对牛卵泡颗粒细胞凋亡及雌激素分泌的影响

本实验旨在研究沉默信息调节因子1(SIRT1)对牛卵泡颗粒细胞凋亡及雌激素分泌的影响。构建SIRT1基因干扰载体,并转染体外培养的颗粒细胞。实验分为转染SIRT1-sh RNA的干扰组、转染NC-sh RNA的对照组和未转染的空白组,每组设3个重复。流式细胞术检测细胞凋亡;实时荧光定量PCR检测细胞内Bax、Bcl-2 m RNA表达;Western Blot检测细胞内Bax、Bcl-2蛋白表达;ELISA试剂盒检测雌激素水平。结果表明:干扰组颗粒细胞SIRT1 m RNA表达量显著低于对照组与空白组(P0.05),而对照组与空白组之间差异不显著(P0.05);干扰组颗粒细胞凋亡率显著低于对照组与空白组(P0.05);干扰组颗粒细胞Bax m RNA和蛋白质表达显著低于对照组与空白组(P0.05),而Bcl-2 m RNA和蛋白质表达均显著高于对照组与空白组(P0.05);干扰组颗粒细胞培养液中雌激素含量显著低于对照组与空白组(P0.05)。SIRT1基因可以促进牛卵泡颗粒细胞的凋亡,并促进雌激素分泌。     

RNA干扰INHα基因对绵羊颗粒细胞周期及凋亡相关基因表达的影响

旨在研究RNA干扰INHα基因对绵羊颗粒细胞周期及凋亡相关基因表达的影响,明确抑制素对绵羊颗粒细胞的局部调节作用,为今后提高动物的繁殖力奠定基础。选用1.0~1.5岁的小尾寒羊,从卵泡(3~7mm)中分离培养颗粒细胞,将siINHα和siNC(阴性对照)转染颗粒细胞,以未转染的细胞为空白对照(Control),利用脂质体介导法进行转染,荧光定量RT-PCR检测INHα基因的沉默效率、细胞周期和凋亡相关基因的变化,流式细胞仪检测细胞周期的分布变化。结果表明,siRNA转染绵羊颗粒细胞48h后,INHα基因的沉默效率达85%以上。与阴性对照相比,细胞周期相关基因Cyclin D1和CyclinB1mRNA的表达水平分别降低了0.2倍和0.7倍(P0.05),而p21的mRNA表达水平升高了0.9倍(P0.05);细胞凋亡通路中的促凋亡因子Bax、p53和Caspase3的mRNA表达量分别升高了1.8倍、3.6倍和0.4倍(P0.05),而抗凋亡因子Bcl-2mRNA表达量不受影响,阴性对照与空白对照差异不显著(P0.05)。与阴性对照相比,细胞周期的分布显著改变,干扰组G1细胞比例显著升高(P0.05),S期细胞比例显著降低(P0.05),而阴性对照与空白对照间无显著差异(P0.05)。综上表明,INHα作为绵羊颗粒细胞中关键的调控因子,通过调控绵羊颗粒细胞的生长和凋亡参与调控绵羊卵泡排卵的过程。     

中草药添加剂提高不同品种猪肉质中相关基因表达量的研究

为了研究中草药添加剂对与猪肉品质相关的几个蛋白基因表达量的影响,试验选择晋汾白猪、晋阳白猪、山西黑猪、杜长大三元杂交猪4个品种猪,每个品种猪分别设置中草药组、抗生素组和空白对照组,每组30头。中草药组在基础日粮中添加300目超微粉剂中草药,抗生素组添加金霉素30 g/t和硫酸黏杆菌素6 g/t,空白对照组不添加任何添加剂,经饲养试验和屠宰后从背最长肌取样,提取基因组进行PCR扩增,并自动生成扩增曲线和熔解曲线,检测猪心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因、钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)基因、脂蛋白脂肪酶(LPL)基因、肌细胞生成素(MyoG)基因、己糖激酶同工酶(HK)基因、ATP合成酶(ATP5B)基因、磷酸果糖激酶(PFK)基因等7个与肉质相关的蛋白基因相对表达量。结果表明:猪肉中H-FABP、CAST、LPL、MyoG、HK、ATP5B、PFK等7个基因的相对表达量在不同品种猪、不同组内均有差异,不同品种猪中,中草药组不同基因相对表达量多数情况高于空白对照组和抗生素组。尤其是山西黑猪中草药组基因相对表达量明显高于空白对照组和抗生素组,其中中草药组与空白对照组相比H-FABP和HK基因差异显著(P0.05);与抗生素组相比H-FABP、CAST、LPL、MyoG、ATP5B、PFK基因差异显著(P0.05),HK基因差异极显著(P0.01)。晋阳白猪中草药组与空白对照组相比CAST、HK、ATP5B、PFK基因差异显著(P0.05),H-FABP基因差异极显著(P0.01);与抗生素组相比H-FABP、LPL、ATP5B基因差异显著(P0.05),CAST、HK、PFK基因差异极显著(P0.01)。杜长大三元杂交猪和晋汾白猪中草药组各基因相对表达量与空白对照组和抗生素组相比均差异不显著(P0.05)。说明中草药添加剂可以提高不同品种生长育肥猪肉质中7个蛋白相关基因的相对表达量。     

从江香猪PHKG2基因超表达载体和RNA干扰载体的构建及其表达

旨在克隆从江香猪磷酸化酶激酶γ2(phosphorylase kinase gamma 2,PHKG2)基因编码区,并对PHKG2基因功能进行初步探究。本研究利用RT-PCR法扩增从江香猪PHKG2基因完整CDS区。通过构建pEGFP-N3-PHKG2超表达载体,设计并合成4对针对从江香猪PHKG2基因的RNAi表达载体,瞬时转染至C2C12细胞株和从江香猪肾细胞中,以正常生长的细胞为空白对照,24h后检测各个重组载体的绿色荧光蛋白的表达情况。48h后提取细胞总RNA,利用qRT-PCR方法检测目的基因PHKG2和糖原代谢相关基因糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase,muscle form,PYGM)、肌肉糖原合成酶(glycogen synthase 1(muscle),GYS1)、磷酸甘油酸变位酶(Phosphoglyce rate mutase,PGAM2)基因mRNA的表达情况,并且测定各组细胞中的糖原含量。结果表明,经过双酶切、测序检测以及脂质体瞬时转染至C2C12细胞中,验证超表达载体pEGFP-N3-PHKG2和4对RNAi表达载体均构建成功。转染至从江香猪肾细胞后,相对于空白对照(Blank)和阴性对照(pEGFP-N3),超表达载体pEGFP-N3-PHKG2能极显著提高PHKG2基因的表达量(P0.01),同时显著上调PGAM2、PYGM基因的表达量(P0.05),并且显著降低细胞中糖原的含量(P0.05)。各RNAi载体中,相对于空白对照(Blank)和阴性对照(NC),shRNA-1的干扰效率较高,极显著下调PHKG2基因的表达量(P0.01),显著下调PGAM2、PYGM、GYS1基因的表达量(P0.05),并且显著升高细胞中糖原含量(P0.05)。shRNA-2极显著下调PHKG2基因的表达量(P0.01);shRNA-3对PHKG2基因的表达也能起到显著的干扰作用(P0.05);shRNA-4对于所检测的4个基因干扰效果不明显;shRNA-2、shRNA-3、shRNA-4转染细胞后,细胞中糖原含量升高水平不明显。PHKG2基因超表达和RNAi后可分别明显上调和抑制PHKG2、PYGM、PGAM2、GYS1基因的表达,并且分别降低和提高糖原含量,可能是影响从江香猪猪肉品质的重要候选基因,为进一步研究PHKG2基因在细胞糖原代谢通路中的作用机制奠定基础。     

MyoD基因在不同品种肉羊肌肉中表达比较

MyoD基因是调控脊椎动物胚胎期肌肉生长的主要基因。本试验采用RT-PCR方法,研究MyoD基因mRNA在乾华肉用美利奴羊(暂定名)、小尾寒羊、乾华肉用美利奴羊(♂)×小尾寒羊(♀)杂交羊3组肉羊品种胸肌、背最长肌、半腱肌中表达量的差异,并采用免疫组化法,对MyoD基因进行肌肉部位蛋白定位。结果表明,MyoD基因mRNA和蛋白在3个不同品种的3种肌肉中均能表达,从同一品种内表达水平来看,MyoD基因mRNA在不同肌肉部位中表达差异均不显著(P0.05),其中乾华羊呈现胸肌背最长肌半腱肌的趋势;杂交羊呈现背最长肌胸肌半腱肌的趋势;小尾寒羊呈现半腱肌胸肌背最长肌的趋势。从品种间MyoD基因mRNA表达水平来看,在3组肉羊胸肌部位均有表达,且表达量差异均显著(P0.05);3组肉羊半腱肌部位均有表达,乾华肉用美利奴羊与杂交羊表达量差异不显著(P0.05),乾华肉用美利奴羊与小尾寒羊表达量差异显著(P0.05),杂交羊与小尾寒羊表达量差异显著(P0.05);MyoD基因mRNA在3组肉羊背最长肌部位均有表达,乾华肉用美利奴羊与杂交羊表达量差异不显著(P0.05),乾华肉用美利奴羊与小尾寒羊表达量差异极显著(P0.01),杂交羊与小尾寒羊表达量差异显著(P0.05)。     

AP-1及其siRNA对心肌细胞中TGF-β_1的影响

采用RNA干扰方法研究转录因子AP-1对TGF-β1的转录调控影响及其对心肌细胞的影响。设计合成两对AP-1基因的siRNA-59和siRNA-60,同时合成与AP-1基因序列无关的siRNA-58,试验设置阴性对照、阳性对照组及干扰组(AP-1-58、AP-1-59和AP-1-60)共5组,使用LipofectantineTM2000转染AP-1siRNA入培养的大鼠心肌细胞,倒置显微镜观察细胞形态;采用实时荧光定量PCR法检测AP-1和TGF-β1在心肌细胞中mRNA水平表达量的变化。结果显示,siRNA-58对AP-1的基因沉默(表达下调)无显著差异(P0.05),siRNA-59和siRNA-60对AP-1的基因沉默(表达下调)有显著差异(P0.05),同时对应siRNA-59和siRNA-60组的TGF-β1基因有显著性下调(P0.05),说明AP-1和TGF-β1的基因表达存在正相关。     

牛HSL基因shRNA干扰载体的构建及筛选

HSL基因所编码的激素敏感性脂酶对脂质代谢具有重要的调控作用,不仅能催化水解脂肪组织中的甘油三酯,还能水解不同组织的胆固醇酯,在机体能量供应和类固醇生成中发挥重要作用。为进一步研究HSL基因功能,本试验设计并构建4个HSL基因shRNA干扰载体,并将干扰载体转染到牛胎儿成纤维细胞中以及和设计构建过表达载体共转染到293T细胞中,转染48 h后,分别检测细胞内牛HSL基因的mRNA和蛋白质表达水平,筛选出具有较高干扰效率的shRNA表达载体。结果表明,在牛胎儿成纤维细胞中,4个shRNA载体在转染48 h后,shRNA-731组细胞中HSL基因的mRNA表达量显著低于shRNA NC对照组(P0.05),且干扰效率最佳;同时,在shRNA载体与过表达载体共转染293T细胞中,HSL基因的mRNA和蛋白表达水平显著低于shRNA NC对照组(P0.05)。本研究为进一步探讨HSL基因功能提供了有效工具,也为研究其与牛脂肪代谢相关关系奠定了理论基础。     

抑制素对绵羊颗粒细胞雌激素和孕酮分泌及相关基因表达的影响

本试验旨在研究RNA干扰抑制素α亚基(Inhibinα-subunit,INHα)基因和添加抑制素A(InhibinA)对绵羊颗粒细胞雌激素(Estrogen,E2)和孕酮(Progesterone,P)分泌及相关基因表达的影响,以探索抑制素在绵羊颗粒细胞E2和P分泌中的作用。从1.0~1.5岁小尾寒羊的卵泡(3~7mm)中分离培养颗粒细胞,分为2个处理组:干扰组(脂质体介导法转染颗粒细胞)和InhibinA添加组(200ng·mL~(-1))。利用ELISA试剂盒检测E2和P的分泌,荧光定量RT-PCR检测E2和P的分泌相关基因(CYP11、3β-HSD和CYP19)的表达量。结果表明,与对照组相比,干扰组siRNA转染颗粒细胞48h后,INHα基因的抑制率达87%,E2和P的分泌量显著降低(P0.05);InhibinA添加组E2和P的分泌水平显著升高(P0.05);干扰组3β-HSD和CYP19的mRNA表达量显著降低(P0.05),CYP11的表达量显著升高(P0.05);InhibinA添加组CYP19、CYP11和3β-HSD的mRNA表达水平均显著升高(P0.05)。综上表明,抑制素在绵羊颗粒细胞中起关键调控作用,通过调节绵羊颗粒细胞类固醇激素的分泌参与调控卵泡发育和排卵过程。     

大肠杆菌与金黄色葡萄球菌对奶牛子宫内膜组织细胞因子表达及损伤程度的影响

本试验旨在研究体外感染金黄色葡萄球菌与大肠杆菌对奶牛子宫内膜组织中细胞因子白介素-6(IL-6)、IL-1β和IL-8的表达及损伤程度的影响。以体外培养的奶牛子宫内膜组织作为研究对象,采用1×10~5～1×10~9 CFU/mL大肠杆菌与金黄色葡萄球菌对奶牛子宫内膜组织进行体外感染,通过实时荧光定量PCR和ELISA方法检测两种细菌刺激后奶牛子宫内膜组织中IL-6、IL-1β及IL-8 mRNA与蛋白的表达量,并用HE染色法观察两种细菌感染后奶牛子宫内膜组织病理学切片。结果显示,1×10~5～1×10~9 CFU/mL大肠杆菌体外感染后,奶牛子宫内膜组织中IL-6、IL-1β和IL-8 mRNA表达量均极显著高于空白对照组(P0.01);金黄色葡萄球菌感染浓度为1×10~5、1×10~6 CFU/mL时,IL-6、IL-1βmRNA表达量极显著高于空白对照组(P0.01),感染浓度为1×10~7 CFU/mL时,IL-6、IL-1βmRNA表达量显著高于空白对照组(P0.05),感染浓度为1×10~6 CFU/mL时,IL-8 mRNA表达量显著高于空白对照组(P0.05),其他感染浓度均与空白对照组无显著差异(P0.05)。奶牛子宫内膜组织感染1×10~5～1×10~9 CFU/mL金黄色葡萄球菌和大肠杆菌时,IL-6、IL-1β及IL-8蛋白表达量均极显著高于空白对照组(P0.01)。相同浓度的大肠杆菌感染奶牛子宫内膜组织后,IL-6、IL-1β及IL-8 mRNA与蛋白表达量均极显著高于金黄色葡萄球菌感染组(P0.01)。HE切片染色结果显示,大肠杆菌感染后仍有部分上皮细胞保留,而金黄色葡萄球菌感染后上皮细胞全部脱落。本试验结果表明,大肠杆菌与金黄色葡萄球菌感染奶牛子宫内膜组织后,引起的炎症反应不同。大肠杆菌感染后,促炎性细胞因子被显著上调,而金黄色葡萄球菌感染后破坏子宫内膜上皮细胞程度更加严重。     

寒冷环境下民猪冷诱导RNA结合蛋白基因的表达变化

为了研究民猪冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)基因组织表达及寒冷环境下表达变化情况,试验采用RT-PCR和Real-time PCR的方法检测CIRP基因在民猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脂肪、背最长肌等器官组织中的表达情况以及寒冷环境下在肌肉中的表达变化情况。结果表明:常温下CIRP基因在所检测的7个器官组织中均有表达,呈组成型表达;寒冷环境下CIRP基因在民猪背最长肌中表达水平显著升高(P0.05)。     

巴马香猪ATP合成酶基因表达发育变化与肉质性状相关性研究

为了探讨ATP5B、ATP5H基因在巴马香猪和长白猪不同生长阶段背最长肌中的表达丰度与肉质性状之间的关系,揭示ATP合成酶基因对肉质的影响,试验采用荧光定量PCR技术分析了不同时期背最长肌中ATP5B、ATP5H基因mRNA表达量。结果表明:ATP5B、ATP5H基因mRNA表达量具有显著的年龄依赖变化,随着年龄的增加而呈下降趋势,在0日龄时明显高于其他日龄。0日龄时巴马香猪肌肉组织中ATP5B基因mRNA表达量显著高于长白猪(P0.05),ATP5H基因mRNA表达量显著低于长白猪(P0.05)。巴马香猪肌肉组织中ATP5B基因mRNA表达量与电导率、剪切力呈显著的负相关性(P0.05),ATP5H基因mRNA表达量与剪切力呈极显著的负相关性(P0.01),与肌内脂肪含量呈显著的负相关性(P0.05)。长白猪肌肉组织中ATP5B、ATP5H基因mRNA表达量与肉色、电导率、剪切力、肌内脂肪含量均无显著的相关性(P0.05)。     

纳洛酮对大鼠大脑皮质c-fos mRNA表达的影响

为研究纳洛酮对小型猪特异性麻醉剂(XFM)麻醉下大鼠大脑皮质c-fos mRNA表达的影响,探讨纳洛酮催醒XFM麻醉大鼠与大脑皮质c-fos基因的关系.将78只SD纯种大鼠随机分为空白对照组、XFM对照组、XFM+纳洛酮组、XFM+生理盐水组,采用实对定量PCR技术检测大脑皮质内c-fos mRNA表达量.结果表明,腹腔注射XFM后引起大鼠大脑皮质c-fos mRNA高效表达,各时期c-fos mRNA表达与空白对照组比较差异极显著(P＜0.01);纳洛酮注射后引起XFM麻醉大鼠大脑皮质c-fos mRNA表达量减少,与XFM对照组比较差异显著(P＜0.01或P＜0.05).结果提示,大脑皮质c-fos基因参与了纳洛酮颉颃XFM的麻醉作用,纳洛酮抑制XFM诱导大鼠大脑皮质c-fos基因表达,可能是纳洛酮催醒XFM麻醉大鼠的重要机理之一.     

β-伴大豆球蛋白通过上调NOD样受体蛋白-3表达诱导猪小肠上皮细胞焦亡

本试验旨在探讨β-伴大豆球蛋白通过上调NOD样受体蛋白-3(NLRP-3)表达诱导猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)焦亡的作用机制。利用慢病毒转染IPEC-J2沉默目的基因NLRP-3,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质印迹法(Western blot)验证目的基因沉默效果。慢病毒转染成功沉默目的基因NLRP-3后,将样本分为4组:A组为对照组(未转染),B组为阴性对照组(转染慢病毒空载体),C组为干扰组(转染携带NLRP-3干扰片段的慢病毒载体),D组为β-伴大豆球蛋白调节组(转染携带NLRP-3干扰片段的慢病毒载体+10 mg/mL的β-伴大豆球蛋白)。利用细胞增殖毒性检测试剂盒检测细胞活性;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)和白细胞介素-1β(IL-1β)含量;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)观察细胞阳性变化;透射电镜观察细胞形态;RT-qPCR和Western blot检测NLRP-3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、Caspase-1、IL-1β和消皮素D(GSDMD)的mRNA相对表达量及蛋白表达水平。结果表明:1)与A组相比,B组的NLRP-3 mRNA相对表达量及蛋白表达水平无显著差异(P0.05)。C组细胞NLRP-3 mRNA相对表达量及蛋白表达水平均极显著低于A组和B组(P0.01)。2)与A组相比,C组细胞Caspase-1含量显著降低(P0.05),IL-1β含量极显著降低(P0.01),NLRP-3、ASC、Caspase-1、IL-1β、GSDMD mRNA相对表达量和蛋白表达水平显著降低(P0.05)。3)与B组相比,C组细胞Caspase-1和IL-1β含量极显著降低(P0.01),NLRP-3、ASC、Caspase-1、IL-1β、GSDMD mRNA相对表达量和蛋白表达水平显著降低(P 0.05)。4)与C组相比,D组细胞活性极显著降低(P 0.01),IL-1β和Caspase-1含量极显著升高(P0.01),TUNEL染色显示细胞呈阳性表达,透射电镜观察可见D组细胞肿胀、细胞膜破裂、胞浆内容物流出,线粒体变性肿胀,NLRP-3、ASC、Caspase-1、IL-1β和GSDMD mRNA相对表达量和蛋白表达水平显著升高(P0.05)。综上所述,β-伴大豆球蛋白上调NLRP-3表达,并通过NLRP-3/Caspase-1/GSDMD信号通路介导IPEC-J2细胞焦亡。     

小型猪复合麻醉剂对大鼠不同脑区LKB1基因mRNA转录和p-LKB1蛋白表达的影响

旨在研究小型猪复合麻醉剂(XFM)对大鼠不同脑区LKB1基因mRNA转录和p-LKB1蛋白表达的影响。将30只SD大鼠随机分成XFM组(M组)和生理盐水对照组(C组),M组又按照时间点的不同分为4个亚组。各组大鼠到达试验设计时间点后分别采取脑组织并分离各脑区,采用PCR和Western blot技术,分别检测各试验组中大鼠不同脑区LKB1基因mRNA的相对表达量和p-LKB1蛋白表达量。结果显示:在试验的麻醉早期阶段(即M1和M2),各脑区LKB1基因mRNA转录与对照组相比均未出现显著变化(P0.05);大脑皮层、海马及小脑p-LKB1蛋白表达与对照组比较并无显著变化(P0.05),而丘脑与脑干p-LKB1蛋白表达与对照组比较则明显升高,且丘脑差异显著(P0.05),脑干差异极显著(P0.01)。而在麻醉后期阶段(即M3和M4)各脑区LKB1基因mRNA转录表达明显上升,尤以M4突出,差异极显著(P0.01),其中丘脑和脑干变化最为明显;大脑皮层、海马及小脑p-LKB1蛋白表达与对照组比较均无明显变化(P0.05),但丘脑和脑干p-LKB1蛋白表达呈现显著升高(P0.05)。研究表明,XFM麻醉作用可能影响大鼠中枢神经系统中LKB1基因mRNA的转录和p-LKB1蛋白的表达。     

黔北麻羊RARRES1基因的克隆表达及功能初步研究

旨在对黔北麻羊视黄酸受体应答蛋白1(retinoic acid receptor responder 1,RARRES1)基因的功能进行初步探究。本研究首先利用PCR扩增克隆得到黔北麻羊RARRES1基因编码的完整序列,应用生物信息学方法分析黔北麻羊RARRES1蛋白理化性质、高级结构、疏水性、氨基酸同源性及亚细胞定位,并构建系统进化树,同时应用qRT-PCR法检测RARRES1基因在单、多羔黔北麻羊不同组织中的表达水平,随后构建目的基因pEGFP-N3-RARRES1真核表达载体与pGPH1/GFP/Neo-RARRES1 RNA干扰载体,并转染至黔北麻羊卵泡颗粒细胞,利用qRT-PCR法从细胞水平检测并分析目的基因真核表达载体与RNA干扰载体对目的基因RARRES1及多胎性状候选基因BMPR-IB mRNA表达的影响。qRT-PCR结果显示,RARRES1 mRNA在卵巢中的表达量最高,单羔组黔北麻羊卵巢组织中的表达量极显著高于多羔组(P0.01)。生物信息学分析表明,黔北麻羊RARRES1基因共编码289个氨基酸,RARRES1是一种定位在细胞质中的亲水性蛋白,蛋白质二级结构分析显示,其主要是由α-螺旋与无规则卷曲构成,三级结构预测与二级结构分析一致;同源性以及系统进化树结果显示,黔北麻羊RARRES1基因序列与绵羊、牛的同源性高、遗传距离近,与鸡的同源性最低、遗传距离最远。经双酶切、测序验证后,表明目的基因pEGFP-N3-RARRES1真核表达载体与pGPH1/GFP/Neo-RARRES1干扰载体构建成功。将各载体转染至黔北麻羊卵泡颗粒细胞后,与空白对照相比,重组质粒pEGFP-N3-RARRES1能极显著提高RARRES1与BMPR-IB的表达量(P0.01)。在各干扰载体中,重组质粒pGPH1/GFP/Neo-RARRES1-4的抑制效率最好,能够显著与极显著下调RARRES1与BMPR-IB mRNA在卵泡颗粒细胞中的表达量(P0.05,P0.01)。本研究克隆了黔北麻羊RARRES1基因编码的完整序列并进行了生物信息学分析。将重组质粒pEGFP-N3-RARRES1、pGPH1/GFP/Neo-RARRES1成功转染至黔北麻羊卵泡颗粒细胞并验证其表达变化。结果表明,RARRES1可能对山羊多胎性状具有促进作用,为进一步探究RARRES1基因对山羊多胎性状的调控机理提供依据。     

实验性镉中毒对鸭肝脏金属硫蛋白基因表达的影响

为探讨环境镉污染对鸭肝脏金属硫蛋白(MT)mRNA表达水平的影响。试验选用1日龄健康三穗麻鸭160只,随机分为试验中毒组、中毒免疫组、免疫对照组和空白对照组,在对照组日粮中添加CdCl_2 60 mg/kg作为试验中毒组和中毒免疫组日粮,于第26、52、78、104天随机抽取4组鸭各5只,剖杀后无菌采集鸭肝脏,采用实时荧光定量PCR方法,检测鸭肝组织MT mRNA。试验中毒组鸭肝组织MT基因表达量在26和52 d时极显著高于空白对照组(P0.01),而在78和104 d时与空白对照组差异不显著(P0.05)。表明鸭肝脏MT mRNA表达量随镉浓度增加及暴露时间延长而升高,而当镉浓度持续增加时,暴露时间持续延长,MT表达量不再增加,甚至有下降趋势。