牛脂联素cDNA全基因序列的克隆

[目的]体外克隆牛脂联素基因的编码全序列。[方法]以成牛尾部脂肪的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得牛脂联素基因cDNA的全序列,将其克隆到原核表达载体PMD18-T中,筛选出阳性克隆,提取重组质粒,通过限制性内切酶酶切鉴定和重组质粒PCR鉴定后对其进行测序。[结果]从牛尾部脂肪组织总RNA中扩增得到671bp的目的条带,该cDNA序列与GenBank中牛脂联素基因序列同源性为100％,其氨基酸同源性也达到100％,确定为目的基因。[结论]该研究为进一步研究牛脂联素基因的功能和研究牛脂联素基因的表达与育肥牛的脂肪代谢的关系提供了试验基础。     

文昌鸡中脂联素受体CDH13基因的表达

以文昌鸡为实验材料,利用RT-qPCR的方法检测在文昌鸡不同组织及腹部脂肪组织生长发育过程中CDH13的表达情况,为鸡CDH13基因的功能研究奠定基础。研究结果显示,CDH13基因在心脏、回肠、脂肪组织、小脑及肌胃中表达量较高,脂联素表达情况与之相似;CDH13基因在文昌鸡腹部脂肪组织生长发育过程中均稳定高表达,并育肥4周龄时,表达量达到最高。     

广西巴马小型猪脂联素受体1和受体2 cDNA的克隆及序列分析

[目的]克隆并分析广西巴马小型猪脂联素受体1（AdipoR1）和脂联素受体2（AdipoR2）编码基因的cDNA全序列。[方法]利用RT-PCR法,以骨骼肌总RNA为模板,分别扩增AdipoR1和AdipoR2全长cDNA序列,纯化后连接pMD 18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆体,鉴定后测序,并与其他物种AdipoR1和AdipoR2 cDNA序列进行同源性比较。[结果]RT-PCR扩增得到大小与AdipoR1和AdipoR2基因编码序列大小相同的片段,片段长度为1 128和1 161 bp。同源性比较分析发现,广西巴马小型猪AdipoR1和AdipoR2cDNA序列与GenBank中已报道的家猪脂联素受体同源性分别高达99.8%、99.7%,分别有1处和3处发生了碱基错义突变。[结论]该试验成功克隆了广西巴马小型猪AdipoR1和AdipoR2基因的cDNA,为进一步研究AdipoR基因的生物功能及设计以AdipoR为靶标的新型药物奠定了基础。     

兰州大尾羊PPARG全长cDNA克隆及生物信息学分析

【目的】克隆兰州大尾羊过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARG）基因,分析其序列及编码蛋白的生物学特性,阐明PPARG基因在绵羊中的生物学作用,为生产应用提供理论依据。【方法】根据绵羊PPARG基因CDS序列设计特异性引物,利用RACE和RT-PCR技术克隆获得兰州大尾羊PPARG基因序列,结合生物信息学方法分析其生物学特性。【结果】克隆获得兰州大尾羊PPARG cDNA 序列全长1 774 bp（GenBank序列号：KF727439）,其CDS区片段长1 428 bp,编码475个氨基酸,编码区两侧翼分别具有5’-UTR 131 bp（1-131 nt）和3’-UTR 214 bp（1 560-1 774 nt）。预测兰州大尾羊PPARG蛋白分子量为54.40 kD,理论等电点为4.94。预测PPARG编码蛋白疏水性最大值为3.600,最小值为-2.744,为非跨膜的疏水性蛋白。亚细胞定位主要在细胞质（65.2%）和细胞核（21.7%）中,少量作用于细胞支架（4.3%）和过氧化物酶体（4.3%）,无信号肽,不属于分泌蛋白。预测其氨基酸序列有26个磷酸化位点,无糖基化位点,含有1个ZnF_C4结构域、1个HOLI结构域和1个LCR结构域,二级结构以随机卷曲为主。同源性分析显示兰州大尾羊PPARG核苷酸序列与山羊、野牛、水牛、绵羊、虎鲸、野猪和人类核苷酸序列间的同源性分别为99% 、98% 、97% 、99%、 94%、92%和90%,兰州大尾羊PPARG氨基酸序列与山羊、野牛、水牛、绵羊、虎鲸、野猪和人类核苷酸序列间的同源性分别为100% 、99.8% 、100% 、100%、 98.7%、98.5%和97.5%。系统发育树表明,兰州大尾羊与山羊、绵羊和水牛的进化水平更为接近,与鱼类、人类和鼠类较远。其基因第486位发生碱基转换（C←→T）,第828位发生碱基转换（C←→A）,但其所编码氨基酸不变。【结论】兰州大尾羊与其他物种PPARG在结构上相似性较高,说明该基因具有高度的保守性。推测PPARG蛋白大部分在游离核糖体上合成,其功能与过氧化物酶体有关,该预测结果符合其过氧化物酶体增殖物激活受体的身份。PPARG氨基酸序列有26个可以成为蛋白质激酶磷酸化的位点,某些位点被磷酸化后,可导致一系列肥胖相关基因的功能失调和表达变化, 如胰岛素增敏激素,脂联素( adiponectin)的表达减少。其序列包含的ZnF_C4锌指结构域具有与脂质结合的功能,HOLI即LBD配体结构域在激素信号转导过程中发挥重要作用,其中PPARG锌指结构域中的磷酸化位点Ser112,被MAPK磷酸化后,可以抑制PPARG同配体的结合,从而降低PPARG蛋白的活性,两个结构域均与成脂分化过程相关联。文章为进一步研究PPARG在成脂分化过程中的作用提供了参考。     

9月龄兰州大尾羊调查报告

为了进一步探讨兰州大尾羊在半农半牧区的自然放牧条件下的生产性能,丰富大尾羊品种资源的技术资料。并与1982年所测得的大尾羊尾脂重进行比较,调查其尾部性能是否退化,2013年1月7日我们对兰州大尾羊进行了屠宰测试。     

兰州大尾羊转铁蛋白多态性研究

应用聚内烯酸胺凝胶平板电泳技术研究检测了兰州大尾羊血样的转铁蛋白（SerumTransferrin,Tf）多态性,并且计算了各基因型与基因的频率。发现Tf位点上有7个等显性的等位基因．组成了14种基因型。     

兰州大尾羊血红蛋白多态性的研究

采用聚丙烯酰胺凝胶水平板电泳检测了１３只兰州大尾羊的血红蛋白（Ｈｂ），结果表明，Ｈｂ位点存在 ＨｂＡ和 ＨｂＢ两个等位基因，频率分别为 ０．７９３９、０．２０６１，其中 ＨｂＡ为优势基因。存在ＨｂＡＡ、ＨｂＡＢ和ＨｂＢＢ３种基因型，频率分别为０．０５３４、０．３０５３和０．６４１３，其中ＨｂＢＢ为优势基因型。对６６只兰州大尾羊血红蛋白基因型与红细胞压积（ＰＣＶ）的相关分析表明：ＨｂＡＢ型的ＰＣＶ大于ＨｂＢＢ型，但差异不显著（Ｐ＞０．０５）。     

兰州大尾羊血液蛋白多态性研究

为了探明兰州大尾羊的种质和遗传特性,采用聚丙烯酰胺凝胶水平板电泳,检测了131只兰州大尾羊血红蛋白、白蛋白、后白蛋白、转铁蛋白、慢-α2-球蛋白、血清淀粉酶、酯酶、苹果酸脱氯酶的多态性．结果发现,除白蛋白和慢-α2-球蛋白未表现出多态外,其他各蛋白质和酶均不同程度地呈现出多态,其中血红蛋白、后白蛋白、血清淀粉酶、酯酶、苹果酸脱氢酶各有2个等位基因,3种基因型;兰州大尾羊的平均基因杂合度为0．4802,等位基因有效数为1．924,多态座位百分比为0．75．对Nci氏标准遗传距离进行聚类,发现兰州大尾羊与滩羊最近,其次为大尾寒羊和小尾寒羊．青海细毛羊、滩羊、兰州大尾羊、青海藏羊、考湖羊、河北杂种细毛羊、新疆细毛羊、罗姆尼半细毛羊、大尾寒羊、小尾寒羊、兰州大尾羊等11个绵羊品种的基因分化系数为0．07936,这表叫中国的绵羊品种的遗传变异性的92．064％是由遗传多态现象引起的,而7．936％来自品种间差异,即中国绵羊在血液蛋白质水平上的遗传分化程度不高．     

兰州大尾羊染色体组型分析

应用血淋巴细胞微量血培养法对兰州大尾羊的核型进行研究,结果表明兰州大尾羊二倍体染色体数2n=54,由26对常染色体和1对性染色体组成(XX/XY型)。26对常染色体中有3对最大的亚中部着丝点染色体和23对端部着丝点染色体;X染色体为最大的端部着丝点染色体,Y染色体为最小的亚中部着丝点染色体。     

猪脂联素基因启动子克隆及多态性研究

[目的]为脂联素基因作为脂肪沉积候选基因的研究提供依据。[方法]通过猪BAC文库筛选及primer—walking的测序方法获得脂联素基因的启动子序列,采用PCR—RFLP技术对蓝塘猪、大花白猪、大白猪、长白猪和杜洛克猪5个品种共290头猪的脂联素基因启动子区的多态性进行了分析。[结果l脂联素基因的5’侧翼区-1010bp（G／A）的SNP位点,本地猪种中GG基N型频率明显高于外来猪种;-394bp（T／C）的SNP位点,本地猪种基因型分布较为丰富,而在外来猪种申却没有检测到CC基因型,且外来猪中T等位基因频率较高。[结论]脂联素基因上游-1010bp（G／A）的SNP位点突变可能会引起该基因转录水平的改变,而-394bp（T／C）的SNP位点与基因转录水平及与脂肪沉积可能无关．     

二化螟味觉受体基因鉴定、克隆与表达模式分析

【背景】二化螟(Chilo suppressalis)是我国水稻上的重要害虫之一,味觉受体(gustatory receptor,GR)基因在昆虫取食、产卵等过程中发挥重要作用。【目的】基于组学数据鉴定并克隆二化螟GR基因序列,明确其在不同发育阶段和成虫不同组织中的表达特性,为后续深入研究二化螟GR基因的功能打下基础。【方法】结合二化螟转录组数据和其他昆虫的GR基因序列,通过多重序列比对,鉴定二化螟GR基因。利用RT-PCR方法克隆获得二化螟GR基因的完整开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,运用生物信息学分析工具对二化螟GR基因编码的氨基酸序列进行分子生物学特征、结构域等分析;基于最大似然法构建二化螟GR基因蛋白序列与其他昆虫GR基因的系统进化树;利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法分析GR基因在二化螟不同发育阶段(1—6龄幼虫和雌、雄成虫)和成虫不同组织(雌、雄成虫的触角、头、翅、腹、足)中的表达模式。【结果】鉴定并克隆得到5个二化螟GR基因,分别命名为CsupGR1—5,ORF长度为1 122—1 428 bp,编码氨基酸序列长度为373—475...     

广西巴马小型猪脂联素受体1和受体2 cDNA的克隆及序列分析

该试验根据GenBank中普通猪脂联素受体（AdipoR）mRNA序列,利用RT—PCR法对广西巴马小型猪AdipoR基因进行克隆,与NCBI中发表的猪AdipoR序列进行同源性比较,分析广西巴马小型猪AdipoR的cDNA及氨基酸序列结构特点,为进一步从分子水平上对广西巴马小型猪的生长发育提供理论依据,也为日后构建真核表达载体,研究AdipoR基因的生物功能奠定基础。     

脂尾去除对‘兰州大尾羊’和‘蒙古羊’屠宰性能及肉品质的影响

【目的】为研究脂尾去除对‘兰州大尾羊’和‘蒙古羊’屠宰性能及肉品质的影响.【方法】选取年龄和体质量均相近的‘兰州大尾羊’和‘蒙古羊’去势公羔各18只,随机分别对‘兰州大尾羊’和‘蒙古羊’各9只去除脂尾,15月龄屠宰,测定屠宰性状、肉品质和内脏器官指标并进行分析.【结果】脂尾去除对‘蒙古羊’的屠宰性能、肉品质和内脏器官指标的影响不显著(P0.05),‘兰州大尾羊’的背膘厚、GR值分别增加1.41、1.67mm(P0.10),失水率降低0.77%(P0.10)、剪切力减小0.59kg/f(P0.10)、pH1升高0.10(P0.10),均有差异显著的趋势.2个品种间,屠宰性能和肉品质指标除色度、pH24、大理石纹、脾质量和小肠质量无显著性差异外,其他指标均差异显著(P0.05).【结论】脂尾去除可以提高‘兰州大尾羊’的屠宰性能和改善肉品质,‘兰州大尾羊’的屠宰性能和肉品质优于‘蒙古羊’.     

不同月龄‘兰州大尾羊'肉营养成分分析

测定了不同月龄‘兰州大尾羊’背最长肌的水分、灰分、蛋白质、粗脂肪、氨基酸及肉样中Fe、Mn、Zn、Cu、Mg和Ca的含量.结果表明:‘兰州大尾羊’肉中水分含量随着月龄的增加而降低,脂肪含量随着月龄的增加先升高后降低,其中1月龄‘兰州大尾羊’肉的水分和灰分含量最丰富,7月龄脂肪含量最高;‘兰州大尾羊,肉中氨基酸含量丰富且...     

百子莲生长素受体基因TIR1的全长cDNA克隆及功能分析

采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)方法获得百子莲生长素受体TIR1基因cDNA全长序列,对该序列进行生物信息学分析的结果显示,TIR1基因的mRNA序列全长为2 235bp;5’非编码区296bp,3’非编码区172bp;该基因的ORF全长为1 764bp,编码一个含有588个氨基酸的蛋白。百子莲TIR1推导蛋白序列与葡萄(Vitis vinifera)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、高粱(Sorghum bicolor),玉米(Zea mays)等植物均具有较高的同源性,同源性最高的是葡萄,可达78%。系统进化树表明,百子莲与葡萄距离最近。由α-螺旋,随机卷曲和延伸链组成一个磁状结构,为亲水蛋白,疏水性值为-0.092,在百子莲体细胞胚胎发生过程中,实时荧光定量PCR结果表明TIR1基因表达量在愈伤组织中含量最低,在胚性愈伤组织和体细胞胚胎中含量均有所升高,而在体胚幼苗中表达量最高,表明该基因介导的生长素信号在体细胞胚胎发生过程中发挥着非常重要的作用。     

番茄植物络合素合酶基因全长cDNA的克隆及其表达特点

为从分子水平上揭示PCS基因在番茄重金属螯合解毒过程中的作用机制,该研究以番茄(Lycopersi-con esculentum Mill.)品种苏红2003幼苗cDNA为模板,根据NCBI上登录的其他植物的植物络合素合酶基因保守区设计简并引物,利用RT-PCR和RACE技术,克隆番茄植物络合素合酶基因cDNA全长,进一步利用半定量RT-PCR,探讨不同重金属处理后该基因在番茄不同器官中的表达情况。结果显示:番茄植物络合素合酶基因(LePCS1)的cDNA序列长度为1 878 bp,5′非编码区长113 bp,3′非编码区长256 bp。推导该基因编码503个氨基酸组成的蛋白,其相对分子质量为55 600,等电点6.66。NCBI蛋白质比对结果显示:LePCS1由2个典型的植物络合素亚家族结构域组成,并具有19个可与金属离子结合的半胱氨酸(Cys)残基位点,其中包括4个相邻的Cys-Cys元件(90~91位、350~351位、368~369位和416~417位氨基酸)和11个单一Cys残基(56位、109位、113位、138位、144位、231位、332位、393位、396位、424位和489位氨基酸)。进化...     

兰州大尾羊心脏型脂肪酸结合蛋白（H-FABP） 基因克隆及其同源性比较

【目的】克隆兰州大尾羊心脏型肪酸结合蛋白（H-FABP）基因全长cDNA序列,为研究绵羊H-FABP生物学作用和生产应用提供理论依据。【方法】根据已知哺乳动物H-FABP基因 cDNA 序列,设计5''和3''特异引物,运用cDNA 末端快速扩增（RACE）技术获得兰州大尾羊H-FABP基因全长 cDNA 序列。【结果】 扩增获得兰州大尾羊5''端425 bp、3''端231 bp片段和 177 bp中间片段,拼接获得748 bp兰州大尾羊H-FABP基因全长cDNA 序列（GenBank登录号：JQ780322）。 兰州大尾羊H-FABP基因ORF长 402 bp,编码 133 个氨基酸。核苷酸序列分析显示兰州大尾羊H-FABP基因序列与大多数哺乳动物相似,但其第66位发生的碱基转换（T←→G）引起所编码的第22位天门冬氨酸（N）不同于其它所有物种的赖氨酸（K）。构建的基因进化树分析结果显示兰州大尾羊与山羊亲缘关系最近。预测兰州大尾羊H-FABP蛋白质的空间结构与山羊和牛H-FABP类似,由2个α螺旋和10个反向平行的β折叠组成,10 个折叠片围成一个桶状结构,疏水性残基位于桶内,用于结合脂肪酸。【结论】克隆了兰州大尾羊H-FABP基因,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

兰州大尾羊尾巴的形态特征与断尾方法研究

采用形态观察与组织切片结合的方法对兰州大尾羊的尾巴的形态特征和组织结构进行了研究,并尝试了一种针对兰州大尾羊的外科手术断尾方法.结果表明:兰州大尾羊尾巴是一个扁平的脂肪袋.尾巴的内部结构由4层构成,由表及里,依次是皮肤层、皮下脂肪层、尾椎周围的肌肉层和中心的尾骨.主要血管在尾椎周围的肌束之间.皮下脂肪层很厚,形成了尾巴的主体.尾巴的轴心是尾椎及周围的肌束.断尾手术的要点是:精确确定切口位置,环形切开皮肤和脂肪,将尾椎及其周围的肌束和血管整体结扎,并将这些组织一次性断离.     

桔小实蝇非典型气味受体 Orco 基因的克隆与表达谱分析

为探讨非典型气味受体基因Orco的功能,采用RT-PCR和RACE方法克隆获得桔小实蝇Bacto-cera dorsalis(Hendel)Orco受体的全长cDNA序列,命名为Bdor/Orco(GenBank登录号为EU621792)。测序结果表明Bdor/Orco开放阅读框全长1 422bp,编码473个氨基酸残基。对其组成成分、疏水/亲水区域、信号肽、蛋白质二级结构,以及分子进化关系等进行了预测与推断,分析结果表明Bdor/Orco与其他昆虫的Orco具有较高的氨基酸序列一致性,特别是C末端。对该基因在桔小实蝇成虫不同组织和发育时期表达量的荧光定量PCR分析,结果表明Bdor/Orco主要是在桔小实蝇成虫触角中表达,头部(去除触角)、雌虫前足和翅中也有较高的表达;桔小实蝇在各个发育时期的表达水平不同,在刚羽化雌成虫中的表达量最高。     

口虾蛄proPO基因全长cDNA的克隆与组织表达

口虾蛄是海湾底拖网渔业中具有重要经济价值的种类,分布广泛.其自然资源日渐衰退,人工育苗技术获得成功后,口虾蛄养殖过程中病害问题及其防治应引起足够的重视.为此,拟通过分子生物学手段研究口虾蛄免疫系统的核心酶——酚氧化酶(PO)的分子结构及该基因的组织表达,从而在分子水平上深入探究其免疫机理.采用反转录PCR(RT-PCR)与cDNA末端快速克隆(RACE)技术从口虾蛄血细胞中克隆了酚氧化酶原(O-proPO)基因,cDNA全长为2436bp,其中开放阅读框为2142bp,编码713个氨基酸.预测分子量为82446Da,等电点(pI)为8.78.该基因与Genbank上登录的斑节对虾、凡纳滨对虾、罗氏沼虾、短沟对虾、日本对虾proPO基因序列具有较高的同源性,分别为82％、76％、76％、72％、70％.序列分析表明O-proPO为proPO家族中的一个成员,其氨基酸序列中含有多个免疫调节作用位点.系统进化分析显示O-proPO与十足目种类的proPO为同一分支的2个亚群,而后于丰年虫的proPO形成一分支.O-proPO基因表达具有组织特异性,在血淋巴和肠中表达,但在血淋巴中表达量明显高于肠.