棘腹蛙TNFα基因的克隆与序列分析

为了解棘腹蛙TNFα基因的相关信息,对棘腹蛙的TNFα基因进行了克隆和序列分析。克隆了全长为936 bp、ORF长度为675 bp的TNFα-Pb基因;对该基因的蛋白质结构分析显示,TNFα-Pb的信号肽由44个氨基酸组成,随后由2个α螺旋,和10个β折叠形成小分子蛋白;系统进化分析发现,TNFα-Pb与两栖类聚为一枝,与高等哺乳动物存在功能分化的可能。本研究为了解棘腹蛙的生物反应调节机制奠定了一定基础。     

我国珍稀两栖动物——棘腹蛙

棘腹蛙在维护自然界的生态平衡中起着重要作用,也是环境监测的指示动物,棘腹蛙对水质、地质、气候等都有较高的要求。为了保护棘腹蛙这个中国珍稀两栖物种,本文从生态学、遗传学、繁殖学、营养价值等方面对棘腹蛙进行了综述,以期为棘腹蛙后续进一步的研究提供参考。     

棘腹蛙Japonicin-pb抗菌肽的分离及表达谱分析

本试验旨在克隆棘腹蛙来源Japonicin-pb,了解该抗菌肽在不同生长温度及组织下的表达规律,为Japonicin-pb的开发提供线索。基于本实验室构建的棘腹蛙皮肤转录组数据库,利用反转录PCR从棘腹蛙皮肤组织中克隆Japonicin-pb前体序列,通过结构域比对的方法分析其结构。利用Real-time PCR检测3种Japonicin-pb在不同生长温度(15、18、21、24、27和30℃)及组织(血液、肌肉、肝脏和皮肤)的表达图谱。结果表明,本试验克隆到3种Japonicin-pb前体序列,结构域比对表明,三者拥有相同的N端信号肽和中间间隔区,长度分别为19、20和12个氨基酸残基的肽序列,命名为Japonicin-1apb、Japonicin-1bpb和Japonicin-3pb。Japonicin-1apb主要在皮肤组织中表达,且表达量随着生长温度的升高而逐渐增加;Japonicin-1bpb在不同组织或生长温度下的表达量差异均不明显;Japonicin-3pb主要在肝脏中表达,且生长温度对其影响不大。这些结果为棘腹蛙源3种Japonicin-pb后续功能研究以及开发应用提供了重要的序列及表达谱信息。     

金黄杆菌感染棘腹蛙的分离鉴定

<正>棘腹蛙又名石坑、石蛙等,隶属无尾目、蛙科、棘蛙属,是我国特有的珍稀两栖动物,主要分布在湖南、湖北、四川以及甘肃等省~([2])。由于环境污染严重、野生栖息地遭受破坏、人类大肆捕杀,棘腹蛙野生种群数量大量减少~([3])。为保护其野生资源,同时满足市场需求,棘腹蛙的人工养殖逐渐受到重视。2014年以来,重庆地区部分养殖场出现大量棘腹蛙出血死亡的病例,给棘腹蛙养殖带来巨大经济损失。本研究拟从患病棘腹     

长白猪TAS2R1基因克隆及序列分析

本研究通过引物合成、PCR扩增、胶回收和测序对长白猪苦味受体基因1(TAS2R1基因)进行序列分析。将测序得到的结果同GenBank中的TAS2R1基因序列进行比对,共发现3处突变位点。分别位于该基因的228 bp、583 bp和712 bp处。其中,在228 bp处由T突变成C,属于同义突变,其编码的氨基酸无变化;在583 bp处由C突变成G,属于错义突变,编码的氨基酸由亮氨酸突变为缬氨酸;在712 bp处由A突变成G,属于错义突变,编码的氨基酸由亮氨酸突变为缬氨酸。通过生物学信息软件DNAMAN分析,发现其与GenBank中的TAS2R1基因序列一致性达99.67%。     

水牛浮舰蛋白2基因克隆及序列分析

试验旨在克隆水牛浮舰蛋白2(Flotillin 2,FLOT2)基因并对其进行生物信息学分析,为揭示该基因在水牛发育繁殖中的作用奠定基础。本研究通过PCR扩增获得了FLOT2基因全长并进行克隆测序,结合生物信息学分析方法,预测及分析其蛋白质结构。结果表明,水牛FLOT2基因编码区长1 287 bp,编码428个氨基酸,3'UTR区长277 bp。多重序列比较分析显示,水牛FLOT2基因核苷酸序列与牛、山羊、绵羊、小鼠、马、猫和人相应序列的相似性分别为98%、98%、97%、90%、93%、92%和92%,系统进化树分析结果表明,FLOT2基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性。对FLOT2蛋白质的分析表明,该蛋白呈弱酸性,无信号肽,细胞亚定位于细胞质中,存在SPFH_flotillin和SPFH_hflk等结构域。microRNA预测结果表明,bta-miR-2438、bta-miR-2379和bta-miR-1777a可能是其3'UTR潜在靶标。研究结果为今后阐明FLOT2基因在水牛繁殖性能中的功能,尤其是在配子及胚胎发生过程中的作用及分子机制奠定了基础。     

棘腹蛙TGF-α基因的克隆与组织表达分析

为了解棘腹蛙TGF-α基因信息和组织表达特性,采用RT-PCR克隆棘腹蛙TGF-α全长序列,发现棘腹蛙TGF-αc DNA全长1 021 bp,开放阅读框为486 bp,编码161个氨基酸,预测分子质量为17.28 k Da,其氨基酸序列与其他物种的相似性为65%~73%;利用实时荧光定量PCR方法对该基因的表达情况进行分析,发现在肝脏和胃脏有较高表达。本研究克隆了棘腹蛙TGF-α并对其组织分布进行了分析,为后期深入挖掘棘腹蛙TGF-α的生物学功能提供了参考。     

棘腹蛙“水肿病”病原的分离鉴定

为了解重庆地区部分棘腹蛙养殖场水肿病病因,并对该病的临床防控提供参考,本研究采集了10只具有水肿病典型症状的2岁龄棘腹蛙成蛙,剖检后从其主要病变组织分离细菌;对分离的优势菌进行培养特性观察和回归致病性试验,同时进行生理生化特性鉴定、16SrDNA序列测定和药敏试验。结果显示,从病蛙腹腔中分离到1株优势菌株并命名为CQWU201501,该菌为革兰阴性无芽胞短杆菌,主要生理生化特性符合弗氏柠檬酸杆菌的指标,16SrDNA序列与弗氏柠檬酸杆菌同源性高达99.5%;药敏试验显示该菌对绝大部分β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类和四环素类药物敏感。综上所述,棘腹蛙水肿病是由弗氏柠檬酸杆菌引起的;该菌对供试的16种药物敏感,仅对头孢唑啉和复方新诺明2种药物耐药,生产上可选择敏感药物治疗。     

双峰驼NGB基因克隆及序列分析

对双峰驼NGB基因进行克隆和序列分析,同时探讨双峰驼NGB的生理功能。在血样中提取双峰驼全基因组,采用分段TA克隆法获得NGB基因,运用多种软件对其基因序列及编码产物的结构、功能进行生物信息学分析。结果表明:双峰驼NGB基因序列全长5 210 bp,存在4个外显子(长度为89 bp、112 bp、120 bp、135 bp)、3个内含子(长度为1 505 bp、618 bp、1 437 bp)以及1个长度为257 bp的CpG岛。对双峰驼NGB肽链分析结果显示,包含所有基本氨基酸,各氨基酸数目相差较大,其中亮氨酸(L)占整个氨基酸组成的13.91%,天冬酰胺(N)占1.32%。双峰驼NGB相对分子质量为17 076.62,pI值5.39,半衰期30 h,不稳定系数56.50;蛋白整体呈现亲水性(-0.108),是可溶性蛋白。双峰驼NGB蛋白二级结构预测结果显示,α-螺旋所占比例76.16%,β-折叠所占比例0%,属于全α类蛋白质。双峰驼NGB在细胞骨架中占33.3%,在细胞质中占33.3%,在细胞核中占22.2%,在过氧化物酶体中占11.1%。双峰驼NGB与人亲缘关系最近(98.01%),与其他哺乳动物亲缘关系也较高(97.35%～94.03%),与斑马鱼亲缘关系较低(55.62%),说明NGB在哺乳动物长期进化过程中趋于保守。双峰驼NGB基因的成功克隆及序列分析,为进一步探究双峰驼应对极端环境过程中NGB基因可能发挥的生理功能提供理论基础。     

动物蓝舌病毒L2基因克隆及序列分析比较

对 15株中国动物蓝舌病毒血清 1型 (BTV- 1)野毒株及 1株弱毒疫苗株 L 2基因进行了克隆和测序 ,并进行了系统进化分析。中国 BTV- 1型毒株分为 2个组 :分离年代最早的 Y86 3毒株 (1979年 )为 组 ;1996年以后分离的 14株毒株为 组。 2组之间的同源性是 91.6 %。 组又分为 4个谱系 ,疫苗株 Vac F45与原始株 V6 5 8分别属于 组的第 1和第 3谱系 ,核苷酸同源性 98.6 %。由此表明 ,中国 BTV- 1型毒株在自然进化及鸡胚传代驯化过程中 ,L2基因发生了遗传变异。     

棘腹蛙生长激素/类胰岛素样生长因子轴关键基因的克隆与序列特征分析

机体的生长激素(GH)/类胰岛素样生长因子(IGFs)轴由GH系统和IGFs系统构成,可促进细胞增殖、调节生长发育、调控生理代谢,在机体生长发育调控方面有着重要作用。为明确棘腹蛙GH/IGFs轴的功能结构和进化特征,为棘腹蛙生长发育调控方面的研究提供理论依据,本试验对棘腹蛙GH、类胰岛素生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)和类胰岛素生长因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)进行克隆并对其序列特征进行分析。结果显示:1)与两栖类模式动物的多重序列比对发现,棘腹蛙GH、IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ的功能结构域严格保守,具有一定的遗传多态性;IGF-Ⅱ的N端呈简缩进化趋势。2)遗传进化聚类分析发现,棘腹蛙IGFs与两栖动物聚为一支,并与硬骨鱼相对近缘,说明IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ进化地位相对原始;棘腹蛙GH则与蛙类、鱼类等水生动物相对近缘,暗示该基因具有趋同进化趋势。3)为进一步明确上述基因的特异性功能位点,利用Swiss-model server软件解析其蛋白质结构,最终确定IGF-Ⅰ的THR52、LEU53、PHE72、PHE73、SER74为潜在的功能分化位点,IGF-Ⅱ的TYR81、LYS82、LYS83为潜在的功能分化位点,GH的PHE208为潜在的功能分化位点。由此可知,棘腹蛙GH/IGFs轴的主要基因相对保守,但与已知模式物种相比,存在潜在的功能分化位点,可作为后期棘腹蛙GH/IGF轴功能研究和遗传进化特征分析的分子靶标。     

鸡抗菌肽LEAP-2基因克隆及序列特征分析

Ⅱ型肝表达抗菌肽(LEAP-2)是近年来在脊椎动物中发现的一种新型抗菌肽,并具有较强的抗微生物活性.本研究旨在以艾维茵肉鸡为实验材料,提取鸡全血DNA,通过PCR方法扩增抗菌肽LEAP-2基因,将PCR产物回收后,转化至克隆载体进行DNA测序,并将测序结果与GenBank公布序列进行对比,用ScanProsite对其蛋白质序列进行生物学信息分析.结果表明:扩增产物为150 bp大小的片段,基因序列与GenBank公布序列同源性高达100％,编码48个氨基酸残基,具有3个结构功能区7个功能位点.本研究为进一步探讨LEAP-2的功能奠定了基础.     

杂交猪IL-2和IL-6全基因克隆及序列分析

为研究杂交猪白细胞介素2(IL-2)和白细胞介素6(IL-6)在机体免疫应答中的作用,将杂交猪外周血淋巴细胞在伴刀豆球蛋白A(Con A)的刺激下进行体外培养后,提取淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR技术扩增出杂交猪淋巴细胞IL-2和IL-6的cDNA,克隆到pMD18-T载体上并测序.测序结果表明:杂交猪IL-2基因核苷酸序列与参考序列的同源性为100%;IL-6基因核苷酸序列与GenBank登录的参考序列的核苷酸同源性在99.8%～100%之间,推导氨基酸同源性在99.1%～100%之间.     

水牛LPIN1基因克隆及序列分析

试验旨在克隆获得水牛脂素1（LPIN1）基因,并对其进行生物信息学分析,为揭示该基因在水牛脂肪沉积、生殖发育和泌乳调控中的作用奠定基础。本研究以水牛卵巢组织cDNA为模板,PCR扩增获得了LPIN1基因CDS区全长后测序,并结合生物信息学分析方法预测及分析蛋白质理化性质、二级结构及三级结构等。结果表明,水牛LPIN1基因编码区长2 793 bp,编码930个氨基酸。MegAlign软件分析显示,水牛LPIN1基因核苷酸序列与水牛（预测）、牦牛、黄牛、山羊、藏羚羊、绵羊、猪、骆驼、人和小鼠LPIN1基因的同源性分别为99.6%、97.9%、97.7%、97.5%、97.4%、97.1%、89.9%、89.8%、86.2%和83.5%;水牛lipin1蛋白氨基酸序列与黄牛、牦牛、山羊、藏羚羊、骆驼、猪及人的同源性分别为99%、99%、99%、99%、94%、94%及90%。应用Mega 5.0软件构建系统进化树发现,水牛与黄牛的亲缘关系最近,其次为绵羊和山羊,LPIN1基因在不同物种及进化的过程中具有高度保守性。对lipin1蛋白分析发现,其二级结构由α-螺旋、β-折叠、T-转角和无规则卷曲组成;蛋白呈弱酸性,无信号肽,亚细胞主要定位于细胞核中,存在Lipin_N、LNS2和AF1Q等结构域,其中Lipin_N、LNS2为保守结构域。     

犬瘟热病毒F基因克隆及序列分析

从犬瘟热病毒检测阳性的3份(KM1、KM2、KM3)病料中进行F基因的克隆测序,并与其他5株代表性参考毒株的同一基因序列进行比较(国内外流行毒株以及疫苗毒株).结果表明,KM1与KM2有95.7%的核苷酸同源性,其氨基酸序列完全相同;KM3株与KM1有1个氨基酸的差异,与参考的5株犬瘟热病毒的F基因核苷酸和氨基酸分析同源性分别为91.1%～96.5%和96.8%～100%.     

沙门菌肠毒素基因克隆及序列分析

研究常见的不同血清型沙门菌肠毒素(stn)基因核苷酸序列之间的差异及其分布情况。根据沙门菌的stn核苷酸序列设计一对引物,应用PCR技术,分别对肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌和鸡白痢沙门菌进行PCR扩增,对扩增产物进行克隆及序列分析,并用所设计的引物检测7种血清型沙门菌(42株)。结果显示,3种沙门菌经PCR均扩增出749 bp的特异条带,DNA序列分析证实,沙门菌的stn核苷酸序列比较保守,42株沙门菌stn的检出率为100%。本试验成功克隆出沙门菌的stn,调查其在不同血清型沙门菌中的分布及序列分析,为进一步研究stn致病机理及研制减毒沙门菌活菌疫苗奠定了基础。     

山羊PNPLA3基因克隆及序列分析

PNPLA3蛋白属于patatin样磷脂酶家族,能够参与脂肪积累和脂肪动员,且该蛋白与肝脏炎症、肝纤维化密切相关.本研究旨在克隆PNPLA3基因序列并进行生物信息学分析,以简州大耳羊为实验对象,屠宰后,采集皮下脂肪组织,Trizol法提取组织总RNA,利用RT-PCR法克隆山羊PNPLA3基因序列,对所获得的序列进行生...     

麦洼牦牛SRY基因克隆及序列分析

SRY是Y染色体上具体决定生物雄性性别的基因片段,是多数哺乳动物性别决定基因之一。本试验采用克隆测序SRY基因并结合生物信息学对其序列进行分析,利用软件Codon W分析麦洼牦牛、普通牛、绵羊、山羊、猪、小鼠、鸡和人该基因编码区的密码子偏好性。克隆测序得到SRY基因序列含1个690 bp的开放阅读框,共编码229个氨基酸;其编码区核苷酸序列与普通牛、绵羊、山羊、猪、小鼠、鸡、人相应序列间的一致性分别为99.9%、93.9%、91.2%、76.5%、43.3%、21.4%、69.1%。经聚类分析,麦洼牦牛首先与普通牛聚在一起,绵羊与山羊聚为一类,这两类相聚后再依次与猪、人、小鼠相聚,最后与鸡聚为一类,其结果与以往的生物学分类结果一致。该基因编码的蛋白质分子式为C₁₁₅₅H₁₈₂₇N₃₅₁O₃₄₈S₁₁,相对分子质量为2655.0,理论等电点PI为9.55,亲水性平均数为-0.855。其密码子偏好性分析显示,T3_s为0.2905、C3_s为0.3240、A3_s为0.3728、G3_s为0.2963,第3位碱基中出现G和C占第3位碱基总量的48%,同义密码子数为61。上述数据表明麦洼牦牛SRY基因编码序列与普通牛、绵羊、山羊、猪、人具有较高的一致性,在物种进化过程中较为保守。该基因对含A的密码子有较高的偏爱性,尽量避开以G结尾的密码子,且其所编码的蛋白质为亲水性蛋白。     

水牛LPIN1基因克隆及序列分析

试验旨在克隆获得水牛脂素1(LPIN1)基因,并对其进行生物信息学分析,为揭示该基因在水牛脂肪沉积、生殖发育和泌乳调控中的作用奠定基础。本研究以水牛卵巢组织cDNA为模板,PCR扩增获得了LPIN1基因CDS区全长后测序,并结合生物信息学分析方法预测及分析蛋白质理化性质、二级结构及三级结构等。结果表明,水牛LPIN1基因编码区长2 793bp,编码930个氨基酸。MegAlign软件分析显示,水牛LPIN1基因核苷酸序列与水牛(预测)、牦牛、黄牛、山羊、藏羚羊、绵羊、猪、骆驼、人和小鼠LPIN1基因的同源性分别为99.6%、97.9%、97.7%、97.5%、97.4%、97.1%、89.9%、89.8%、86.2%和83.5%;水牛lipin1蛋白氨基酸序列与黄牛、牦牛、山羊、藏羚羊、骆驼、猪及人的同源性分别为99%、99%、99%、99%、94%、94%及90%。应用Mega 5.0软件构建系统进化树发现,水牛与黄牛的亲缘关系最近,其次为绵羊和山羊,LPIN1基因在不同物种及进化的过程中具有高度保守性。对lipin1蛋白分析发现,其二级结构由α-螺旋、β-折叠、T-转角和无规则卷曲组成;蛋白呈弱酸性,无信号肽,亚细胞主要定位于细胞核中,存在Lipin_N、LNS2和AF1Q等结构域,其中Lipin_N、LNS2为保守结构域。     

甘南牦牛Lfcin基因克隆及序列分析

利用PCR技术从甘南牦牛基因组DNA中扩增获得了含乳铁蛋白素（lactoferricin,Lfcin）基因的DNA序列,将该DNA序列连接于pGEM-Teasy载体并测序,将甘南牦牛含Lfcin基因的DNA序列与奶牛相应序列进行比对,同时对牦牛、人、小鼠等物种的Lfcin蛋白进行序列分析和进化树分析。结果：试验首次克隆获得了含甘南牦牛乳铁蛋白（lactoferrin,LF）第二外显子的DNA序列（在Gen-Bank中获得登陆号EU247256）,共778 bp,其中LF基因第二外显子长165 bp,编码55个氨基酸,Lf-cin蛋白占25个氨基酸;序列分析结果显示,克隆获得的牦牛DNA序列与奶牛相应序列存在3个碱基的变异;牦牛和奶牛的Lfcin蛋白质序列完全相同;各物种Lfcin蛋白具有较高的同源性,Lfcin蛋白进化树符合物种进化规律。