猪瘟病毒表面抗原E2基因的克隆与原核表达

为获得可用于诊断的猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)E2蛋白重组抗原,对CSFV-E2的多个B细胞抗原表位进行重构和表达。将人工合成的E2蛋白多抗原表位基因与p ET-28a(+)载体连接后,转化至宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析蛋白可溶性,His亲和层析柱纯化蛋白并进行抗原性检测。重构后的猪瘟病毒E2基因多抗原表位基因大小约500 bp,PCR、双酶切鉴定结果显示与预期相符;重组蛋白为可溶性表达,大小约23 k Da;Western blot结果显示,重组蛋白可与猪瘟阳性血清发生特异性结合,具有良好的免疫反应性,可作为诊断抗原用于猪瘟病毒感染动物的血清抗体检测。     

猪瘟病毒E2基因主要抗原区的克隆及其原核表达

为研究猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位在机体免疫应答中的作用和特点,试验参照猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)的基因组序列,设计、合成了1对引物,应用RT-PCR方法扩增出长为786 bp的基因片段,命名为zE2,将zE2基因克隆到原核表达质粒pET 32a中,经酶切鉴定后转化大肠杆菌Rosetta(DE3),于37℃、1.0 mmol/L IPTG条件下诱导表达,大肠杆菌菌体裂解产物再经SDS-PAGE和Western-blot分析。结果表明:该基因片段得到较高表达,融合蛋白的分子质量约为48 ku,主要以包涵体形式存在,且具有一定的免疫学活性。     

猪瘟病毒E2基因的克隆及原核和真核表达载体的构建

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的猪的高度接触性传染病,严重危害养猪业的发展.     

猪瘟病毒Erns基因的克隆及原核表达

从猪瘟病毒石门株血液样品中提取总RNA,通过R-PCR对Erns基因进行cDNA扩增,获得了696 bp的片段.将该片段克隆于T-easy载体后进行序列分析,确认PCR产物为猪瘟病毒Erns基因,从阳性克隆中提取质粒,经Bam H Ⅰ和Hin d Ⅲ双酶切,回收产物亚克隆到pET-32a表达载体中,提取质粒后转化BL21(DE3)感受态细胞,并筛选出阳性克隆,经IPTG诱导后通过SDS-PAGE检测出Erns基因的表达.     

猪瘟病毒E2基因的克隆与鉴定

根据猪瘟病毒Brescia株全基因序列设计合成特异性引物对P1/P2对，采用异硫氰酸胍一步法（略加修改），从PK15细胞培养物中提取石门株、兔化弱毒疫苗株、野毒03株及野毒07株猪瘟病毒的总RNA。应用RT-PCR方法成功地扩增出E2全基因组约1273bp的cDNA片断，经电泳证明其大小与推测相符。分别将石门株、兔化弱毒疫苗株、野毒03株及野毒07株的E2基因片段克隆到pGEM-T载体质粒，通过对这4个重组质粒的EcoRI酶切鉴定、直接与套式PCR扩增，并对E2主要抗原区域进行224bp的序列测定，表明E2全基因克隆成功，为E2全序列测定和结构与功能的分析奠定了基础。     

猪瘟病毒E2基因主要抗原区原核表达载体的构建及表达

用RT-PCR技术对猪瘟兔化弱毒C株、石门强毒株(Shimen)、近期地方流行的属于第1群毒株的新疆毒株(XJ)和第2群代表毒株甘肃临洮(LT)株E2基因的主要抗原区进行扩增，均得到约561bp的基因片段；经克隆测序及序列分析，该基因编码187个氨基酸残基，预计蛋白分子质量为21.7ku。将这4个基因分别克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中，经酶切、PCR扩增和测序分析确证其正确插入到表达载体中，阅读框是正确的，从而构建成重组表达载体。重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中，用异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，对表达的蛋白用SDSPAGE电泳、免疫印迹和薄层凝胶扫描分析。结果表明，E2基因的主要抗原区可以在大肠埃希氏菌中表达，表达的蛋白多以包涵体形式存在，表达产物的分子质量约为50．0ku，与理论推测的分子质量一致；薄层凝胶扫描分析表明。表达蛋白约占菌体蛋白总量的20．1％；免疫印迹结果证明，表达的E2蛋白可被猪瘟阳性血清所识别。     

猪瘟病毒云南毒株的分离鉴定及E2基因的原核表达

从云南10个地州15个大型猪场采集到的21份样品中分离得到5株猪瘟病毒。经测序鉴定昆明、玉溪、曲靖地区分离株的核苷酸序列99.99%同源,大理和宝山地区的核苷酸序列99.99%同源,5株分离毒均属于基因二群。5株分离毒在PK-15细胞上的平均毒价约为2×106TCD50/mL,应用荧光抗体染色可以检测到CSFV。通过RT-PCR扩增猪瘟病毒约1 200 bp的E2蛋白全部抗原编码区序列,并将其分别克隆到pMD18-T载体中。序列分析结果表明,5株分离株的E2基因片段为1173bp,与猪瘟病毒Shimen株的核苷酸同源性为82.5%和84.3%,与C-株的核苷酸同源性分别为83.3%和85.4%。将E2基因插入原核表达载体pET-41a(+),转化进BL21(DE3)内进行表达,经IPTG诱导,E2蛋白能在菌体内高效表达,表达量达26.5%,蛋白分子质量约为41kD。本研究为猪瘟诊断抗原及基因工程疫苗的研制打下基础。     

猪瘟病毒蛋白E2、N^pro基因的克隆表达及纯化

克隆了猪瘟病毒（CSFV）石门株E2和Npro基因,并分别插入pGEX-6p-1表达载体中,构建了原核重组表达质粒。经IPTG诱导后,应用SDS-PAGE电泳检测结果表明,重组质粒均得以成功表达。使用超声法破碎菌体获得蛋白,将带有GST标签的融合蛋白进行亲和层析,其中E2和Npro的表达形式分别为包涵体表达和可溶性蛋白表达。将E2变性后重折叠,应用亲和层析法纯化蛋白,Western blot检测发现CSFV蛋白E2能够被CSFV阳性血清识别,具有良好的反应原性,而Npro不能与CSFV阳性血清反应。     

猪瘟病毒贵州流行株E2基因原核表达及其免疫原性的研究

本研究根据GenBank登录的猪瘟病毒Shimen和C株的E2基因序列设计1对特异引物,采集来自贵州的疑似猪瘟病死猪组织,提取总RNA,进行RT-PCR扩增,将扩增产物测序后进行核苷酸序列比较分析.并将RTPCR产物克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒pMD18-T-E2,经双酶切鉴定、核苷酸序列分析后,将E2基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,成功构建猪瘟病毒E2基因原核表达质粒pET-32a-E2,将构建好的原核表达质粒pET-32a-E2转化至宿主菌BL21中,诱导表达目的蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳、Western blot分析,得到了约58 ku的条带,与预期大小相符,进一步提取、纯化目的蛋白,将目的蛋白加入弗氏佐剂免疫小鼠,免疫后采血检测抗体,结果显示目的蛋白能诱导小鼠产生一定抗体水平,该研究为猪瘟亚单位疫苗的研究奠定了基础.     

猪瘟病毒四川分离株E2基因的分子克隆、原核表达及免疫学活性分析

分子克隆猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)四川分离株E2基因,并对其进行原核表达及免疫学活性分析。PK-15细胞培养增殖CSFV四川分离株提取总RNA,运用RT-PCR扩增E2基因,定向克隆构建原核重组表达载体,转化E.coli Rosetta-gami-TM(DE3)plysS,IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达,Western blotting分析表达蛋白的免疫学活性。试验结果表明,成功克隆了E2基因,共1119 bp,包含有编码E2蛋白的完整序列,编码373个氨基酸;成功构建了CS-FVE2基因完整阅读框、主要抗原区原核表达载体pET-E2(pe)、pET-mE2(pe);蛋白质电泳结果显示,成功表达出约45.32、28.49 ku两目的蛋白,而且表达的E2(pe)、mE2(pe)融合蛋白均能被CSFV阳性血清所识别,具有良好的免疫学反应活性。因此,本试验成功获得CSFV四川分离株E2基因,表达出具有生物学活性的E2(pe)、mE2(pe)融合蛋白。     

猪瘟病毒山东惠民分离株E2基因的克隆及表达

从山东惠民某猪场病料中经RT-PCR扩增了猪瘟病毒（CSFV）E2基因,并将其克隆到pMD18-T载体。经序列测定,E2基因核苷酸序列长度为1 065bp,与GenBank中CSFV石门毒株（SHIMEN）、猪瘟兔化弱毒疫苗株（HCLV）、猪瘟ZJ7分离株E2基因核苷酸序列同源性分别为85.1%,84.2%,98.8%;氨基酸序列同源性分别为91.5%,91.5%,98.6%。将E2基因插入到大肠杆菌原核表达载体pGEX-KG,获得重组质粒pKG-E2,再转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导,受体菌能表达大小约为65 000的蛋白。Western blot显示表达的蛋白具有反应原性。     

猪瘟病毒NS23'端基因的克隆与原核表达

从真核表达载体pEGFP-NS2中克隆得到猪瘟病毒(CSFV)NS2 3'端的基因片段,将其克隆到pET-32a载体上,构建出重组表达载体,经IPTG诱导表达.结果表明,克隆了大小为363 bp NS2 3'端的基因,重组载体pET-NS2-C363在大肠埃希菌中以包涵体形式表达,表达产物经SDS-PAGE和Weste...     

广西猪瘟病毒E0和E2基因的克隆及序列分析

通过分析目前广西猪瘟病毒(CSFV)的E0和E2基因特征,为了解广西地区CSFV的分子流行病学、遗传变异及综合防控提供科学依据。试验采用RT-PCR方法,对阳性猪瘟样品进行CSFV的E0及E2基因的扩增,经克隆、测序后,利用DNAStar软件对序列进行比对分析,同时绘制系统遗传进化树。结果表明,从阳性猪瘟样品中成功扩增CSFV的E0及E2基因。序列比对分析发现,GX2毒株与参考毒株的E0基因核苷酸同源性在83.1%~94.1%,其推导氨基酸同源性在85.9%~99.6%;与参考毒株的E2基因核苷酸同源性为81.7%~93.7%,其推导氨基酸同源性为89.0%~97.0%;E0与E2基因均属于基因Ⅱ群。氨基酸变异位点分析表明,E0蛋白的RNase活性区域氨基酸基序位点没有发生变异;E2蛋白中15个位点上的半胱氨酸均未发生变异,但单抗识别位点S734R发生变异。遗传进化分析显示测定的GX2毒株与近年来广西CSFV流行毒株的变异趋势相似,与中国传统疫苗株HCLV、经典强毒株Shimen的同源性较低,亲缘关系较远,与广西近年来的流行毒株GXWZ02株的同源性较高,亲缘关系较近。     

猪瘟病毒E2基因原核表达及间接ELISA检测方法的初步建立

猪瘟(CSF)是猪的一种高度接触性的致死传染病。其病原体猪瘟病毒(CSFV)是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)中的成员,为有囊膜的单股正链RNA病毒。E2蛋白是猪瘟病毒的跨膜结构蛋白,是诱导被感染动物机体产生免疫保护     

猪瘟病毒E0+E2基因的串联表达及多克隆抗体制备

串联表达猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)E0和E2蛋白,并制备多克隆抗体鉴定其免疫原性,为进一步研究亚单位疫苗和猪瘟ELISA抗体检测方法提供材料。应用PCR技术分别扩增CSFV E0和E2基因片段,运用重叠PCR将其串联扩增后克隆至pET-28a载体,构建重组表达质粒pET-28a-E0+E2。通过大肠杆菌表达系统表达重组蛋白E0+E2,切胶纯化后免疫昆明小鼠制备血清,通过间接ELISA方法测定抗体水平,间接免疫荧光(IFA)分析多克隆抗体的免疫原性和特异性。结果显示,37℃,1 mmol/L IPTG诱导条件下,E0+E2蛋白能够以包涵体形式表达,经纯化复性后免疫小鼠,制备的血清能与感染CSFV的细胞特异性反应。在大肠杆菌中高效表达了E0+E2蛋白,制备的多克隆抗体具有较高的特异性和反应性。     

猪瘟病毒E2基因的克隆及分子特性分析

为研究四川地区猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)及E_2基因的遗传变异情况,试验对CSFV阳性病料抽提RNA,通过RT-PCR扩增CSFVE_2基因并将其克隆到pMD18-T载体,经菌落PCR、双酶切、序列测定后利用生物信息学软件分析了E_2基因的分子特性。结果显示,扩增的E_2基因大小为1 125bp,编码375个氨基酸,与GenBank中CSFV GXWZ02、CSFV/2.1、HEBZ、YC11WB、SXYL2006、0406/CH/01/TWN亲缘关系较近,核苷酸同源性分别为98.3%、96.5%、94.7%、92.4%、92.1%和90.9%,而与疫苗株HCLV E_2的同源性较低,为87.6%。密码子偏向性分析显示,E_2基因的ENc值为53.161,密码子使用频率与大肠杆菌、酵母菌和人差异较大的分别有33、25和25个;此外,E_2基因共有34个稀有密码子,且有多个稀有密码子多次串联成簇的情况出现。结果表明,E_2基因在密码子使用中整体上不存在较明显的偏向性,且密码子使用模式更接近真核生物,本试验克隆的E_2基因与疫苗株相比,部分核苷酸出现了变异,但主要抗原域氨基酸未发生改变,该结果为进一步开展CSFV E_2功能研究及后期基因工程苗的研制提供了基础数据。     

猪瘟病毒保护性抗原E2基因的克隆及在原核细胞中的表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ分两段扩增猪瘟病毒（ＨＣＶ）石门株Ｅ２基因,然后对其进行了克隆。利用两个片段重叠部分的单一ＢｇｌⅡ位点,将它们连接成为完整的Ｅ２基因,并克隆到ＰＵＣ１９质粒中,获得重 质粒ＰＨＣＦ２。另设计一对引物,以ＰＨＣＦ２为模板扩增出不含信号肽的Ｅ２基因,然后将其克隆到表达载体质粒ｐＢＶ２２０和ＰＥＴ＿２８ａ（＋）中,获得重组质粒ＰＢＶＥ２和ＰＥＴＥ２,用酶切,ＰＣＲ和序列分析鉴定Ｅ２基因插     

原核表达的猪瘟病毒E2蛋白抗原多肽的复性和纯化

对原核中以包涵体形式高效表达的猪瘟病毒（CSFV）E2蛋白抗原表位区段（mE2)进行了变性、复性与纯化研究。包涵体经超声破菌分离，然后进行变性溶解和复性，复性产物经硫酸铵沉淀浓缩后，利用免疫亲和层析进行纯化。纯化产物SDS－PAGE分析结果表明，其纯度达97％。酶联免疫试验测定的结果显示，与复性前变性蛋白相比，纯化蛋白与CSFV特异的单抗和多克隆阳性血清的反应活性提高了2－16倍。     

鸡传染性贫血病毒VP2基因的克隆和原核表达

从组织病料中提取到的鸡贫血病毒核酸经PCR扩增得到vp2基因,并将其克隆到表达载体pET32a上,重组菌经IPTG诱导,SDS-PAGE分析,结果VP2基因在大肠杆菌中成功表达。以表达产物免疫小鼠4次,制备了抗CAVVP2的多克隆抗体。通过对CAV感染的MSB1细胞做间接免疫荧光试验(IFA),结果为阳性。这表明表达产物保留了CAV相关的抗原性。为进一步研究CIA临床诊断奠定了基础。