细粒棘球绦虫TPx基因的克隆及序列分析

从自然感染病羊肝内收集细粒棘球绦虫（Eg）原头蚴,分别提取总RNA和基因组DNA。根据GenBank数据库中的细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶（EgTPx）基因序列设计1对引物,以总RNA为模板,采用RT—PCR技术扩增出EgTPx基因片段,同时以基因组DNA为模板扩增出对应的基因组序列。PCR产物经纯化后连接到pMD18-T载体,转化至大肠杆菌DH5口后,进行序列测定和生物信息学分析。结果表明,成功扩增到中国青海株细粒棘球绦虫EgTPx基因片段,其开放阅读框为582bp,编码193个氨基酸,与已知的EgTPx基因核苷酸序列及其编码蛋白氨基酸序列的同源性均为99％,有3个碱基发生变异,分别在245,306,318位由C变为T;引起1个氨基酸变异,由Ala^82变为Val^82。EgTPx具有典型的2-Cys型过氧化物氧还蛋白催化性位点Cys^48和Cys^169。,以及周围保守的FVCP和VCPA序列。EgTPx基因的开放阅读框对应的基因组序列包含2个外显子和1个69bp的内含子。     

细粒棘球绦虫TSP33基因的克隆、生物信息学及表达分析

旨在分析细粒棘球绦虫TSP33基因的结构及其在细粒棘球绦虫不同发育阶段的表达情况,预测其作为细粒棘球绦虫诊断抗原的潜在价值。从GenBank中获得Eg-TSP33的cDNA序列并设计特异性引物,提取原头蚴总RNA,反转录cDNA,以cDNA为模板进行PCR扩增,将PCR产物克隆到大肠埃希菌中,测序并进行生物信息学分析。TSP33cDNA全长864bp,编码277个氨基酸,Eg-TSP33的预测分子质量为32.11ku,预测等电点为8.62。RT-PCR结果显示,Eg-TSP33在细粒棘球绦虫成虫、包囊壁及原头蚴中均有表达,且在包囊壁中表达量较多。结果说明,Eg-TSP33可能在细粒棘球绦虫发育过程中可能具有重要作用,为Eg-TSP33分子的诊断价值研究奠定了基础。     

细粒棘球绦虫成虫表膜抗原特异性基因的筛选及克隆

为筛选细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)表膜抗原基因或具有诊断性的特异性基因,提取Eg成虫表膜抗原,经ELISA、Western blot对该抗原的免疫学特性进行初步研究.以Eg成虫表膜抗原高免鼠血清为探针,筛选Eg成虫cDNA文库,将阳性噬菌斑的PCR产物和pGEM-T载体连接,转染到DH5α,对得到的重组子进行测序,并进行同源性分析.ELISA检测显示,表膜抗原免疫鼠诱导产生了特异性抗体,Westem blot鉴定该抗体能识别Eg成虫表膜抗原、原头蚴、Eg发育不成熟、Eg发育成熟抗原.筛选出6个阳性克隆,DNA片段大小在1～2kb之间.对阳性克隆进行同源性分析,结果与EgP-29mRNA同源性为99%,与Eg14-3-3蛋白mRNA同源性80%-99%.筛选Eg成虫cDNA文库所获得的基因,证明了Eg虫体表膜抗原的存在,有望成为犬细粒棘球绦虫的诊断抗原以及犬抗细粒棘球绦虫的候选基因.     

细粒棘球绦虫三磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆、表达及其分子特征的生物信息学分析

三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是糖酵解途径中的关键酶,现已发现该酶可作为一些寄生虫的疫苗候选分子和药物靶标。然而,有关绦虫三磷酸甘油醛脱氢酶的研究报道较少。为探究细粒棘球绦虫GAPDH(EgGAPDH)的分子特征与应用价值,克隆细粒棘球绦虫的GAPDH基因,并以生物信息学方法对其进行系统的分析。结果显示:EgGAPDH基因全长1 011bp,编码336个氨基酸。EgGAPDH是由4个结构相同的单体蛋白(O、P、Q、R)组成的一个同源四聚体,每个单体蛋白质含有3个活性中心,即NAD+绑定区域(aa 4-151和aa 315-336)、催化结合区域(aa 156-314)和一个酶活性位点(aa 149-156)。通过对EgGAPDH的氨基酸序列的抗原表位预测得到了16个B细胞抗原表位和9个T细胞结合位点;Western blot显示原核表达的重组EgGAPDH能与感染细粒棘球蚴的小鼠血清发生特异性结合;以纯化的重组EgGAPDH蛋白为抗原通过ELISA法检测17份细粒棘球蚴小鼠阳性血清,阳性检出率为100%。试验结果表明:成功克隆并表达细粒棘球绦虫的EgGAPDH基因,EgGAPDH蛋白具有3个酶功能区域和多个免疫结合位点,Western blot和ELISA结果显示,该蛋白质可能具有作为抗细粒棘球蚴的药物靶标和疫苗候选分子的潜力。     

细粒棘球绦虫形态学观察

引言越来越多的资料表明,细粒棘球绦虫的不同虫株在形态学.发育史.对中间宿主的感染性、抗原组成.免疫诊断和对药物的敏感性等方面均具有其独特性.目前.世界上许多国家对本国境内的棘球绦虫形态学作了详细的报道.然而,我国目前对该病的研究主要集中在免疫诊断和化疗方面。而对本病     

细粒棘球绦虫蛋白质组学研究进展

随着人类基因组计划(Human genomic project,HGP)的实施和推进,生命科学研究已进入后基因组时代,而蛋白质组学是后基因组时代生命科学研究的热门之一。包虫病作为一种重要的人兽共患病,给人类带来了巨大的健康威胁和经济损失,因此,包虫病的预防、诊断和治疗是人们迫切需要研究的课题,本文就近几年细粒棘球绦虫蛋白质组学研究的进展进行叙述,并对相关的研究方法和手段作出科学的论述,旨在阐述细粒棘球绦虫与宿主在分子水平的相互作用方式,为包虫病的疫苗研发、诊断标志物和诊断药物靶点的筛选提供参考。     

我国三省区细粒棘球绦虫基因的变异分析

对从青海省、甘肃省和新疆维吾尔族自治区采集的24株细粒棘球蚴，用线粒体DNA的CO1基因和ND1基因结合rDNA的ITS2测序，调查了不同地区分离株基因型的变异情况。结果显示，所有分离株均为普通羊株(G1基因型)；CO1基因序列的变异率为0～0．8％，ND1基因的变异率为0．1％～0．7％；青海分离株ITS2序列的变异率为0．4％～3．1％；2株青海省西宁市和1株甘肃省武威市分离株分剐在C01基因和ND1基因序列不同位点发生的1处核苷酸非同义替换，导致1个编码的氨基酸替代。研究表明，我国上述3省、区部分区域存在的细粒棘球蚴属于同一株(G1基因型)。     

细粒棘球绦虫脂肪酸去饱和酶1基因序列及不同发育阶段表达分析

旨在寻找细粒棘球绦虫发育相关基因,为预防和治疗细粒棘球绦虫引起的包虫病而制定相应的措施提供理论基础。通过分析细粒棘球绦虫原头蚴高通量转录组测序数据文库,对Unigene进行KEGG通路分析,筛选出一个脂肪代谢通路,并筛选出该通路中主要的调控基因脂肪酸去饱和酶1。通过对Eg-FADS1基因的PCR扩增,分析其核苷酸序列及氨基酸序列,用实时荧光定量PCR和全量组织原位杂交检测Eg-FADS1基因在不同发育阶段的表达情况。结果显示,该基因具有完整的开放阅读框,cDNA全长为819bp,编码272个氨基酸,预测该蛋白分子质量为30.98ku,等电点为7.10。实时荧光定量PCR结果表明,Eg-FADS1基因在原头蚴及成虫阶段均有表达,并且该基因在成虫阶段极显著高于原头蚴阶段的表达量。全量组织原位杂交结果显示,Eg-FADS1mRNA在原头蚴及成虫阶段分布广泛。提示Eg-FADS1具有生物防治作用,值得进一步研究。     

青海省羊源细粒棘球蚴EG95基因的克隆与序列分析

从青海省羊源细粒棘球蚴中提取基因组DNA，用EG95特异性引物进行PCR扩增，并克隆至pGEM-T Easy载体上，经PCR、EcoRⅠ酶切和测序鉴定后，用DNAstar软件对3个克隆的DNA序列进行同源性分析。结果表明，EG95基因的3个序列(EG95-QH-1、EG95-QH-2和EG95-QH-3)的片段大小为1435～1437 bp。与GenBank中的EG95基因同源性为73．2％～99．2％，差异集中在内含子区域。其中EG95-QH-1、EC-95-QH-3与GenBank EG95XJ-ag、EG95-4序列的同源性较高；EG95-QH-2与GenBank中EG95-1、EG95-2、EG95-3序列的同源性较高。研究结果表明，青海羊源细粒棘球蚴EG95基因的3个序列为EG95基因家族的成员。     

细粒棘球绦虫六钩蚴EG95抗原基因的克隆及原核表达

利用RT—PCR从激活的细粒棘球绦虫六钩蚴中扩增了EG95 cDNA，并亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1上，转化至大肠埃希氏菌BL21，用IPTG诱导重组菌株表达了融合蛋白质。结果表明，从六钩蚴中克隆到了EG95 cDNA，序列长度为481bp，包括471bp的开放阅读框，与新西兰株EG95抗原基因序列完全一致；SDS-PAGE电泳结果显示，重组表达质粒产生了约42ku的目的带，其中EG95蛋白质的分子质量约为15．2ku，与预期结果一致；Western-blotting试验检测表明，融合表达产物可与囊性包虫病人血清发生反应。试验结果提示，EG95基因高度保守，所表达的EG95蛋白作为抗原疫苗具有广泛的适用性。     

犬感染细粒棘球绦虫调查

为掌握共和地区犬细粒棘球绦虫感染情况，笔者于2005年9～10月，对共和地区农、牧区三个乡镇家养、散养犬细粒棘球绦虫感染情况进行了调查。现将调查情况报告如下。1材料与方法采用随机抽样法。对共和县农、牧区3个乡镇的家养和散养犬，按0．5ml／kg体重的剂量，将1．5％氢溴酸槟榔碱溶液注入口腔，服药后约40～60min，会排出黏性液体粪样，收取其1／3粪样，用3％福尔马林溶液轻洗于搪瓷盘中沉淀片刻，弃去上清液，再进行肉眼检查。     

细粒棘球绦虫形态结构观测

终末宿主:犬。寄生部位:小肠。中间宿主:牛、猪、人。寄生部位:肝、肺。1种的形态结构描述细粒棘球绦虫由头、颈和3～4个体节组成。头节较小,上有四个圆形的吸盘,头节的吻突上有两圈小钩,小钩的数量为28～50个,小钩的大小不等,前排小钩较大,后排小钩较小。颈节后一节为未成熟节,之后为成熟节片。成节内有睾丸(平均18)个;生殖孔开口于节片一侧中央部的稍后方,距节片后缘0.372～0.512(平均0.432)mm处;卵巢呈蹄铁形;雄茎囊呈梨形。最后的一节为孕节,孕节内其它生殖器客都消失,只剩下充满虫卵的子宫,子宫有7～24个侧枝,子宫内含的卵数为367～1104(平均594.6)个。     

犬细粒棘球绦虫驱虫试验报告

包虫病是一种严重的人畜共患寄生虫病,主要病原体是细粒棘球绦虫,其不仅危害畜牧业的健康发展,对人体健康也造成了很严重的威胁。本试验采用内蒙锡林浩特地区的土种犬作为试验对象,通过饲喂不同形式的吡喹酮探究其对犬的驱虫效果,结果表明试验所用两种吡喹酮均对犬具有良好的驱虫效果。     

细粒棘球绦虫抗原B的研究进展

细粒棘球绦虫抗原B(AgB)是血清学诊断棘球蚴病最重要的抗原,也是目前研究最多的抗原之一。深入研究抗原B对棘球蚴病的血清学诊断、流行病学研究、综合防控和疫苗的研究开发具有重要的意义。文章针对近年来关于抗原B的分子生物学特征、免疫学特性及在人和动物等中间宿主的血清学诊断方面的研究进展进行综述。     

犬细粒棘球绦虫的驱虫试验

为了进一步做好包虫病防控工作,开展了犬细粒棘球虫驱虫试验,以观察吡喹酮片对犬细粒棘球绦虫的驱除效果。选择当地土种犬作为试验犬,分为试验组和对照组,按5 mg/kg剂量分别直接投喂试验药品和对照药品,连续进行三次投药,试验投药前后对犬粪便分别采取犬细粒棘球绦虫抗原检测;同时在犬投药前后,分别采取羊粪便进行细粒棘球绦虫抗原检测。试验组和对照组的驱虫效果均为100%,但对照组犬的主动吞食率较低为0.38%,而试验组犬主动吞食率达到89.22%;在犬驱虫试验区域,羊只的细粒棘球绦虫感染率也大幅度下降,其中试验组感染率下降到了10%;对照组下降到23.33%。试验药品中加入天然成分掩盖吡喹酮的苦味,使犬的主动吞食率增高,且该药品相对松软有助于分割使用。因此该试验药品是比较理想的抗寄生虫药物,用于驱除犬细粒棘球绦虫效果较好,推荐剂量为5 mg/kg。     

细粒棘球绦虫免疫相关抗原基因的筛选及原核表达

为了筛选获得细粒棘球绦虫的免疫相关抗原基因,试验采用SEREX技术对细粒棘球绦虫cDNA文库进行相关抗原筛选,并对获得的细粒棘球绦虫特异性基因进行原核表达与鉴定。结果表明:共获得149个阳性噬菌斑,对其进行PCR扩增和序列分析得到与棘球绦虫属相关的基因序列10个,其中有864 bp的开放性阅读框序列;编码288个氨基酸;经NCBI BLAST氨基酸同源性分析,与多房棘球绦虫诊断抗原gp50的氨基酸序列的同源性为92%,是一个未知的新基因,命名为Ediag A864;经原核表达得到大小约为51 ku的重组蛋白,经Western-blot分析具有良好的反应原性。     

棘球绦虫分子分类学研究进展

分子生物学技术具有操作简便、特异性强等优点,弥补了传统形态学分类方法的不足,因此分子水平的分类为棘球属绦虫种、株的鉴定提供了一种强有力的手段。文章介绍了线粒体基因(cox1、nad1、cob等)、核糖体基因应用于棘球绦虫分子分类的研究进展。     

细粒棘球绦虫基因型与抗原研究进展

细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus,坛）是一种重要的人兽共惠寄生虫。现已报道细粒棘球绦虫有10个基因型（G1～G10）,我国仅发现G1和G6。细粒棘球绦虫六钩蚴阶段的Eg95,原头蚴阶段的EgFABP,成虫阶段的EgM9和Eg31分别被认为是最有前途的用于免疫保护的抗原。其中Eg95基因工程疫苗已经商业化生产,对羊免疫保护率达到了95％以上。     

新疆家犬细粒棘球绦虫感染调查

为了解全疆犬的调查和检测包虫病流行现状,我们于2007～2010年采用氢溴槟榔碱集中测试泻下法,分别对阿勒泰地区,塔城地区,哈密地区,吐鲁番地区,伊犁州,博州,巴州,阿克苏地区,喀什地区,克州,和田地区,昌吉州,乌鲁木齐市,克拉玛依市等14个地区(州)进行了调查.采用氢溴槟榔碱(内蒙兽药厂生产)测试剂量按3.3 mL/kg体重.使用时用常水配成6.6％浓度,按2 kg体重1 mL给药.投药后测试犬在现场停留40 min～2 h.待其排出标准粪便.取标准粪便样冲洗后,置直径15 cm平皿中仔细检查.