鸡β-actin基因实时荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank上鸡β-actin基因的序列，在保守区域设计并合成一对引物，采用SYBR Green I染料建立了荧光定量PCR法（real-time PCR）。以常规PCR产物为标准品，建立了标准曲线，并进行了熔解曲线分析。结果表明，标准曲线Ct值检测范围为12~31,扩增效率为95.1%；熔解曲线分析结果显示产物特异的单个峰，其Tm为88±0℃，检测周期从RNA提取到荧光定量PCR结束只需4 h。本试验建立的鸡β-actin基因实时荧光定量PCR法扩增效率高、检测范围广、检测周期短，为β-actin基因作为内参基因进行鸡功能基因与病原基因表达的定量分析奠定了基础。     

内蒙古白绒山羊Hairless基因实时荧光定量PCR标准质粒和标准曲线的构建

根据GenBank中绵羊、牛的Hairless和β-actin基因编码区保守序列,设计特异性引物,提取皮肤组织总RNA,经反转录RT-PCR扩增,产物回收纯化后与pGM-T载体连接,转化大肠杆菌感受态细胞Top10,质粒提取后经酶切、PCR和测序鉴定,获得阳性Hairless、β-actin重组质粒;将阳性重组质粒按103～107拷贝/反应梯度稀释作为模板,进行实时荧光定量PCR,系统软件自动生成标准曲线及回归方程。结果显示,产物熔解曲线峰值单一,说明引物特异性高,且无引物二聚体;Hairless和β-actin基因标准曲线相关系数分别为r2=0.998、r2=0.999,说明线性关系好。重复性试验结果显示,所构建的重组质粒9次同条件扩增Ct值具有良好的重现性,且变异率小于6%（107拷贝/反应除外）,说明标准曲线重复性好。试验成功构建了目的基因Hairless、内参基因β-actin的标准质粒和标准曲线,为实时荧光定量PCR检测绒山羊Hairless基因的mRNA表达水平奠定基础。     

内蒙古白绒山羊Hairless基因实时荧光定量PCR标准质粒和标准曲线的构建

根据GenBank中绵羊、牛的Hairless和β-actin基因编码区保守序列,设计特异性引物,提取皮肤组织总RNA,经反转录RT-PCR扩增,产物回收纯化后与pGM-T载体连接,转化大肠杆菌感受态细胞Top10,质粒提取后经酶切、PCR和测序鉴定,获得阳性Hairless、β-actin重组质粒;将阳性重组质粒按10³～10⁷拷贝/反应梯度稀释作为模板,进行实时荧光定量PCR,系统软件自动生成标准曲线及回归方程。结果显示,产物熔解曲线峰值单一,说明引物特异性高,且无引物二聚体;Hairless和β-actin基因标准曲线相关系数分别为r²=0.998、r²=0.999,说明线性关系好。重复性试验结果显示,所构建的重组质粒9次同条件扩增Ct值具有良好的重现性,且变异率小于6%(10⁷拷贝/反应除外),说明标准曲线重复性好。试验成功构建了目的基因Hairless、内参基因β-actin的标准质粒和标准曲线,为实时荧光定量PCR检测绒山羊Hairless基因的mRNA表达水平奠定基础。     

番鸭IFN-α mRNA实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中鸭IFN-α基因(GenBank登录号:JF894229)序列设计并合成引物,并以鸭β-actin基因(GenBank登录号:GU564232)为内参,采用SYBR Green I染料法,建立检测鸭IFN-αmRNA的实时荧光定量Real-time PCR方法(RT-PCR)。将IFN-α和β-actin基因分别克隆至pMD18-T载体上,鉴定出阳性重组质粒为标准品(p-IFN-α和p-β-actin),分别建立番鸭IFN-α和β-actin实时荧光定量RT-PCR方法。结果表明,Ct值在13.27~27.54与11.86~25.32范围内呈现良好的线性关系,相关系数均大于0.99(r>0.99),扩增产物的熔解曲线分析均各自只出现1个特异性单峰,无引物二聚体,Tm值分别为(93.6±0.26)℃和(85.3±0.15)℃,最低检测限分别为9.37×102copies/μL和3.71×101copies/μL,检测周期从样品的处理到荧光定量PCR结束仅需4 h左右。本研究建立的鸭IFN-α基因实时荧光定量PCR灵敏度高、特异性强、检测周期短,为番鸭IFN-αmRNA的定量分析奠定了基础。     

鸡MyD88、TRIF和TIRAP基因荧光定量PCR检测方法的建立

为对鸡髓样分化因子88(MyD88)、包含TIR结构域的IFN诱导连接蛋白(TRIF)和包含Toll/IL-1的接头蛋白(TIRAP)基因的进行定量检测,本研究参考鸡MyD88、TRIF和TIRAP基因序列,设计并合成特异性引物,以β-actin为内参基因,建立检测对应基因的实时荧光定量PCR方法.结果表明,4个基因的扩增效率为96.7%～102%,相关系数均在0.997以上;特异性强,扩增产物均形成单一的特异性熔解峰;敏感性高,可以检测到对应基因达10-13g/mL;重复性好,变异系数均在1.5%以下.本研究所建立的荧光定量PCR方法可用于鸡MyD88、TRIF和TIRAP基因表达研究.     

实时荧光定量PCR构建朊病相关细胞因子标准品质粒和标准曲线

为能够用实时荧光定量PCR检测PrP106-126作用的鼠巨噬细胞细胞因子的表达水平,构建目的基因IL-1β、TNF-α、IL-6和内参基因β-actin的标准品质粒和标准曲线。根据GenBank中鼠基因编码区保守序列,设计特异性引物;细胞经PrP106-126作用后,提取总RNA。经反转录、PCR扩增、纯化、连接和转化后,提取质粒并测序鉴定,获得IL-1β、TNFα-、IL-6和β-actin质粒;将质粒梯度稀释,进行荧光定量PCR,获得标准曲线及回归方程。结果显示,产物溶解曲线峰值单一,引物特异性高;标准曲线相关系数r2=0.999,表明线性关系好,成功构建了目的基因和内参基因的标准品质粒和标准曲线。     

鸡内参基因β-actin和GAPDH实时定量PCR重组质粒标准品的构建

本研究从SPF鸡皮肤中提取总RNA,并反转录为cDNA;以该cDNA为模板,通过聚合酶链式反应(PCR)分别扩增出看家基因β-actin和GAPDH,将PCR产物连入pGEM-T easy载体,转化DH5α菌,经蓝白斑筛选和质粒酶切鉴定和DNA含量测定,得到定量的β-actin和GAPDH基因融合的重组质粒(pGEM T-actin和pGEM T-GAPDH),即实时定量PCR内参标准品.构建成功的标准品经10倍梯度稀释,作为模板,获得扩增效率良好及可信度高的标准曲线.构建成功的标准品可大量制备,可用于鸡的靶基因定量PCR所需的内参标准品.     

雏鸡肠组织β1基因的鉴定及时空表达特性

设计1对引物,建立RT—PCR方法对β1基因mRNA进行鉴定;以GAPDH基因为内参,建立检测鸡β1基因表达水平的sYBRGreenI实时荧光定量PCR方法,并用此方法测定1～20日龄雏鸡不同肠段组织81基因表达水平。结果显示,从鸡肠组织成功鉴定出β1基因mRNA;检测内参基因GAPDH和目的基因β1的实时荧光定量PCR方法扩增效率一致（扩增曲线斜率差〈0．1）,满足使用比较Ct值法对B1基因mRNA进行相对定量分析的前提;扩增曲线、熔解曲线及凝胶电泳结果提示该方法特异性好。实时荧光定量PCR检测结果表明,1日龄雏鸡十二指肠和盲肠、10日龄雏鸡空肠和直肠、5日龄雏鸡回肠组织中β1基因相对表达量最高。结果表明,鸡肠组织中存在β1基因表达,并在不同日龄不同肠段表达水平存在差异。     

雏鸡肠组织β1基因的鉴定及时空表达特性

设计1对引物,建立RT-PCR方法对β1基因mRNA进行鉴定;以GAPDH基因为内参,建立检测鸡β1基因表达水平的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并用此方法测定1²0日龄雏鸡不同肠段组织β1基因表达水平。结果显示,从鸡肠组织成功鉴定出β1基因mRNA;检测内参基因GAPDH和目的基因β1的实时荧光定量PCR方法扩增效率一致(扩增曲线斜率差<0.1),满足使用比较Ct值法对β1基因mRNA进行相对定量分析的前提;扩增曲线、熔解曲线及凝胶电泳结果提示该方法特异性好。实时荧光定量PCR检测结果表明,1日龄雏鸡十二指肠和盲肠、10日龄雏鸡空肠和直肠、5日龄雏鸡回肠组织中β1基因相对表达量最高。结果表明,鸡肠组织中存在β1基因表达,并在不同日龄不同肠段表达水平存在差异。     

利用荧光实时定量PCR法测定猪肌肉中解偶联蛋白3 mRNA丰度

用SYBR GreenⅠ荧光实时定量PCR技术,以β-actin为参照基因,建立了猪肌肉中解偶联蛋白3(UCP3)基因mRNA丰度的定量分析方法。UCP3基因片段的PCR产物测序与GenBank中该基因的序列一致,定量PCR过程中UCP3的熔解曲线也表明该PCR过程为特异性扩增。猪肌肉样品UCP3 mRNA样品的批内和批间变异系数分别<2%和<11%,标准曲线R2=0.998,线性范围涵盖样品的Ct值。由此,实验建立的猪肌肉UCP3基因mRNA丰度测定方法是可靠的、准确的,可以用于猪肌肉中UCP3 mRNA丰度的测定。     

山羊IL-1β IL-8和Mx1因子实时荧光定量检测方法的建立

根据GenBank羊炎性细胞因子(IL-1β和IL-8)和Mx1保守序列,设计特异性引物,利用SYBR Green I染料法建立实时荧光定量检测方法。将羊IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子基因保守区域克隆到pMD18-T载体,构建标准质粒。分别以标准质粒为模板建立荧光定量PCR反应的标准曲线、熔解曲线。结果表明,羊IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子实时荧光定量检测方法Ct值与标准品呈良好的线性关系,R~2均大于0.990,所有稀释度标准品模板出现特异性熔解峰。应用所建立的方法对山羊痘病毒AV41感染山羊外周血淋巴细胞中IL-1β、IL-8和Mx1 mRNA表达水平进行检测,山羊痘病毒AV41可以刺激机体产生较高的炎性细胞因子。建立的羊IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子荧光定量检测方法,可以为山羊痘病毒感染后分子免疫机制研究奠定基础。     

鸭IL-1β基因实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用

为了建立鸭白细胞介素-1β(IL-1β)基因的实时荧光定量PCR检测方法,并检测鸭机体器官/组织中IL-1β基因转录水平,试验根据GenBank上鸭IL-1β基因序列设计特异性引物,以鸭IL-1β基因克隆质粒为模板,SYBR GreenⅠ为荧光染料,建立鸭IL-1β基因实时荧光定量PCR检测方法,并用该方法检测鸭机体器官/组织中IL-1β基因的转录水平。结果表明:建立的鸭IL-1β基因实时荧光定量PCR方法的熔解曲线为特异性单峰,标准曲线方程为y=-3. 329x+39. 731,扩增效率为99. 7%,相关系数为1,批内重复变异系数小于1. 00%,批间重复变异系数小于2. 00%;实时荧光定量PCR方法的检测敏感性是普通PCR方法检测敏感性的1 000倍;以该方法进行检测发现,鸭的法氏囊、肺脏、肝脏、肌肉、脑、脾脏、肾脏、十二指肠、心脏和胸腺中IL-1β基因mRNA含量分别为428. 45,973. 43,1 394. 19,568. 22,551. 54,839. 91,2 586. 22,1 161. 92,459. 17,3 276. 16 copies/μL,其中胸腺中含量最高,而法氏囊中含量最低。说明试验建立的鸭IL-1β基因实时荧光定量PCR检测方法具有重复性好和敏感性高等特点,可用于鸭机体器官/组织中IL-1β基因转录水平的检测分析。     

牛IFN-α、IFN-β及IFN-γ mRNA实时SYBR GreenⅠ定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立灵敏度高、特异性强、能够快速检测牛α-、β-、γ-干扰素(BoIFN-α、BoIFN-β、BoIFN-γ)mRNA的实时荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank中登录的BoIFN-α、BoIFN-β和BoIFN-γ基因序列,分别在其保守区内设计并合成特异引物,以牛3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)mRNA为内参,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。将BoIFN-α、BoIFN-β和BoIFN-γcDNA分别克隆到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌DH5α内,经PCR及测序鉴定,将得到的阳性重组质粒制备成标准品,建立SYBR Green荧光定量PCR标准曲线并分析溶解曲线,进行灵敏性、特异性和重复性试验。结果表明:BoIFN-α、BoIFN-β、BoIFN-γ和GAPDH基因的Ct值与标准品稀释度在1×101copies/μL～1×107copies/μL内均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.991。熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰,特异性和重复性较好。本研究建立的检测牛IFN-α、IFN-β和IFN-γmRNA的实时荧光定量PCR方法,为牛IFN mRNA水平上的定量分析奠定了基础。     

检测鼠或鼠源细胞中坦布苏病毒荧光定量PCR方法的建立

利用DNAStar对GenBank上发布的坦布苏病毒(TMUV)的E基因进行序列分析,根据分析结果选择其保守区域设计1对特异性引物。按照相同的方法,设计另1对鼠源内参基因β-actin的引物。通过PCR扩增获得E和β-actin的部分片段,分别与pMD18-T载体连接,构建重组质粒,经鉴定、纯化后作为阳性标准品,分别用于实时荧光定量PCR中E基因及内参基因β-actin标准曲线的构建。通过对反应条件进行优化,建立了以β-actin为内参基因的检测鼠或鼠源细胞中TMUV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。该方法对TMUV的最低检出量为10个拷贝,比普通PCR高1 000倍;批内和批间重复性试验的变异系数均小于0.45%;特异性试验的结果表明,该方法只能检测到TMUV的扩增曲线。对50份样品进行检测,该方法的检出率为100.00%(普通PCR为87.50%),并对组织中病毒载量进行了相对定量,进一步说明了该方法的敏感性高,可用于试验样品的检测,为研究该病毒对哺乳动物的致病特性提供特异性的检测方法。     

鸭Toll样受体3实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据鸭Toll样受体3(Toll-like receptor 3,TLR3)的基因序列保守区设计特异性引物,以鸭β肌动蛋白(β-actin)mRNA为内参,建立了一种检测鸭TLR3 mRNA表达水平的实时荧光定量PCR方法。该方法的标准曲线在1×102~1×108copies/μL范围内,具有良好的线性关系,相关系数和扩增效率均在0.9以上。熔解曲线显示,PCR产物为单峰,具有高度扩增特异性。重复性结果表明,该方法组内、组间变异系数均小于3%,最低检测浓度达100 copies/μL。利用该方法检测了TLR3在鸭组织器官中的表达和分布情况,结果表明,TLR3在鸭子的各种组织或器官中均有分布,其中以气管的表达水平最高,而在脾脏的表达水平最低。该检测方法的成功建立为研究TLR3在鸭天然免疫过程中的生物学功能提供了良好的技术手段。     

鸽白细胞介素8基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鸽白细胞介素8（interleukin-8,IL-8）基因实时荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank上公布的鸽IL-8基因序列,在保守区域设计1对特异性引物,以鸽子淋巴细胞提取的核酸为模板扩增鸽IL-8基因部分片段并克隆到pMD18-T载体上。提取重组质粒通过系列制备标准品,建立鸽IL-8基因SYBR GreenⅠ染料法实时荧光定量PCR标准曲线,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,实时荧光定量PCR熔解曲线呈单一熔解峰,试验线性相关系数为1.0,IL-8基因的扩增效率为103%。敏感性结果显示最低可检测到16个拷贝数;用该方法检测其他鸽白细胞介素细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-18）和双蒸水的结果均为阴性。批间、批内变异系数均≤1.52%。因此,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法可用于鸽IL-8 mRNA的检测,为病毒感染宿主细胞后细胞因子表达的定量分析奠定基础。     

鸭IFN-γ mRNA实时荧光定量RT-PCR方法的建立

为建立检测鸭IFN-γmRNA表达的实时荧光定量RT-PCR方法,根据GenBank中鸭IFN-γ基因序列,在保守区域设计并合成一对引物,采用SYBR Green I染料,建立检测鸭IFN-γmRNA的实时荧光定量RT-PCR方法(real-ti me RT-PCR)。试验以PCR产物为标准品,建立标准曲线,随后进行熔解曲线分析和稳定性研究。结果Ct值线性范围为12.0~33.0,相关系数为0.997;熔解曲线显示产物为单特异峰,Tm为82.5±0℃;组内变异系数(CV%)为4.26%;组间试验无显著差异(P>0.05)。建立的检测鸭IFN-γmRNA的Real-ti me RT-PCR方法具有检测范围广、扩增效率高、特异性好、重复性和稳定性良好等特点。     

猪IL-4、IL-6和IL-10 SYBR Green Ⅰ real-time PCR检测方法的建立及应用

为探讨PRRSV感染后机体的体液免疫应答、从分子水平深入研究PRRSV的免疫机制,本研究针对Th2型细胞因子IL-4、IL-6、IL-10以及看家基因β-actin的基因序列分别设计一对特异性引物,构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测IL-4、IL-6、IL-10及β-actin的SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法。该方法线性关系好,各种细胞因子及β-actin标准曲线的相关系数均达到0.997以上;敏感性高,初始模板的检出下限均达到1×101copies/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性好,组内与组间的变异系数均小于3%。应用所建立的方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染仔猪外周血单个核细胞(PBMC)中IL-4、IL-6和IL-10mRNA的表达水平进行了检测。结果表明,本研究建立的real-timePCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于猪Th2型细胞因子的检测及定量分析。     

猪IL-2、IL-12p40和IFN-γ SYBR Green Ⅰ real-time PCR检测方法的建立

针对猪Th1型细胞因子IL-2、IL-12p40、IFN-γ以及管家基因β-actin的基因序列分别设计一对特异性引物,构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测IL-2、IL-12p40、IFN-γ及β-actin的SYBR Green Ⅰ real-ti mePCR方法。该方法线性关系好,标准曲线的相关系数均达到0.997以上;敏感性高,初始模板的检出下限均达到100拷贝/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性好,组内与组间的变异系数均小于3.5%。应用所建立的方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染仔猪外周血单个核细胞中IL-2、IL-12p40和IFN-γ mRNA的表达水平进行了检测。结果表明,所建立的real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好。     

鹅GAPDH实时荧光定量PCR方法的建立

研究旨在建立鹅GAPDH基因的Real-time PCR技术,为鹅功能基因m RNA表达水平的定量分析提供方法学基础。根据Gen Bank上鸭GAPDH基因的序列设计引物扩增鹅全长基因,以全长基保守区作为模板设计引物,采用SYBR GreenⅠ染料建立了Real-time PCR方法,以阳性重组质粒为标准品,建立标准曲线,并进行了熔解曲线分析。结果表明,所建立的方法具有快速、线性范围广以及重复性高等特点,研究结果为鹅GAPDH作为内参基因用于鹅相关基因定量表达分析奠定了基础。