多黏类芽孢杆菌抗菌肽的分离纯化及特性研究

试验旨在分离纯化多黏类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）BLCC1-0402代谢产物中的抗菌肽,为抗菌肽制备及其制品检测提供参考。采用离心、不同分子质量卷式膜超滤浓缩、Superdex peptide 10/300GL凝胶过滤层析对多黏类芽孢杆菌发酵上清液进行逐级分离纯化,对不同时段的收集液做抑菌试验,以大肠杆菌O78标准菌株为指示菌,采用打孔法进行抑菌活性检测,比较评价分步层析效果,以Tricine-SDS-PAGE进行分子质量检测。结果显示,通过5和3 ku卷式膜超滤获得的3~5 ku组分蛋白质样品抗菌活性较强;对于3~5 ku组分经凝胶过滤层析分离纯化,纯化后的抗菌肽A3抑菌活性最强,经Tricine-SDS-PAGE小分子多肽电泳检测,已达到电泳纯,分子质量为4 ku;抑菌活性检测结果显示,该抗菌肽A3对大肠杆菌O78标准菌株具有较强的抑菌作用。同时,抗菌肽A3表现出较好的耐热性,90~100 ℃处理15 min,抑菌活性可保持在96%左右;具有较好的酸碱稳定性,在pH 2.0~9.0下,抑菌活性保持在90%以上;经胃蛋白酶作用后抗菌肽A3抑菌活性降低20%,胰蛋白酶作用后抗菌肽A3抑菌活性降低18%,蛋白酶K对抗菌肽A3的抑菌活性几乎无影响。本研究结果表明,分离得到的抗菌肽A3是一种对大肠杆菌O78具有抑菌活性的新型抗菌肽,具有一定的开发潜力,可为下一步抗菌肽的结构分析、理化特性分析等深入研究提供一定参考依据。     

蚯蚓水解液与浸出液对大肠杆菌的抑菌效果

试验利用蚯蚓的酶系统对蚯蚓自体蛋白进行水解制取蚯蚓水解液,采用热刺激的方法制取蚯蚓浸出液,并分别用琼脂平板打孔法测定其对大肠杆菌的抑菌效果。试验结果表明,蚯蚓水解液与浸出液对大肠杆菌的抑菌效果相近。在蚯蚓水解液中含有一定量的抗菌肽类物质并具有较好的抗菌活性。     

家蚕抗菌肽moricin基因的串联表达与切割产物的活性检测

家蚕抗菌肽是蚕体内具有免疫功能的碱性多肽,具有抑制病菌生长和杀伤癌变细胞的作用。以家蚕抗菌肽moricin为研究对象,经密码子优化,设计合成了家蚕抗菌肽moricin基因多拷贝的串联体6×moricin基因,并将其克隆到大肠杆菌原核表达载体pET-28a(+),转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,串联表达了融合抗菌肽6×moricin,且表达量较高。进一步通过盐酸羟胺专一性切割串联表达的融合抗菌肽6×moricin,获得相应的抗菌肽单体。体外抑菌试验验证,切割的抗菌肽moricin单体对革兰阴性菌和革兰阳性菌均有较强的抑制效果,且抑菌圈大小随抗菌肽单体浓度增加而增加。采用基因串联表达技术有望解决抗菌肽对宿主大肠杆菌的抑制作用,为利用生物反应器规模化生产家蚕抗菌肽开辟了新的技术途径。     

牛乳酪蛋白来源新型抗菌肽抗菌活性的初步研究

通过胃蛋白酶水解牛乳酪蛋白得到了一种新的具有抗菌活性的多肽,并进行了初步的抗菌试验。研究采用胃蛋白酶在不同时间条件下水解酪蛋白,测定水解液及其分离物质对不同细菌的抗菌活性。结果表明:2、3、4h胃蛋白酶的酪蛋白水解产生的抗菌肽对多种细菌均具有抗菌活性,尤其是对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌具有很强的抗菌作用,其最小杀菌浓度(MBC)分别是3.69μg/mL和0.157μg/mL,最小抑菌浓度(MIC)与MBC相同。该抗菌肽具有良好的热稳定性。酪蛋白和胃蛋白酶本身无此活性,说明酪蛋白经胃蛋白酶水解可以产生抗菌活性肽。     

抗菌肽Abaecin的表达及生物活性的研究

在枯草芽孢杆菌中表达抗菌肽Abaecin,并鉴定表达产物的生物学活性,以判定其能否开发为口服药物和饲料添加剂。通过Western blot方法检测目的基因表达情况;采用琼脂扩散法检测表达产物的生物活性。结果表明:抗菌肽Abaecin在枯草芽孢杆菌中成功表达,并有效地分泌至细胞外。体外抑菌实验结果表明,表达产物Abaecin对革兰氏阴性菌有抑菌活性,并且在不同温度37～100℃、pH2～9和酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K)的条件下,仍能保持抗菌活性,证实表达产物可以抵抗动物消化系统的降解。枯草芽孢杆菌简便快捷地表达了抗菌肽Abaecin,并且表达产物有开发为口服药物和饲料添加剂的前景。     

猪血中白细胞抗菌肽的提取及体外抑菌研究

为了研究猪血液白细胞抗菌肽对大肠杆菌、鸡源沙门杆菌等的体外抑菌活性,试验采用乙酸萃取、Superdex 30 PG凝胶层析纯化,收集组分并检测抑菌活性。结果表明:猪血液中抗菌肽对大肠杆菌、鸡源沙门杆菌均有良好的抑菌活性。说明该方法可用于猪血白细胞抗菌肽的提取并可抑制上述致病菌。     

枯草芽孢杆菌中表达的Cec Md及其衍生抗菌肽的活性研究

为了检测在枯草芽孢杆菌中表达的Cec Md及其衍生抗菌肽的生物活性,研究采用微生物试验技术,对从枯草芽孢杆菌中表达后纯化出的抗菌肽Cec Md及其衍生抗菌肽CC31、CC34的抑菌效果、热稳定性、最佳抗菌活性的pH值、保存稳定性以及蛋白酶敏感性进行了测定。结果表明:CC31、CC34和Cec Md对大肠杆菌、鸡沙门氏菌和停乳链球菌有抑制作用;对有益菌短乳杆菌、德氏乳杆菌、卷曲乳杆菌、双歧杆菌、毕赤酵母SMD1168、毕赤酵母GS115均没有抑制作用;3种抗菌肽对大肠杆菌、鸡沙门氏菌和停乳链球菌的最小抑菌浓度(MIC)均低于25μmol/L,CC31和CC34对金黄色葡萄球菌的MIC为25μmol/L,低于Cec Md(100μmol/L);CC31和CC34对致病菌的最小杀菌浓度(MBC)均不超过50μmol/L,Cec Md对停乳链球菌的MBC为50μmol/L,对其他3种致病菌的MBC均在75μmol/L以上。CC31和CC34的热稳定性较好,Cec Md在沸水中30 min失去抑菌活性;CC31和CC34在pH值低于6时均活性较好,Cec Md最佳活性pH值仅在4~5之间;3种抗菌肽的最佳保存温度均为-80℃;3种抗菌肽经胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K作用后活性均有所降低,其中蛋白酶K对3种抗菌肽活性影响较弱。枯草芽孢杆菌中表达出的抗菌肽CC31和CC34的抑菌活性与理化特性等方面都好于Cec Md,其中CC31的生物活性最好。     

抗菌肽P3的序列分析及其抑菌活性的测定

为研究抗菌肽P3的生物学功能,试验通过在线软件分析了抗菌肽P3的理化特性、与其他抗菌肽的相似性、二级结构、剪切位点、疏水性、表面极性和抗原性,用琼脂糖扩散法测定了抗菌肽P3的抑菌活性,用倍比稀释法测定了抗菌肽P3的最小抑菌浓度和溶血性。结果表明,抗菌肽P3为疏水性的α螺旋型阳离子多肽,与APD3数据库中抗菌肽Alyteserin-2Ma有最高的相似度,可被9种酶剪切,不具有抗原性,对大肠杆菌、沙门菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌和白色念珠菌有抑菌活性,对鸡红细胞有较低的溶血性。研究结果说明,抗菌肽P3有抑菌活性,可作用于细胞膜,从而导致菌体死亡。     

重组表达抗菌肽Hadrurin抗菌活性分析

为了给表达高活性的抗菌肽Hadrurin提供开发应用的依据,进一步为用基因工程方法生产具有多种生物活性的抗菌肽Hadrurin蛋白提供研究基础,本研究表达获得重组抗菌肽Hadrurin(rHadrurin)蛋白的基础上,将纯化的rHadrurin蛋白进行肠激酶酶切,恢复其天然活性结构。用最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)方法检测抗菌肽Hadrurin在不同剂量、不同pH值、不同保存温度下对鸡致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性及杀菌活性。并以小鼠为动物模型,进行抗菌肽rHadrurind对小鼠的体内保护实验。结果表明抗菌肽rHadrurin对上述细菌的最小抑菌范围为1.32μg/mL～4.32μg/mL,最小杀菌范围为1.77μg/mL～8.54μg/mL,而且-70℃～100℃及在pH3～pH10条件下仍具有高效抗菌活性。240μg/只剂量的抗菌肽蛋白可有效预防保护小鼠免受致死剂量鸡致病性大肠杆菌攻击,320μg/只剂量可达到保护率85%以上。     

重组鲢鱼抗菌肽parasinⅠ原核表达、纯化与抗菌活性

本文旨在构建抗菌肽parasinⅠ大肠杆菌重组表达载体,表达人工重组parasinⅠ,并检测其抑菌活性。根据parasinⅠ的成熟肽序列和大肠杆菌密码子偏好性,人工合成1段57 bp的基因编码cDNA,通过PCR技术构建大肠杆菌重组表达质粒pET32-ParaⅠ,并在parasinⅠ基因5’-端引入Xa因子酶切位点。重组载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株后,在不同温度(37和20℃)条件下对阳性转化子进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。结果表明:IPTG成功诱导了1个21 ku的融合蛋白表达,重组蛋白占菌体总蛋白质的45%～50%。在低温条件下产生的融合蛋白主要以可溶性形式存在。可溶性重组蛋白经亲和层析纯化后,用Χa因子进行酶切,酶切产物经琼脂孔扩散法抑菌活性检测,结果显示其对金黄色葡萄球菌有一定抑制作用。本试验实现了parasinⅠ的重组表达,表达产物经Χa因子酶切后具抑菌活性。     

牛蛙(Rana catesbeiana)蛙皮抗菌肽基因的克隆、测序及其表达

利用RT—PCR的方法从牛蛙皮肤组织中克隆到大小为270bp的片段RCABP，将其克隆到pGEM—T载体，测序获得1个新的碱基序列。将此基因克隆到原核表达载体pQE一80L，获得融合表达质粒pQE一80L／DHFR／ABP，在1％IPTG诱导下进行表达。SDS—PAGE检测表明，重组蛙皮抗菌肽蛋白的表达量占菌体总蛋白的24％，以包涵体形式存在。体外抑菌试验表明，所构建的质粒能在大肠杆菌中表达具有体外抑菌活性的蛙皮抗菌肽，该融合蛋白具有良好的应用前景。     

科尔沁奶牛防御素基因BNBD5原核表达产物的生物活性研究

目的:通过原核表达科尔沁牛防御素BNBD5获得纯化产物,研究其对牛乳腺炎致病菌的抑菌活性。方法:从牛外周血中分离中性粒细胞,提取牛总RNA,将克隆的牛抗菌肽BNBD5基因连接到原核表达载体pET-30a中,经IPTG诱导原核表达,SDS-PAGE鉴定表达结果,并通过大肠杆菌、金黄色葡萄球菌验证抑菌生物活性。结果:成功构建了pET-30a-BNBD5重组载体,经IPTG诱导,pET-30aBNBD5融合表达产物的相对分子质量约为10 ku,与预期的多肽分子质量大小相符,证实已得到重组表达产物,通过抑菌试验可知其对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有抑菌性。结论:获得科尔沁牛防御素BNBD5基因体外表达产物,其对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用。     

基因工程抗菌肽表达条件的优化及生物活性试验

探讨表达条件对重组抗菌肽表达量和抗菌活性的影响.选用SMD1168毕赤酵母菌株表达cecropinB及其串联体基因和cecA-mag(cecropin A前8个碱基和magainin的第9个碱基)的3个突变体基因抗菌肽.对6种重组酵母菌的摇瓶发酵条件,如pH、发酵温度、甲醇的添加量等进行了优化,结果优化后的表达条件可提高重组抗菌肽的表达量和抗菌活性.并从抑菌试验、酸碱稳定性试验、热稳定性试验、体外稳定性试验探讨了其生物学活性.     

抗菌肽基因表达系统研究进展

抗菌肽是生物体产生的一种阳离子短肽,具有天然的抗菌活性。由于抗菌肽具有与传统抗生素不同的作用机制,不产生耐药性,因而具有重要的临床应用价值,可作为新型绿色、安全、环保的饲料添加剂。但是怎样用廉价的方式大量地得到抗菌肽是对它进行深入研究和广泛应用的前提,基因重组的方法可能是最经济的获得大量抗菌肽的方法,许多研究对不同来源的抗菌肽进行了重组表达的尝试,涉及的表达系统包括大肠杆菌系统、酵母系统、昆虫系统。针对近年来抗菌肽开发的基因工程策略和实践,尤其是大肠杆菌表达系统和酵母表达系统,文中进行了简要综述。     

抗菌肽Thanatin基因与多角体蛋白Polyhedrin基因的融合表达及产物的抑菌活性分析

为利用大肠杆菌表达系统高效表达抗菌肽Thanatin并避免其抗菌活性对宿主菌的影响,将抗菌肽Thanatin基因与家蚕核型多角体病毒多角体蛋白Polyhedrin基因融合克隆到表达载体pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET28a(+)-Thanatin-polyhedrin,转化大肠杆菌BL21(DE3)中表达。SDS-PAGE检测显示经诱导表达的菌体中有与融合蛋白理论值(35 kD)相符的目的条带。凝胶扫描分析目的融合蛋白以包涵体的形式表达,且诱导后6 h融合蛋白的表达量最大,约占菌体总蛋白量的30%。纯化融合蛋白用盐酸羟胺切割后初步纯化获得具有抗菌活性的Thanatin蛋白。研究结果表明家蚕核型多角体病毒多角体蛋白能够作为抗菌肽Thanatin融合标签介导其高水平表达,有助于利用基因工程技术大规模生产抗菌肽Thanatin。     

抗菌肽基因表达系统的研究进展

抗菌肽是生物体产生的一种具有抗菌活性的小分子肽,具有天然的抗菌活性.目前,基因重组的方法是获得大量抗菌肽最经济的方法.本文就抗菌肽基因表达系统作一综述,包括大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统等.     

猪蛔虫抗菌肽Cecropin P2 基因的真核表达及表达产物的抗菌活性研究

为获得猪蛔虫抗菌肽Cecropin P2基因并研究其抗菌功能,根据CecropinP2成熟肽的编码基因,人工合成3条寡聚核苷酸片段,经PCR获取Cecropin P2基因序列,成功构建了重组表达质粒pPIC9 K-Cecropin P2-His6并转化毕赤酵母GS115感受态细胞。转化子经MD、MM以及G418筛选,1%甲醇诱导表达,利用Tris tricine-SDS-PAGE对表达产物进行检测。体外抑菌试验表明,获得的重组蛋白对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有较好的抑菌活性。本试验为抗菌肽的应用和新抗菌肽类药物的开发提供了必要的试验基础。     

重组猪蛔虫抗菌肽cecropin P1在毕赤酵母中的表达及抑菌活性

根据已发表的蛔虫抗菌肽cecropin P1基因编码序列设计引物,采用RT-PCR方法从猪肠道蛔虫中扩增出cecropin P1基因,并将其插入到酵母分泌型表达载体pPIC9K中α-因子信号肽下游的SnaBⅠ和NotⅠ位点之间,构建成cecropin P1基因的酵母分泌型表达载体pPIC9K/cecropin P1。载体经SalⅠ酶切线性化,电转化到组氨酸缺陷型的酵母宿主菌GS115中,然后利用以葡萄糖为碳源的培养基（MD）和以甲醇为碳源的培养基（MM）筛选出组氨酸His＋型和甲醇利用正型（Mut＋）酵母重组体,再经G418加压筛选得到高拷贝cecropin P1基因的重组酵母。经PCR检测证明cecropin P1基因已整合到毕赤酵母的染色体中。重组酵母经摇瓶发酵培养和甲醇诱导,通过Tricine-SDS-PAGE检测,重组酵母能够分泌表达重组cecropin P1,同时表达的cecropin P1对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑菌活性。     

酿酒酵母表达基因工程抗菌肽Pa-AMP05的抗菌活性研究

本实验采用琼脂扩散和稀释法,对发酵得到的基因工程抗菌肽Pa-AMP05的抗菌活性进行研究,结果表明,抗菌肽Pa-AMP05具有较强的抑制大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的活性,对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)为15.625μg/mL,对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)为31.25μg/mL;且其浓度与抗菌活性呈线性正相关。     

白僵菌诱导家蚕抗菌肽enbocin1基因的表达特征及产物的抗真菌活性

家蚕的抗菌肽家族基因enbocin1是蚕体免疫系统相关基因。为解析家蚕对病原真菌感染免疫应答反应的分子机制,采用实时荧光定量PCR检测抗菌肽基因enbocin1在家蚕5龄幼虫感染球孢白僵菌(Beauveria bassiana)后的时空表达模式,结果显示:enbocin1主要在幼虫脂肪体中显著上调表达,而且持续至感染诱导后30 h,感染后8、30 h的表达水平分别上调了约44倍和6倍;在马氏管、体壁中该基因的诱导表达差异不显著,在血淋巴中几乎检测不到该基因的表达。进一步用原核表达系统成功表达并纯化获得了高纯度的重组家蚕抗菌肽enbocin1,体外抑菌试验表明其对白僵菌具有较强的抑菌活性,且重组enbocin1蛋白浓度与抑菌活性之间具有量效关系。用重组enbocin1蛋白制备了效价达1∶30 000的多克隆抗体,可用于进一步深入研究enbocin1的功能及其作用机制。研究结果提示抗菌肽enbocin1在家蚕抵御真菌感染的过程中可能具有重要作用。