结球甘蓝类钙调蛋白基因 CML48和 CML50在不同胁迫下的表达分析

为探究结球甘蓝类钙调蛋白（CMLs）响应不同胁迫时的功能,丰富CMLs参与钙信号网络调控,为CMLs参与植物逆境途径及其功能的研究提供依据。以结球甘蓝ZG为材料,克隆得到 CML48和 CML50基因,序列分析表明 CML48开放阅读框（ORF）为672 bp,含4个内含子,编码223 aa,分子量为25.28 ku; CML50开放阅读框ORF为1 095 bp,编码364 aa,分子量为38.06 ku,含3个内含子;均为亲水蛋白,均含有2个EF-hand结构域;系统发育树表明 CML48和 CML50均与甘蓝处于同一进化枝,与白菜、油菜的亲缘关系最近。qPCR表明 CML48和 CML50在干旱(PEG6000)、盐胁迫(NaCl)、低温(4 ℃)、高温(37 ℃)、H₂O₂、脱落酸（ABA）、水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）等不同胁迫处理下,在叶和根中的表达均有上调,且 CML50的表达量均显著高于 CML48, CML48在茎尖中高度响应高温胁迫,而在根中不响应高温和H₂O₂胁迫。初步说明 CML48和 CML50在根和叶中均可响应上述8种非生物胁迫。     

甘薯响应蔓割病病原菌侵染的IbWRKY7基因克隆与表达分析

为探究IbWRKY7基因在甘薯响应蔓割病病原菌侵染过程中的表达模式,以高抗蔓割病品种‘鄂薯11’为供试材料,克隆到1个新的WRKY家族基因IbWRKY7,进行生物信息学分析;并对‘鄂薯11’和蔓割病敏感品种‘栗子香’在蔓割病病原菌侵染后IbWRKY7基因的表达模式进行分析。结果显示,IbWRKY7的CDS序列全长为945 bp,编码314个氨基酸;推测其编码不稳定的亲水性蛋白,蛋白分子质量为33.92 kU,pI 9.82,含有1个WRKY七肽保守序列和1个C₂HC型锌指结构。IbWRKY7基因上游2 000 bp的启动子区域内存在多种类型的顺式作用元件,如植物激素应答元件Myb、胁迫响应元件MYC和MYB等。多序列比对及系统进化树分析结果表明,IbWRKY7蛋白与日本牵牛花InWRKY7和三裂叶薯ItWRKY7亲缘关系最近。亚细胞定位预测显示IbWRKY7蛋白定位于细胞核。实时荧光定量PCR结果表明,与蔓割病病原菌侵染0 h相比,侵染2、4、12、24、48、72、96和120 h后,‘鄂薯11’的IbWRKY7基因表达量均显著提高(P<0.05);而‘栗子香’的IbWRKY7基因表达量除侵染24 h外的其他7个时间点均显著高于0 h。侵染2~48 h,‘鄂薯11’的IbWRKY7基因表达量显著高于‘栗子香’。双因素方差分析结果表明,不同品种和侵染时间点的IbWRKY7基因表达量均存在显著差异。综上,甘薯IbWRKY7基因上游2 000 bp的启动子区域含有12种激素应答和胁迫应答相关的顺式作用元件。IbWRKY7具有WRKY家族的典型结构特征,属于第Ⅲ类WRKY蛋白,氨基酸序列与同源物种相似度高,进化上高度保守。IbWRKY7基因受蔓割病病原菌侵染诱导表达,且在不同蔓割病抗性的甘薯品种中表达量差异显著。     

胁迫条件下山新杨PdPapMYC2基因的组织表达模式

【目的】解明山新杨PdPapMYC2基因在生物胁迫、非生物胁迫及激素诱导下的组织表达模式。【方法】克隆山新杨PdPapMYC2基因,采用生物信息学技术分析其编码蛋白特性。采用qRT-PCR技术分析PdPapMYC2在山新杨顶尖、茎、叶和根等组织中的表达量,以及其在盐（NaCl）、碱（Na₂CO₃）和高渗透压（PEG6000）3种非生物胁迫处理,核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、链格孢菌（Alternaria alternata）和金黄壳囊孢菌（Cytospora chrysosperma）5种生物胁迫处理及脱落酸（ABA）、茉莉酸 （JA）和水杨酸（SA）3种激素诱导下的组织表达量变化。【结果】PdPapMYC2基因长1 944 bp,编码647个氨基酸,存在bHLH-MYC_N superfamily和bHLH_SF superfamily保守结构域。预测PdPapMYC2蛋白定位在细胞核;二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,三级结构与拟南芥4rru.1.A模型的一致性最高。系统进化结果显示,PdPapMYC2与毛白杨PtMYC2的亲缘关系最近。qRT-PCR分析结果显示,PdPapMYC2基因在山新杨顶尖、叶、茎和根中均有表达;与对照(CK)处理相比,在NaCl、Na₂CO₃和PEG6000胁迫处理下,顶尖部位PdPapMYC2的表达量均显著下调（P<0.05）;成熟叶中PdPapMYC2的表达量在NaCl胁迫时显著上调（P<0.05）,在碱和高渗透压胁迫处理中下调;3种胁迫处理下其在根中的表达量均下调,但均未达显著水平。与对照(CK)处理相比,5种土传致病真菌胁迫48 h后,顶尖中PdPapMYC2表达量均下调,成熟叶中表达量仅在链格孢菌诱导下略上调,根部表达量在尖孢镰刀菌、金黄壳囊孢菌、链格孢菌和核盘菌作用下上调。JA诱导下PdPapMYC2在各组织中的表达量均显著上调（P<0.05）,ABA和SA诱导下其在各组织中的表达量均下调。【结论】PdPapMYC2基因在山新杨多组织中表达,参与植物抵御逆境胁迫,并响应相关激素诱导。     

黑果枸杞LrPIP1基因的克隆鉴定及外施水杨酸对其在干旱胁迫下表达的影响

植物质膜水通道蛋白（plasma membrane intrinsic proteins, PIPs）是一类参与植物众多生理活动的多功能蛋白。为探究PIP基因在黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）响应干旱胁迫中的作用,以黑果枸杞为试验材料分离得到PIP基因,命名为 LrPIP1 。使用生物信息学方法对其编码蛋白的理化性质、序列进化进行分析,以及预测蛋白质的二级和三级结构并构建基因树等。将幼苗进行不同程度干旱胁迫与外施水杨酸处理,实时荧光定量PCR结果显示,无外源SA处理下,轻度干旱胁迫D1可诱导LrPIP1 基因的相对表达量较CK处理显著上调,中度D2、重度胁迫D3时,LrPIP1 基因的相对表达量较CK有一定程度的上调,但相较于D1表现为显著下降;外源喷施SA可影响干旱胁迫下黑果枸杞LrPIP1 基因的相对表达量,轻度胁迫下,外源SA诱导LrPIP1 基因表达量较CK下调;较CK处理,中、重度胁迫下SA可诱导LrPIP1 基因表达量上调。上述表明,LrPIP1 基因可能在黑果枸杞非生物胁迫响应过程中发挥重要调控作用。     

巨桉GRF基因家族生物信息学分析及其在不同氮水平下的组织表达模式

【目的】从全基因组水平上鉴定巨桉生长调节因子（growth-regulating factor,GRF）基因家族成员,分析其在不同氮素水平下的组织表达模式,为巨桉GRF基因功能研究及氮高效利用桉树品种的培育奠定基础。【方法】在NCBI网站中选择巨桉基因组,用拟南芥和毛果杨的GRF蛋白序列与巨桉基因组数据库进行BLAST蛋白序列同源比对,并通过InterPro和SMART数据库进行保守结构域分析,获得巨桉GRF基因。利用在线网站Ex-pasy protparam、SignalP-5.0、WoLF PSORT和SOPMA,对巨桉GRF蛋白进行基本理化性质分析、信号肽预测、亚细胞定位及二级结构预测。利用MEGA7.0软件构建系统进化树,使用MEME在线平台分析EgrGRF蛋白的保守结构域和基序,用Plant CARE预测基因上游的顺式作用元件,并使用TBtools软件将结果可视化。以2年生巨桉苗为供试材料,浇灌氮素浓度分别为45（高氮）、15（常规氮）和1.5（低氮）mmol/L的营养液,4 d后取样,采用实时荧光定量PCR技术检测EgrGRF基因在3种氮素水平下的叶片、茎和根中的表达情况。【结果】鉴定得到6个巨桉GRF基因家族成员（EgrGRF1~EgrGRF6）,分布于4条染色体上;6个EgrGRF蛋白的氨基酸数目为296～605个,分子质量为33 415.86～64 630.89 u,理论等电点为7.29～8.85,脂溶指数为39.93～64.79,均为亲水性蛋白;无规则卷曲和α-螺旋为主要二级结构元件,均定位于细胞核上,未检测到信号肽存在。系统进化树分析表明,巨桉、毛果杨和拟南芥的GRF家族成员可分为4组,各组中EgrGRF蛋白数量分别为0,3,1和2个,多数EgrGRF成员与毛果杨亲缘关系较近。基因结构及蛋白基序分析结果显示,巨桉GRF基因家族成员具有2～4个内含子;6个EgrGRF蛋白均具有CX₉CX₁₀CX₂H和QX₃LX₂Q保守基序。顺式作用元件分析表明,EgrGRF基因启动子区含有茉莉酸甲酯、脱落酸、分生组织表达及低温等响应元件。实时荧光定量PCR结果显示,EgrGRF2和EgrGRF6基因在低氮处理的巨桉叶片中优势表达,EgrGRF2、EgrGRF3、EgrGRF5和EgrGRF6基因在低氮处理根中的表达量较高氮和常规氮处理显著升高,EgrGRF4基因在常规氮处理茎中的表达量最高。【结论】鉴定获得6个巨桉GRF基因家族成员,其中EgrGRF4基因可能参与茎生长发育的调控,EgrGRF2、EgrGRF3、EgrGRF5和EgrGRF6基因可能参与了巨桉对低氮胁迫的响应。     

辣椒转录因子CaNAC083对高温胁迫的响应

【目的】分析辣椒NAC转录因子CaNAC083在高温胁迫响应中的作用,为阐明辣椒耐高温机理奠定基础。【方法】以辣椒P70为材料,扩增CaNAC083基因,对其进行生物信息学分析,在辣椒中构建基因沉默载体沉默该基因,用RT-qPCR检测沉默效率以及高温胁迫相关基因CaHsfA2、CaHsfB5、CaHsp25.9和CaHSP90的相对表达量,测定42 ℃高温胁迫处理10 h前后丙二醛（MDA）含量、相对电导率、F_v/F_m、活性氧（H₂O₂和O^-₂·）含量以及抗氧化酶（超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT））活性的变化,观测二氨基联苯胺（DAB）和氮蓝四唑（NBT）染色情况;同时构建过量表达载体转化拟南芥,测定42 ℃高温处理12 h前后的MDA含量、活性氧含量、相对电导率以及抗氧化酶活性的变化,探讨CaNAC083基因对植株耐高温能力的影响。【结果】CaNAC083属于NAP亚家族的一员,且与典型的NAP亚家族成员的结构一致。CaNAC083基因沉默辣椒植株在高温胁迫后叶片损伤较轻,MDA、相对电导率以及活性氧均低于对照植株,而POD、SOD和CAT活性高于对照植株,CaHsfA2、CaHsfB5、CaHsp25.9和CaHSP90相对表达量均高于对照植株。过表达CaNAC083拟南芥株系在高温胁迫下受害程度较WT严重,MDA、相对电导率以及活性氧含量均高于WT,而POD、SOD和CAT活性均低于WT。【结论】CaNAC083基因沉默可以增强辣椒植株的耐高温性,过表达该基因则减弱植株的耐高温性,判断CaNAC083在植物高温胁迫中可能起负调控作用。     

小麦转录因子TaWRKY28基因克隆与抗旱性分析

【目的】克隆小麦TaWRKY28基因,通过农杆菌浸染法将其转化至拟南芥,研究转基因拟南芥植株生理生化指标变化,探究其在抵御非生物胁迫中的作用。【方法】采用RT-PCR方法,从小麦百农207 cDNA中克隆得到TaWRKY28基因,利用ProtParam等软件对其氨基酸序列进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR方法,分析TaWRKY28基因的组织表达特异性及在NaCl、ABA、H₂O₂、干旱和低温逆境胁迫下的表达情况;构建基因超表达载体,通过花序浸染法转化拟南芥,选取TaWRKY28基因相对表达量较高的转基因T₃拟南芥株系,测定拟南芥超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）的活性以及丙二醛（MDA）、H₂O₂和脯氨酸含量,研究TaWRKY28对拟南芥抗旱性的影响。【结果】成功克隆获得小麦TaWRKY28基因,该基因ORF全长为978 bp,编码325个氨基酸,相对分子质量为34.87 ku,理论等电点为9.27,含有1个WRKY保守结构域和1个C₂H₂锌指结构域,属于WRKY基因家族的第Ⅱ类成员。序列系统进化分析结果显示,小麦TaWRKY28与大麦HvWRKY2亲缘关系最近。亚细胞定位显示该基因位于细胞核中。qRT-PCR结果表明,TaWRKY28在小麦根、茎、叶、雌蕊和雄蕊组织中均有表达,但具有组织特异表达性,在叶中表达量最高,雄蕊中次之,雌蕊中表达量最低,且受NaCl、ABA、H₂O₂、干旱和低温胁迫后TaWRKY28表达会增强。对TaWRKY28转基因拟南芥植株的抗旱性分析表明,在干旱条件下,转基因植株的表型优于野生型,SOD、POD活性和脯氨酸含量显著增加,而H₂O₂和MDA含量显著降低,转基因植株抗旱性显著提高。【结论】克隆了小麦TaWRKY28基因,该基因可以增强转基因拟南芥植株的抗旱能力。     

小麦水通道蛋白基因 TaTIP1-1c-4BL的克隆与表达分析

为探究 TaTIP1-1c-4BL基因在小麦响应缺水胁迫中的作用,采用PCR扩增的方法从小麦‘科农199’cDNA中获得 TaTIP1-1c-4BL基因。生物信息学分析显示该基因编码区全长753 bp,共编码250个氨基酸。TaTIP1-1c-4BL蛋白具有6个跨膜域,为非分泌型、弱酸性、稳定型、疏水性蛋白。系统发育分析显示‘科农199’与来自粗山羊草和大麦的水通道蛋白亲缘关系较近。表达分析显示 TaTIP1-1c-4BL基因在小麦根、茎、叶、籽粒及颖壳中均有表达,在茎中表达量最高。在PEG胁迫下,该基因的表达量下调,表明该基因在小麦应对干旱胁迫过程中具有负调控作用。在NaCl、ABA及H₂O₂胁迫下,表达量先下调后上调,推测该基因参与了某些抗逆信号的传导。     

石榴低温响应因子CBF基因家族鉴定及其表达分析

CBF（C-repeat binding factor）是AP2家族的一类转录激活因子,在植物响应低温胁迫和提高植物耐寒性方面具有重要作用。虽然多个石榴品种的基因组已经发布,但仍缺乏对其CBF基因家族的全面研究。为全面分析石榴（Punica granatum L.）CBF基因家族分子生物学特性,本文对鉴定到的PgCBFs成员进行了生物信息和表达分析。结果表明,石榴全基因组中有7个CBF基因家族成员,蛋白序列中除包含AP2结构域外,还具有CBF特征序列PKKPAGRxKFxETRHP和DSAWR;7个成员集中分布在染色体1和4上,编码蛋白质氨基酸长度为201~267 aa,分子质量为21.69~29.81 ku;进化分析显示PgCBFs基因家族成员分布在Group Ⅱ~Ⅳ 亚组中,与水稻CBF成员组成的Group Ⅰ存在明显区分;除 PgCBF2、 PgCBF4、 PgCBF5基因结构中含有1~2个内含子外,其余与其他物种类似,属内含子缺失型;编码的蛋白序列均含有保守基序Motif 1~7;蛋白二级结构主要为不规则卷曲和α-螺旋,三级结构较为相似。PgCBFs基因家族扩增主要来源于串联重复,并与拟南芥、苹果、桃分别存在2对、5对和4对共线性关系;GO注释显示PgCBFs多与转录调控、低温胁迫或激素诱导相关;启动子区含有多种顺势作用元件,主要为胁迫刺激、激素诱导和光响应元件;基因表达分析发现除 PgCBF6外,其余成员在根中高度表达,在低温胁迫处理下PgCBF在根和韧皮部表达量显著上调,其中 PgCBF7能够快速响应并持续应答低温诱导。结合进化树、共线性、启动子以及表达分析,推测 PgCBF7可能与石榴幼苗低温胁迫调控相关。本研究可为深入研究石榴CBF基因家族生物学功能提供理论基础。     

玉米FAD2基因的生物信息学分析

脂肪酸脱氢酶（Fatty acid desaturase, FAD2）是产生不饱和脂肪酸的关键酶，在植物对多种逆境胁迫的响应中发挥重要作用。研究通过生物信息学方法对C\-4作物玉米的FAD2基因及其蛋白的结构和功能作以预测和分析。分析结果表明，ZmFAD2基因含有FA-desaturase结构域，表明ZmFAD2蛋白具有脂肪酸去饱和酶的功能。ZmFAD2是定位于内质网的亲水性蛋白，系统进化树表明其与同为C\-4植物的高粱和谷子亲缘关系最近。启动子顺式作用元件以及表达特性分析均表明ZmFAD2参与多种逆境胁迫的响应。研究结果为FAD2基因功能的进一步研究奠定了基础，同时为通过分子育种提高作物在逆境胁迫下的抗性提供了理论依据。     

沙门菌、巴氏杆菌和大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立

旨在建立一种可以应用于临床样本同时检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌感染的多重PCR方法。根据NCBI上已收录的沙门菌hut基因、多杀性巴氏杆菌 kmt1基因和大肠埃希菌23SrRNA基因的全基因序列,设计并合成3对特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立能够同时检测3种细菌混合感染的多重PCR诊断方法。特异性分析表明,应用该方法可以从沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌以及3种细菌的混合物中扩增出3条大小分别为286 bp、457 bp和652 bp的特异性条带,其他对照组检测结果均为阴性;敏感性分析表明,该方法对沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的最低检出量分别为1.77×10　、1.99×10　、2.01×10　 CFU/mL;人工模拟感染样本检测表明,该方法能从混合感染的病料中检测出3种病原菌。可见：所建立的多重PCR方法具有特异性强,敏感度高,稳定性好的特点,可以有效检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的混合感染。     

四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1与ESBLs基因共转移分析

为了解四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1耐药基因流行情况,及其与超广谱β-内酰胺酶基因(ESBLs)共存和共转移的特征,采用微量肉汤稀释法检测菌株对不同抗菌药物的敏感性;采用PCR检测菌株mcr-1,以及mcr-1阳性菌株中ESBLs基因类型;采用质粒接合转移试验分析了mcr-1与ESBLs基因共转移的耐药机制。结果显示:190株大肠杆菌的mcr-1检出率为36.84%,75.71% mcr-1阳性菌株中同时检出ESBLs基因,主要以blaTEM-1、blaCTX-M-55和blaCTX-M-14为优势基因;mcr-1阳性菌对氨曲南(ATM)、头孢噻肟(CTX)和多黏菌素E(COL)耐药率极显著高于mcr-1阴性菌(P<0.01);质粒转移率为47.14%,其中获得mcr-1和ESBLs基因共转移的接合子表现出与供体菌相同的耐药表型及耐药基因。综上,在四川省食品动物源大肠杆菌中,mcr-1与ESBLs基因共存现象广泛存在,且耐药基因易发生水平传播,对菌株多重耐药性的产生具有重要意义。     

细粒棘球蚴重组St-Eg 95-Eg.ferritin疫苗构建及生物学特性检测

构建表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白的重组口服减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株并评价其生物学特性。将细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合基因插入到表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-Eg95-Eg.ferritin,将重组质粒分别电转入减毒鼠伤寒沙门菌X3770和X4550,获得重组疫苗菌株St-Eg95-Eg.ferritin,对重组菌的稳定性、生长状态及安全性进行分析。结果表明,经PCR和酶切鉴定成功构建重组质粒pYA3341-Eg95-Eg.ferritin,Western blot检测Eg95-Eg.ferritin蛋白在重组菌中获得表达;生物学特性研究结果表明,重组质粒可稳定存在,且不影响重组菌的生长状态,小鼠口服试验证实,重组菌安全无毒性。成功构建能稳定表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株,将为研究包虫病口服基因工程疫苗奠定基础。     

兰州百合和有斑百合的核型研究

【目的】研究兰州百合及有斑百合的染色体核型。【方法】利用染色体常规压片的方法,对兰州百合和有斑百合的染色体数目及核型进行了研究和分析。【结果】兰州百合的核型公式为2n=2x=24=2m+2sm+6st+14t,相对长度为6.35%～12.07%,核型不对称系数为83.25%,染色体相对差异较大。有斑百合的核型公式为2n=2x=24=4m+12st+8t,相对长度为6.11%～12.90%,核型不对称系数为80.11%。【结论】兰州百合的核型类型属于3A型,有斑百合的核型类型为3B型,以有斑百合核型的进化较高,可见不同居群的百合间核型存在差异。     

美洲棘蓟马体内共生菌Wolbachia的wsp基因分子检测及系统发育分析

【目的】对美洲棘蓟马体内共生菌Wolbachia进行分子生物学鉴定,确定该蓟马体内Wolbachia的进化位置,为进一步探讨Wolbachia对其生殖作用的调控机制提供理论依据。【方法】以wsp基因为目的基因,对美洲棘蓟马体内的共生菌Wolbachia进行特异性扩增和测序,使用Clustal X 1.83软件对所得DNA序列进行比对;在MEGA 4.0软件中采用邻接法对Wolbachia的系统发育关系进行分析。【结果】利用wsp基因的特异性引物从美洲棘蓟马体内扩增出了632 bp的Wolbachia的wsp基因片段(GenBank登录号为JN315668),580 bp的Wolbachia A群的wsp基因片段和405 bp的Mel亚群的wsp基因片段。系统发育分析结果表明,美洲棘蓟马体内的Wolbachia与黑腹果蝇亲缘关系较近。【结论】美洲棘蓟马体内感染的Wolbachia属于A群Mel亚群。     

加州新小绥螨对截形叶螨的捕食作用

为明确加州新小绥螨Neoseiulus californicus(McGregor)对截形叶螨Tetranychus truncate(Ehara)的捕食潜力,采用捕食者功能反应方程及参数研究加州新小绥螨对截形叶螨各螨态捕食作用。结果表明,加州新小绥螨对雌成螨、若螨、卵的选择性捕食系数分别为0.365、1.276和1.390。在不同温度条件下,加州新小绥螨对截形叶螨的功能反应均属于HollingⅡ型;对猎物卵和幼若螨的控制能力最强。在试验温度范围内,加州新小绥螨的捕食能力随温度升高呈先增后减趋势,28℃时最强,对截形叶螨雌成螨、若螨和卵的攻击系数(a)最大,分别为0.639、0.730和0.842;处理时间最短,分别为0.126、0.075和0.039d;最大日捕食量分别为7.943头、13.405头和25.575粒。加州新小绥螨的捕食作用存在较强的种内干扰反应,随着捕食者密度的增大,平均捕食量逐渐减少,捕食作用率也相应降低,捕食作用率与其自身密度的关系为E=0.423P-0.747。     

山葡萄C4H基因的克隆表达及遗传转化分析

通过生物学技术来研究C4H基因在山葡萄着色过程中的作用,进而揭示山葡萄果皮着色的分子机理;利用RT-PCR技术克隆了山葡萄C4H基因的全长cDNA序列,并对该蛋白进行生物信息学分析,预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测C4H基因在山葡萄8个不同转色时期的表达量,将克隆获得的山葡萄C4H基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3),并通过不同浓度的IPTG诱导表达, SDS-PAGE检测表达产物.为了验证山葡萄C4H基因的功能,构建了表达载体pC C4H并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化,在含50 mg/L Kan的培养基上对T_0代种子进行筛选.克隆获得的山葡萄C4H cDNA全长1 735 bp,开放阅读框1 518 bp,编码505个氨基酸,该基因表达产物分子质量为57.70 KDa,等电点值9.06.C4H基因在山葡萄果皮转色各个时期均存在表达;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,拟南芥遗传转化先后得到3个阳性幼苗.对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性, 2株叶片颜色均变成紫红色;经花色素苷质量浓度的测定表明其质量浓度比对照组植株高出3倍.在拟南芥中花色素苷质量浓度虽然较低,但还是能少量合成,说明其花色素苷生物合成途径是开通的,只是积累的量较少.     

Pina新等位变异Pina-D1o的分离及分析

Puroindoline基因(Pina和Pinb)是控制小麦籽粒硬度的主效基因,决定小麦加工品质,分离该基因的新等位变异有利于小麦籽粒硬度性状的改良。采用同源克隆方法从节节麦(Aegilops tauschii,DD PI603224)中分离到一个Pina新等位变异Pina-D1o。生物信息学分析表明,该基因编码区全长447bp,编码148个氨基酸残基,具有小麦族作物PinA蛋白所特有的WRWWKWWK色氨酸结构域和10个半胱氨酸所形成的5个二硫键结构。根据核苷酸序列构建的拓扑树,Pina-D1o与Pina-D1m、Pina-D1n相同,均由功能性等位变异Pina-D1a发生单基因突变而来,因而Pina-D1o有可能来源于Pina-D1a。可见,新等位变异类型PinaD1o的发现可以为小麦的籽粒硬度改良提供基因资源。     

牙鲆变态发育过程中epigen基因的空间表达分布

细胞分裂在鲽形目鱼类变态过程中发挥了重要作用。Epigen作为表皮分裂原,通过激活MAPK通道来调控有丝分裂。以前的研究利用定量PCR表明,epigen在变态前期表达量升高,而变态后期表达量下降,表明其与变态发育相关。为了进一步调查epigen与牙鲆变态发育的关系,利用RNA整体原位杂交技术检测了epigen在变态期牙鲆体内的空间表达分布,发现在变态期的各个阶段,epigen基因表达分布均比较广泛,表皮、鳃、肝脏、肠道、鳍条、支鳍骨、肌节等组织都有表达,在牙鲆变态前和变态早期(E期)信号较强,而在变态高峰期(F期和G期)和变态后期(H期)信号逐渐变弱。Epigen空间表达分布模式提示,其作为表皮分裂原,可能广泛参与牙鲆变态发育早期事件,尤其可能与肝脏、肠道、支鳍骨和鳍条的发育有关。