锦鲤疱疹病毒-CJ株ORF25基因的克隆及生物信息学分析

为了解锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF25蛋白的结构特征和进化关系,采用框镜鲤尾鳍原代细胞增殖KHV-CJ,提取其DNA,经PCR扩增,获得ORF25基因,将其克隆到pMD18-T载体中,构建重组质粒。应用生物信息学方法初步分析KHV-CJ ORF25基因的结构和功能,并与GenBank上已公布的三株KHV构建系统进化树。结果显示,获得了长1824 bp的ORF25基因,编码608个氨基酸;预测ORF25基因编码蛋白的理论分子质量为66825.44 Da,等电点为7.947;抗原表位预测显示抗原性良好;编码蛋白存在6个N-糖基化位点、25个O-糖基化位点和28个磷酸化位点;系统进化树分析显示,与锦鲤疱疹病毒美国株属同一分支。     

锦鲤疱疹病毒-CJ株ORF124基因的克隆及生物信息学分析

为研究我国锦鲤疱疹病毒的基因背景信息,从锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ株)获得ORF124基因,应用生物信息学方法分析KHV-CJ株ORF124基因结构和功能,并与Genbank上已公布的三株KHV进行比较分析.结果显示,ORF124基因的理论分子质量为31221.96 Da,KHV-CJ株与其他三株KHV同源性均为99％;信号肽切割部位最可能位于24位的T(苏氨酸)和25位的V(缬氨酸)氨基酸之间;ORF124基因无跨膜区;氨基酸序列不存在潜在的N-糖基化位点、11个潜在的O-糖基化位点和7个磷酸化位点.该蛋白的表面抗原决定簇位点区域广泛、峰值高,预示该基因可作为基因工程疫苗的重要候选基因.     

锦鲤疱疹病毒-CJ株ORF56基因的真核表达及生物信息学分析

为了解锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF56基因的结构和序列特征,试验采用锦鲤尾鳍原代细胞增殖培养KHV-CJ,提取DNA,以其为模板经PCR扩增获得ORF56基因,将该基因克隆到PVAX表达载体上,构建重组质粒PVAX-ORF56,并体外表达重组质粒,对KHV-CJ ORF56基因序列与GenBank上已知的对应基因序列进行比对,应用生物信息学方法初步分析KHV-CJ ORF56基因的结构和功能。结果表明:成功克隆出KHV-CJ ORF56基因;双酶切鉴定显示,目的基因与PVAX表达载体连接;体外表达重组质粒可见绿色荧光;与GenBank上已知序列比对显示,同源性达到99.9%;该基因序列信号肽切割部位最可能位于第26位的组氨酸和谷氨酸之间,没有跨膜区,最大疏水指数为2.174,最小疏水指数为-0.334,其抗原表位主要集中在第1～27,54～143,156～223,254～295位氨基酸。说明KHV-CJ ORF56基因是较好的抗原候选基因。     

猪PPAR α蛋白的生物信息学分析

笔者为了探究PPAR的结构和生物学功能,利用生物基因组学数据库,对猪PPAR的氨基酸序列进行初步的生物信息学分析。结果表明,猪PPAR基因编码468个氨基酸,平均分子质量为52.17k Da,为不稳定的亲水蛋白;该蛋白不存在信号肽和跨膜结构域,包含9个潜在的O-糖基化位点和28个磷酸化位点;二级结构由α螺旋、β转角、延伸链和随机卷曲组成;该蛋白具有Zn-C4和HOLI两个功能结构域;系统进化分析显示,猪与猫、犬的亲缘关系最近。     

猴源葡萄糖调节蛋白78生物信息学分析及其真核表达

试验旨在探究葡萄糖调节蛋白78（glucose regulatory protein 78,GRP78）基因的理化性质和结构特点,阐述GRP78在猪流行性腹泻病毒复制中的分子伴侣作用和调控机制。通过RT-PCR方法扩增GRP78基因,并插入到pMD20-T Simple载体进行克隆测序,利用生物信息学方法对其氨基酸序列、跨膜结构、糖基化位点、磷酸化位点、三级结构等进行预测和分析。将GRP78基因插入pCDNA 3.1中,然后转染Vero-E6细胞。Western blotting检测Vero-E6细胞中GRP78的表达。生物信息学分析结果表明,GRP78基因全长1 965 bp,编码654个氨基酸,蛋白质分子质量为72.33 ku,理论等电点为5.07,分子式为C₃₁₈₉H₅₁₅₃N₈₆₅O₁₀₁₉S₁₃。遗传进化树分析显示,猴源GRP78基因与双峰驼、犬、猫、大猩猩、蝙蝠、狒狒、猪、马的氨基酸序列同源性为99.5%~99.8%;遗传进化分析显示,大猩猩和狒狒亲缘关系最为接近。跨膜区和信号肽预测结果显示,该蛋白存在信号肽但不存在跨膜结构。GRP78蛋白无N-糖基化修饰位点,存在6个O-糖基化位点、28个磷酸化位点,表明GRP78可能有与激酶磷酸化有关的PKC、PKA特异性蛋白激酶的结合位点,可能参与己糖代谢和单糖代谢。     

天津市锦鲤疱疹病毒PCR检测与序列分析

2017年6月,天津市滨海新区、北辰区等地一些养殖场的锦鲤出现急性死亡,发病3 d后死亡率高达85%以上。病鱼呈现眼部凹陷、烂鳃、内脏出血等临床症状,初步诊断为锦鲤疱疹病毒病。针对锦鲤疱疹病毒(KHV/CyHV)的TK、SphI-5、ORF25、ORF56、ORF81基因设计特异性引物,建立PCR方法进行KHV基因检测。结果显示:死亡疑似病例的KHV检测阳性;测序获得的TK、SphI-5、ORF25、ORF56、ORF81基因片段长度分别为409、300、317、939和156bp,与CyHV-3-J2病毒株基因序列同源性为97.6%～100%。系统发育树分析显示,其与CyHV-3亲缘关系最近,自然聚为一支,最终确定为CyHV-3型。以上研究为锦鲤疱疹病毒病的分子诊断及流行病学调查奠定了基础。     

东串猪FUT2基因CDS扩增、序列分析及组织表达谱检测

猪α-（1,2）岩藻糖转移酶2（FUT2）基因为鞘糖脂生物合成-球系列通路中的重要基因,可能在断奶仔猪抵抗大肠杆菌F18侵染过程中发挥着调控作用。为探究猪FUT2基因的序列结构及其生物学功能,试验采用PCR扩增得到地方猪品种东串猪FUT2基因的CDS全序列,进而预测和分析FUT2基因的蛋白质序列及其功能区域,同时对其在8头35日龄东串断奶仔猪11个组织中的表达水平进行检测与分析。结果显示,FUT2基因的CDS序列全长为1 023 bp,共编码340个氨基酸,FUT2蛋白为脂溶性的亲水蛋白,蛋白结构不稳定,该蛋白存在1个跨膜螺旋结构,但不存在信号肽,表明FUT2蛋白为膜蛋白;FUT2蛋白存在2个N-糖基化位点（185和305位氨基酸）,无O-糖基化位点,此外该蛋白还存在14个潜在的磷酸化位点,包括6个Ser、2个Thr和6个Tyr,对其功能区域进行分析发现,FUT2蛋白存在1个超级家族保守结构域：FUT1-FUT2-like（58-319位氨基酸）;系统进化树结果显示,猪与牛的亲缘关系相对较近,与人、黑猩猩、大鼠和小鼠等亲缘关系相对较远;FUT2基因在东串断奶仔猪11个组织中均有表达,在消化道和免疫组织中表达水平较高。试验结果推测FUT2基因在断奶仔猪抵抗大肠杆菌F18中可能具有一定的作用,且可能是通过合成岩藻糖转移酶间接发挥其抵抗大肠杆菌F18的作用。     

犬瘟热病毒贵州株(CDV-GZ1)F基因的克隆及序列分析

根据GenBank中发表的犬瘟热病毒Onderstepoort株融合蛋白基因(F)序列设计两对特异性引物,采用RT-PCR扩增犬瘟热病毒贵州分离株(CDV-GZ1)的F基因,并进行克隆与序列分析。结果显示,CDV-GZ1株F基因的ORF全长1989 bp,氨基酸序列中具有5个潜在N-糖基化位点,氨基酸同源性与美国00-2601株和国内HL株较高,分别为91.6%和91.1%,表明该分离株与00-2601株和HL株具有较近的亲缘关系。     

绵羊痘病毒甘肃流行株ORF121基因的克隆及序列分析

从甘肃景泰疑似羊痘绵羊的皮肤组织中提取基因组DNA,PCR扩增糖蛋白ORF121基因。序列分析表明,该基因由519个核苷酸组成,编码172个氨基酸,分子量为19.9 kua,序列中A+T含量占74.95%,G+C含量仅占25.05%。甘肃景泰株ORF121基因同绵羊痘病毒参考株之间的核苷酸同源性高达99%;与疙瘩皮肤病病毒和山羊痘病毒参考株之间的同源性分别为97%和95.6%。结构预测结果显示,ORF121蛋白具有两个N-糖基化位点和一个跨膜区,且具有极强的亲水性。以上结果表明,ORF121蛋白在不同的绵羊痘病毒流行株之间非常保守,具有潜在的疫苗或/和诊断价值。     

延边牛PLIN2基因CDS区克隆、生物信息学分析及其表达规律研究

本研究旨在克隆延边牛脂肪分化相关蛋白PLIN2基因完整CDS区,通过生物信息学分析PLIN2基因CDS区序列和蛋白质基本特性,探讨其在延边牛不同组织及前体脂肪细胞成脂过程中的表达规律。选取18月龄去势的延边牛为研究对象,利用RT-PCR和基因克隆获得延边牛PLIN2基因,与其他物种进行同源性比对及系统进化树构建,利用生物信息学方法预测PLIN2编码蛋白质的理化性质、潜在磷酸化位点及糖基化位点、二硫键分析、信号肽、亚细胞定位、蛋白高级结构,利用实时荧光定量PCR检测PLIN2基因在延边牛不同组织中的表达水平。结果显示,延边牛PLIN2基因CDS长1 353 bp,编码450个氨基酸;同源性比对发现延边牛PLIN2基因与黄牛、水牛、绵羊、山羊、野猪、人、小鼠和野鸡的同源性分别为100%、98.7%、96.7%、97.1%、85.5%、86.3%、47.3%和49.1%;系统进化树表明,延边牛与黄牛、水牛的亲缘关系最近,与野鸡的亲缘关系最远。PLIN2蛋白为不稳定蛋白,具有一定亲水性,存在61个潜在的磷酸化位点、16个O-糖基化潜在位点、12个N-糖基化潜在位点,存在2个二硫键,不存在信号肽,主要分布于细胞核中,细胞质和线粒体中有少量分布。PLIN2蛋白高级结构预测该蛋白是由α-螺旋、延伸链、无规则卷曲和β-转角组成,为混合型蛋白,通过无规则卷曲连接,以α-螺旋为主。实时荧光定量PCR结果显示,PLIN2基因在延边牛小肠组织中表达量最高,其次为背最长肌和肾脏组织。本研究结果可为进一步研究PLIN2基因的功能提供借鉴。     

绵羊IGFBP-5基因的克隆及序列分析

为了克隆IGFBP-5基因的CDS序列及其生物信息学分析,试验以凉山半细毛羊为研究对象,采用RT-PCR方法克隆了IGFBP-5基因的CDS全序列,并用生物信息学方法深入分析其序列。结果表明:IGFBP-5基因的CDS序列为816 bp,编码271个氨基酸,与牛、人、鼠的CDS同源性分别为97%、94%、89%,氨基酸序列同源性分别为98%、98%、95%,Gen Bank登录号为EU727460.1;IGFBP-5基因的氨基酸分子质量为30.3 ku,理论等电点(p I)为8.56;进化分析显示与牛、山羊等哺乳动物关系较近,与蟾、鱼类等亲缘关系较远;IGFBP-5基因存在明显的疏水性区域和亲水性区域,有1个信号肽、22个磷酸化位点、2个N-糖基化位点和3个O-糖基化位点;二级结构分析显示无规卷曲、α-螺旋和β-折叠区域分别为66.42%、22.51%、11.07%;三级结构分析显示存在IGFBP_N和甲状腺球蛋白-Ⅰ型功能域。     

我国苏皖地区PRRSV Nsp2和ORF5基因的遗传变异分析

为了分析2009年安徽省和江苏省周边地区流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的遗传变异特征,采用RT—PCR方法对该地区分离的22株PRRSV的Nsp2和ORF5基因进行了扩增、克隆和测序,并进行序列分析。结果表明：22株PRRSV均属于美洲型毒株,其中21个毒株的Nsp2存在30个氨基酸的不连续缺失,与高致病性PRRSV有相同的缺失特征;而且此21个毒株的ORF5基因推导的氨基酸序列也发生多处突变,集中出现在毒力相关位点、抗原表位和糖基化位点序列中。只有HZNJ株与疫苗株的同源性较高。进化树分析显示,21个分离株与高致病性PRRSV处在同一进化分支,而HZNJ株与疫苗毒株有较近的亲缘关系,进一步说明高致病性PRRSV已成为该地区的优势流行毒株。     

金堂黑山羊TGFβR1基因克隆及表达分析

为了探讨金堂黑山羊转化生长因子β受体1(transforming growth factorβreceptor 1,TGFβR1)基因的基本特点,克隆了TGFβR1基因,并对其核酸序列及编码蛋白进行分析,同时采用qRT-PCR方法检测TGFβR1基因在金堂黑山羊7种组织/器官中的表达情况。结果表明:克隆获得TGFβR1基因的序列长度为1 715 bp(GenBank登录号为MK397779),其开放阅读框(ORF)长度为1 506 bp,共编码501个氨基酸;在同源性比较中,金堂黑山羊TGFβR1序列与西藏绒山羊的同源性最高,达99.9%;TGFβR1蛋白相对分子质量为55.9 ku,等电点为7.19,预测为亲水性蛋白,其二级结构主要为随机卷曲和α-螺旋,有5个O-糖基化位点、3个N-糖基化位点和50个磷酸化位点。组织表达分析显示TGFβR1基因在脾脏中表达量最高。说明TGFβR1基因可能参与了机体的免疫应答。     

NDV和APMV-4的F和HN蛋白糖基化位点的差异分析比较

本文就禽副黏病毒的两种不同血清型APMV-1(以NDV为代表)和APMV-4的F和HN蛋白糖基化位点进行分析比较。分析显示:F蛋白糖基化位点NDV强弱毒株毒株均有6处糖基化位点,而APMV-4毒株则只有4处潜在的糖基化位点,而且位置与APMV-1略有不同。同时,NDV强毒株GM的HN蛋白有5个潜在的糖基化位点,而La Sota弱毒株有6个潜在的糖基化位点,即538~540位为NKT;APMV-4毒株有7处潜在的糖基化位点,且位置与APMV-1完全不一致。     

绵羊IGFBP-3基因的克隆及序列分析

旨在克隆IGFBP-3基因的CDS序列及其生物信息学分析,试验以凉山半细毛羊为研究对象,采用RT-PCR方法克隆了IGFBP-3基因的CDS全序列,生物信息学方法深入分析其序列。结果表明:IGFBP-3基因的CDS序列为882bp,编码293个氨基酸,与牛、人、鼠的CDS同源性分别为94%、83%、81%,氨基酸序列同源性分别为91%、77%、79%,GenBank登录号为FJ752574;IGFBP-3基因的氨基酸分子量为31.5KD,理论等电点(pI)为8.98;进化分析显示与牛、山羊等哺乳动物关系较近,与鸡、鱼类等亲缘关系较远;IGFBP-3基因存在明显的疏水性区域和亲水性区域,有一个信号肽、25个磷酸化位点、7个N-糖基化位点和4个O-糖基化位点;二级结构分析显示无规卷曲、α-螺旋和β-折叠区域分别为73.04%、13.99%、12.97%;三级结构分析显示存在IGFBP-N和甲状腺球蛋白-Ⅰ型功能域。为进一步研究绵羊IGFBP-3基因的功能奠定基础。     

草鱼CD40基因编码区分子序列特征分析

为了研究CD40基因在草鱼出血病中的作用,笔者利用生物信息学分析方法对草鱼CD40基因编码蛋白的理化性质、跨膜结构、蛋白质二级结构、N-糖基化位点、信号肽、结构域等高级结构进行了预测。结果表明,草鱼CD40基因编码288个氨基酸残基,是一不稳定的可溶性蛋白;有2个潜在的N-糖基化位点、存在1个典型的跨膜螺旋区;编码蛋白质的二级结构是以无规则卷曲和β-折叠为主的混合型蛋白。     

岷县黑裘皮羊MSTN基因第一外显子的生物信息学分析

采用PCR和测序技术以及生物信息学方法,预测和分析岷县黑裘皮羊MSTN基因第一外显子编码产物的理化特性、高级结构、信号肽、N-糖基化位点及其同源进化关系。结果表明:岷县黑裘皮羊MSTN基因第一外显子编码69个氨基酸,产物为一种不稳定的水溶性蛋白,二级结构为混合型,且以无规则卷曲(Cc)为主,并且不存在N-糖基化位点。从同源进化关系来看,绵羊的MSTN基因与牛的亲缘关系最近。该研究结果可为进一步全面分析和研究岷县黑裘皮羊MSTN基因及其应用研究奠定基础。     

貂阿留申病病毒结构蛋白VP1基因分子特征分析

目的研究貂阿留申病病毒(ADV)结构蛋白VP1基因分子空间结构特征,探讨貂阿留申病病毒致病机制。方法根据Genbank公布的全基因序列设计三对引物,PCR扩增并克隆到pMD-18T载体,阳性重组质粒鉴定、测序验证,拼接后进行生物信息学分析。结果获得了全长2064bpVP1基因,编码688个氨基酸;与细小病毒属中PPV-Nanjing200801相似性最大(51.2%);遗传进化树显示该基因编码蛋白与细小病毒属VP1亲缘关系最近。该蛋白是一种保守不含信号肽的外膜蛋白,具有7个潜在的N-糖基化位点和34个磷酸化位点。二级结构分析显示无规则卷曲含量最高,达68.75%,α螺旋、β折叠分别为16.42%和14.83%;同源建模比对,构建了具有较高合理性和可靠性的三维空间结构。结论预测抗原表位主要位于肽链第254~265、96~112、317~348、514~523、629~645位区段,可为今后开展基因工程疫苗研究奠定基础。     

山羊痘病毒069蛋白的表达与结构分析

为了分析山羊痘病毒THx株069基因的分子特征及其编码蛋白的生物学功能,本试验应用PCR技术对069基因进行扩增,并构建原核表达载体,经测序鉴定后用IPTG诱导表达其蛋白,应用SDS-PAGE和Western blot进行蛋白鉴定。用DNAStar及Mega软件对GenBank登录的24个该基因参考序列进行同源性比对并作遗传进化树分析;同时采用生物信息学分析方法对069蛋白信号肽、跨膜结构、糖基化位点、磷酸化位点、抗原决定簇、亲水性、二级及三级空间结构进行预测。结果表明:GTPV-069号基因全长为573 bp,与参考株GTPV-pellor相似度高达97.19%,经同源性比对与遗传进化树分析发现,山羊痘病毒THx株069基因序列与绵羊痘亲缘关系较近,在同一分支上,与疙瘩皮肤病和其他山羊痘亲缘关系较远。SDS-PAGE鉴定表明069蛋白大量表达于上清中,条带清晰。Western blot结果证明069蛋白与His标签确实进行了融合表达;生物信息学分析发现GTPV-069蛋白无信号肽、含有跨膜结构,跨膜区在29～51 aa之间,为典型的膜蛋白。069蛋白含有8个抗原决定簇、1个糖基化位点和14个磷酸化位点。二级结构分析显示,069蛋白中α螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角分别占43.46%,25.65%,23.04%和7.85%,三级结构预测发现069蛋白以α螺旋为主。本试验为后期探究羊痘病毒其他部分生物学功能以及新型羊痘疫苗的研制提供了依据。     

猫细小病毒VP2基因克隆与生物信息学分析

为了解猫细小病毒（feline parvovirus,FPV）VP2蛋白的分子特点及变异规律,克隆FPV山东分离株SD-01的VP2基因,对其进行生物信息学分析。首先,以FPV阳性病料基因组DNA为模板,PCR扩增VP2基因并克隆获得重组质粒pMD18-T-FPV SD-01-VP2。测序结果显示：VP2基因全长1 755 bp,编码584个氨基酸;氨基酸同源性比对发现,与其他FPV分离株的VP2基因氨基酸同源性较高,可达99.0%~100%。生物信息学分析结果显示：VP2蛋白为非分泌型的亲水性蛋白,无信号肽和跨膜区域;二级结构中α螺旋、延伸链、β转角和无规则卷曲分别占8.7%、24.5%、4.3%和62.5%;三级结构预测发现,VP2蛋白以无规则卷曲为主,与二级结构预测结果一致。亚细胞定位预测显示,VP2蛋白不含有线粒体导肽（mTP）或分泌通道信号肽（SP）,定位在细胞质和细胞核中的概率较高,分别为47.8%和26.1%。B细胞抗原表位预测结果显示,VP2蛋白的抗原性及表面可及性较高,共含有11个潜在的优势B细胞抗原表位。蛋白翻译后修饰预测结果显示,VP2蛋白可能含有49个潜在磷酸化修饰位点,6个N-糖基化修饰位点和21个O-糖基化修饰位点,且这些修饰位点在FPV VP2蛋白内高度保守。本研究有助于了解我国FPV流行情况,掌握其重要结构蛋白VP2的理化性质和特性,从而为下一步VP2蛋白功能研究和疫苗研发奠定了基础。