放牧藏绵羊暖、冷季瘤胃VFAs与SGLT1基因表达特征关联分析

旨在探究藏绵羊应对暖、冷季营养供给不均衡以及冷季营养供给严重匮乏的适应机制。本研究对放牧藏绵羊暖、冷季瘤胃挥发性脂肪酸(VFAs)和瘤胃、小肠、大肠组织 SGLT1基因相对表达量进行测定,并进行VFAs与 SGLT1基因表达的相关性分析。结果表明:冷季VFAs含量显著高于暖季(P0.05),除丁酸外,其他VFA含量在暖、冷季均呈显著性差异(P0.05);冷季的乙酸/丙酸(A/P)值显著高于暖季(P0.05)。暖季胃肠道组织的 SGLT1基因表达量均显著高于冷季(P0.05),小肠 SGLT1基因表达量在暖、冷季均显著高于瘤胃和大肠(P0.05)。相关性分析发现,乙酸、丙酸与 SGLT1基因之间呈显著性负相关(P0.05),异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸与瘤胃 SGLT1基因之间呈显著性正相关(P0.05)。因此,由于暖、冷季放牧藏绵羊胃肠道的营养吸收水平不同,暖、冷季瘤胃VFAs含量和 SGLT1基因表达量存在季节差异性,以及瘤胃VFAs与 SGLT1基因间存在显著相关性。表明藏绵羊瘤胃VFAs与宿主的互作关系影响其营养胁迫的适应机制。     

基于高通量测序技术的藏系绵羊瘤胃与粪便微生物群落结构差异分析

为探究藏系绵羊瘤胃和粪便的微生物群落结构特征及差异,以5只6月龄体况相近及体质量为(21.50±0.59)kg的藏系绵羊为研究对象,分别采集其瘤胃液和粪便样品,利用高通量测序技术对16S rRNA基因V3-V4区段进行测序和生物信息学分析。结果表明,从藏系绵羊瘤胃液和粪便10个样品中共获得729 326条原始序列,经过滤后平均每个样品产生(64 145±320)条优化序列,平均长度(435.20±2.78) bp,聚类后共得到1 207个OTU。藏系绵羊瘤胃微生物的Chao 1指数和ACE指数显著高于粪便微生物,而Simpson指数和Shannon指数在两组之间差异均不显著,且两组的菌群结构有显著分化。在门分类水平上,瘤胃中相对丰度最高的优势菌门为拟杆菌门,粪便中相对丰度最高的优势菌门为厚壁菌门;在属分类水平上,瘤胃中相对丰度最高的属为细菌和普雷沃氏菌属_1,粪便中相对丰度最高的属为瘤胃球菌科Ruminococcaceae_UCG_010。对瘤胃和粪便的微生物群落进行功能预测,发现有显著性差异的代谢通路34个,主要富集在代谢、遗传信息处理、环境信息处理和细胞过程方面。说明藏系绵羊瘤胃和粪便的微生物在结构组成、相对丰度,以及基因功能等方面相对稳定且存在较大差异,这可能是不同胃肠道区段涉及的生理功能不同导致的。     

饲粮中小麦颗粒用量对藏羊公羔瘤胃内环境的影响

为分析添加有不同比例小麦颗粒的饲粮对藏羊瘤胃发酵特性、消化酶活性、免疫机能、抗氧化能力及其菌群组成的影响，选择初始体重相近[(21.87±2.35)kg]、胎次一致、体况良好的90日龄高原型藏羊公羔，随机分为3组，分别使用0(CPW)、10%(LPW)、15%(HPW)的小麦替代精料中的部分玉米。试验结束时，各组随机选择试验羊进行屠宰，采集瘤胃内容物，测定其发酵参数、消化酶活性、免疫功能、抗氧化能力和细菌组成。结果显示：CPW组藏羊瘤胃中的乙酸、丁酸含量显著(P<0.05)高于HPW组。CPW组藏羊瘤胃中的α-淀粉酶、纤维素酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶活性显著低于LPW组。LPW组藏羊瘤胃的免疫球蛋白A和免疫球蛋白G显著高于CPW组，但肿瘤坏死因子(TNF-α)的含量刚好相反。HPW组藏羊瘤胃液的总抗氧化能力显著高于CPW组，但过氧化氢酶活性显著低于LPW组。各组藏羊瘤胃中的细菌多样性差异不显著：在门水平上，厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)为优势菌门；在属水平上，F082＿未分类(F082＿unclass...     

藏系绵羊瘤胃古菌季节动态分析

在不同季节分别随机选取3只藏系绵羊,采用PCR-DGGE技术对12只藏系绵羊瘤胃内容物中的细菌区系进行分子生态学分析.对古菌16SrDNA的V2～V4可变区的扩增产物进行DGGE图谱分析、相似性分析和Shannon多样指数分析.结果表明:瘤胃内容物中古菌群落多样性指数冬季与春季间差异不显著(P>0.05),但冬季显著高于夏季(P<0.05),并极显著高于秋季(P<0.01);春季与夏季差异不显著(P>0.05),春季显著高于秋季(P<0.05);夏、秋季之间差异不显著(P>0.05).各季间瘤胃古菌区系组成结构相似性高于94%.冬、春季节,由于牧草中的纤维性物质含量增高,导致瘤胃古菌群落多样性增加,不同季节牧草中粗蛋白和酸性洗涤纤维含量的变化可以引起特异性的古菌群落发育,可能导致不同的优势种群.     

藏系绵羊MSTN基因在不同年龄不同组织的表达定量研究

[目的]研究MSTN基因在藏系绵羊不同年龄、不同组织的表达差异。[方法]根据GenBank已发表序列（NM_001009428．1）设计l对引物,以藏系绵羊组织总RNA为模板,采用实时荧光定量PCR技术（QRT—PCR）分析了MSTN基因在不同年龄阶段的真胃、瘤胃、腿肌和心肌中的基因表达量。[结果]经过内参基因校正后,综合4个组织分析,MSTN基因在6月龄藏系绵羊的相对表达量最高,是12月龄藏系绵羊的2．52倍,是羔羊的2．24倍,是9月龄的1．30倍（尸〈O．05）。且MSTN基因在腿肌中的表达量最高,在其他组织几乎未表达,在腿肌中的表达量是其瘤胃的3984．78倍,是心肌的602．69倍（P〈0．01）。[结论]为MSTN蛋白抗体的正确利用奠定了基础。     

不同月龄鲁西黑头羊瘤胃细菌多样性比较分析

瘤胃是反刍动物重要的消化器官，瘤胃微生物的组成及其多样性直接关系到反刍动物对饲料的消化利用。本研究通过测定不同月龄鲁西黑头羊瘤胃液微生物菌群多样性及组成结构，探索瘤胃微生物发育规律，为鲁西黑头羊高效饲养提供理论依据。结果表明：(1)Shannon指数和Simpson指数各组之间无显著性差异，ACE指数和Chao 1指数3月龄显著低于6月龄和12月龄；(2)拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)为优势菌门，普雷沃菌属(Prevotella)为瘤胃优势菌属，但各类群丰度在不同月龄间存在显著差异；(3)PCA分析显示，3月龄鲁西黑头羊瘤胃菌群个体间差异较小，6月龄与12月龄明显分离，表明菌群结构差异较大。综上，鲁西黑头羊瘤胃菌群在3月龄时相对稳定，随着月龄的增长，群落丰富度有所提高，表明3月龄时瘤胃功能仍在发育。     

HSPA2在牦牛不同组织器官中的表达差异

【目的】探索热休克蛋白70-2(heat shock 70kD protein-2, HSPA2)在牦牛不同组织器官中的表达差异。【方法】选取 3 头 1 岁龄的健康青海高原雄性牦牛为研究对象,在正常生理条件下,于 2013 年 9 月中旬采集不同组织器官（心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑和睾丸）样本。（1）从牦牛不同组织器官中提取 RNA,将 RNA 反转录成第一链 cDNA,参照牦牛 HSPA2 和β-actin 基因序列（登录号为 KC790105.1和 DQ838049.1）设计特异性引物,首先采用 RT-PCR 来验证实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）是否能应用于牦牛不同组织器官中 HSPA2表达差异的测定;然后采用 RT-qPCR 测定牦牛不同组织器官中 HSPA2相对表达量的差异。（2）将牦牛不同组织器官样本 4％多聚甲醛固定,制成石蜡切片,免疫组织化学法测定 HSPA2 在不同组织器官中的分布。采用 Image-Pro Plus 6.0 软件进行免疫组化图像分析,测定 HSPA2 阳性反应物的积分光密度,进行吸光度分析;通过 SPSS 19.0 统计软件,用单因素方差分析进行差异显著性测定。【结果】(1) RT-PCR 结果表明 RT-qPCR 法可用于牦牛不同组织器官中 HSPA2表达差异的测定。实时荧光定量 PCR 结果表明,HSPA2在睾丸中的相对表达量,分别是在脑、肾脏、心脏、脾脏、肺脏和肝脏中的 83.33、97.09、111.11、133.33、222.22和 285.71倍。(2)免疫组织化学结果显示,牦牛睾丸、肾脏、脑、心脏、肺脏、肝脏和脾脏中均有 HSPA2 的阳性表达。其中,在牦牛肾脏皮质肾小管、髓质肾小管,大脑皮质海马CA1区、小脑皮质,心肌细胞,肺泡上皮细胞,肝细胞,脾脏边缘区和红髓中有 HSPA2 阳性反应,着色深浅不等,大部分阳性反应位于细胞质,细胞核阳性反应极少;而在睾丸曲精小管中生精细胞细胞质和细胞核中均有 HSPA2 阳性反应,着色深浅不等;阴性对照组未观察到阳性反应。根据积分光密度值比较得出,HSPA2 蛋白的阳性表达量在睾丸中最高,脑、肾脏、心脏、肺脏和肝脏次之,脾脏最少。【结论】通过基因水平和蛋白水平两个层面的研究,发现 HSPA2 在牦牛各组织器官中存在表达差异;睾丸中 HSPA2 基因和蛋白表达量均高于脑、肾脏、心脏、脾脏、肺脏和肝脏,提示 HSPA2 可能与睾丸的生殖功能密切相关。     

全混合日粮营养水平和粒度对绵羊瘤胃内环境的影响

选24只空怀期小尾寒羊母羊,采用2×2二因子析因试验设计,研究了不同营养水平(A11.0倍中国肉羊饲养标准、A21.5倍中国肉羊饲养标准),不同粒度(B1不粉碎、B2粉碎)全混合日粮(total mixed ration,TMR)对绵羊瘤胃内环境的影响.结果表明:食后2～8h,绵羊瘤胃液pH先降低后升高,在6.21～6.80之间波动,1.5倍营养水平极显著降低了绵羊食后2h和4h的瘤胃液pH(P<0.01),显著降低了绵羊食后6h的瘤胃液pH(P<0.05).在各时间点,采食1.5倍营养水平TMR的绵羊瘤胃液总氮、尿素氮和蛋白氮浓度,极显著高于采食1.0倍营养水平TMR的绵羊(P<0.01).在食前、食后2h和4h,采食含1.5倍营养水平TMR的绵羊瘤胃液氨氮浓度极显著高于采食含1.0倍营养水平TMR的绵羊(P<0.01).在食后2、4、6h,采食粉碎TMR的绵羊瘤胃液氨氮浓度显著低于采食未粉碎TMR的绵羊(P<0.05),但瘤胃液尿素氮浓度变化规律却相反(P<0.05).采食1.0倍营养水平和未粉碎TMR的绵羊瘤胃液挥发性总酸含量极显著高于采食1.5倍营养水平和粉碎TMR的绵羊(P<0.01).据此认为:绵羊饲喂TMR,瘤胃液pH波动范围较小,有利于维持瘤胃内环境的平衡;饲喂1.5倍营养水平TMR,绵羊瘤胃液总氮、氨态氮、尿素氮和蛋白氮浓度升高,促进瘤胃微生物发酵,有利于提高绵羊生产性能.饲喂粉碎TMR,绵羊瘤胃液总氮、蛋白氮和尿素氮浓度升高,氨态氮浓度显著降低,微生物对蛋白的分解减少,过瘤胃蛋白的比例增加,从而提高了蛋白质利用率.     

海藻希瓦氏菌感染对半滑舌鳎肠道菌群结构及相关功能基因表达的影响

[目的]明确海藻希瓦氏菌(Shewanella algae)感染对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)肠道菌群结构及相关功能基因表达的影响,揭示肠道菌群和肠道组织相关功能基因在疾病发生及免疫应答过程中的作用机制.[方法]以致病性海藻希瓦氏菌人工感染半滑舌鳎后,采用16S rDNA高通量测序技术探究其肠道菌群组成结构的变化情况,并利用实时荧光定量PCR检测分析半滑舌鳎肠道组织中参与疾病发生和免疫应答相关功能基因的表达规律.[结果]共测序获得118657条有效序列,按97%的序列相似度聚类后得到6732个OTUs.Alpha多样性分析结果显示,Shannon指数和Chao1指数以感染前(CG)的健康半滑舌鳎最高,在感染后12 h(12hpi)最低;感染海藻希瓦氏菌前后半滑舌鳎肠道优势菌门无明显变化,但不同类群的相对丰度发生变化.在属水平上,Elizabethkingia、曼噬甲壳菌属(Chitin-ophaga)、Brevinema、苯基杆菌属(Phenylobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、乳杆菌属(Lactobacillus)、Marivita和雷尔氏菌属(Ralstonia)的相对丰度在CG半滑舌鳎肠道菌群组成中占比最高,希瓦氏菌属(Shewanella)、Petrimo-nas、Proteiniphilum和Aminobacterium的相对丰度在12hpi的占比最高,食酸菌属(Acidovorax)、芽孢杆菌属(Bacillus)和弧菌属(Vibrio)的相对丰度在感染后24 h(24hpi)的占比最高.半滑舌鳎肠道组织相关功能基因的表达变化表现为:果糖二磷酸醛缩酶A基因(ALDOA)的相对表达量在24hpi时显著高于CG(P<0.05,下同);磷脂酶B1基因(PLB1)、热休克蛋白70 kD蛋白1A基因(HSPA1A)、组氨酸三聚体核苷结合蛋白1基因(HINT1)和γ谷氨酰转移酶1基因(GGT1)的相对表达量显著高于CG和24hpi;海藻糖酶基因(TREH)的相对表达量在12hpi时显著低于CG和24hpi.[结论]半滑舌鳎感染海藻希瓦氏菌后其肠道菌群多样性降低、菌群结构发生变化,肠道组织中免疫功能相关基因(HSPA1A和HINT1)及代谢功能相关酶类基因(ALDOA、PLB1、GGT1和TREH)呈差异表达,说明海藻希瓦氏菌感染引起半滑舌鳎肠道微生态紊乱,且肠道组织中免疫功能相关基因和代谢功能相关酶类基因分别参与机体的免疫应答及疾病发生过程.     

口服金霉素微囊化颗粒对绵羊瘤胃微生物菌群数量的影响

目的 评估口服自主研制的金霉素微囊化颗粒对绵羊瘤胃微生物菌群数量的影响。方法 选取体质量（29.0±2.3） kg、6月龄左右、体况良好的18只绵羊,随机分为6组,包括1个空白对照组和5个给药组,每组3只。空白对照组只饲喂基础饲粮;5个给药组分别为试验I组：基础饲粮＋普通金霉素预混剂颗粒,试验II组：基础饲粮＋氢化油处方组金霉素微囊化颗粒,试验III组：基础饲粮＋PEG4000/单甘脂(质量比为5∶5)处方组金霉素微囊化颗粒,试验IV组：基础饲粮＋氢化油/单甘脂(质量比为9∶1)处方组金霉素微囊化颗粒,试验V组：基础饲粮＋氢化油/单甘脂(质量比为8∶2)处方组金霉素微囊化颗粒。给药组绵羊金霉素最终给药剂量均为25 mg/kg,每天给药1次且均在晨饲前灌胃给药,连续给药5 d,通过瘤胃液采样器采集瘤胃内容物。采集的瘤胃内容物经4层纱布过滤后,收集滤液装于冻存管内,所有样品经液氮速冻后置于?80 ℃保存,运用实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术对绵羊瘤胃液相瘤胃微生物进行定量检测。结果 与普通金霉素预混剂颗粒相比,氢化油/单甘脂(质量比为9∶1)处方组金霉素微囊化颗粒有较好效果,只显著增加了产琥珀酸拟杆菌的数量,对绵羊瘤胃其他微生物菌群数量影响均不显著;与空白对照组相比,氢化油/单甘脂(质量比为9∶1)处方组金霉素微囊化颗粒及PEG4000/单甘脂(质量比为5∶5)处方组金霉素微囊化颗粒有相对较好效果,分别只对牛链球菌及产琥珀酸拟杆菌的数量有显著降低趋势,对绵羊瘤胃其他微生物菌群数量影响均不显著。结论 氢化油/单甘脂(质量比为9︰1)处方组金霉素微囊化颗粒对绵羊瘤胃微生物数量抑制作用较小,符合临床应用要求。