新疆多浪羊IL-1β基因原核表达载体的构建与表达

【目的】构建新疆多浪羊IL-1β基因编码区的原核表达载体,在大肠杆菌中进行诱导表达,为进一步研究IL-1β蛋白的结构功能奠定基础。【方法】从含质粒pMD-18T-IL-1β的大肠杆菌DH5α中获取IL-1β基因,与pET-28b质粒DNA连接,构建原核表达载体pET-28b-IL-1β。先将其转化到克隆载体E.coli DH5α感受态细胞中大量拷贝,经菌液PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定后,提取pET-28b-IL-1β质粒转化到表达载体E.coli BL21(DE3)中,再次进行菌液PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定。将阳性单克隆接种于LB液体培养基,以终浓度为1mmol/L IPTG进行诱导,用SDS-PAGE电泳检测IL-1β蛋白的表达及存在形式,通过Western blotting验证表达产物是否为目的蛋白。【结果】成功构建了新疆多浪羊IL-1β基因的原核表达载体pET-28b-IL-1β,该载体经诱导后表达出融合蛋白,分子质量为32.4ku,主要以包涵体的形式表达;经Western blotting检测,带有6×His标签的融合蛋白有很好的反应原性。【结论】成功构建了新疆多浪羊IL-1β基因的原核表达载体pET-28b-IL-1β,其在大肠杆菌BL21(DE3)中经诱导后表达出分子质量约为32.4ku的IL-1β融合蛋白。     

羊口疮病毒安徽株116基因的生物信息学分析及原核表达

为了对羊口疮病毒（Orf virus, ORFV）安徽株116基因进行生物信息学分析及原核表达。以ORFVAH-F10株为模板PCR扩增116基因,使用生物信息学软件预测该基因编码蛋白的结构与功能。同时将扩增产物克隆至pET-32a（＋）原核表达载体,经BamH I及EcoR I双酶切鉴定后进行测序,构建pET-32a（＋）-116重组质粒。转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）进行IPTG诱导,纯化蛋白后免疫BALB/c雌性小鼠制备多克隆抗体。测序结果显示,ORFV116基因全长561 bp,编码186个氨基酸。生物信息学分析结果显示：该蛋白分子量约为20.33 kDa,为不稳定亲水性蛋白;无信号肽、保守结构域及跨膜结构域;含有2个N糖基化位点和42个磷酸化位点;二级结构以无规则卷曲为主,分别为延伸链（5.91%）、α-螺旋（14.52%）与无规则卷曲（79.57%）;预测该蛋白含有20个可能的B细胞优势抗原表位与4个CTL细胞表位。SDS-PAGE及Western-blot结果显示,ORFV116蛋白大小约为51 kDa,主要以可溶形式表达且具有良好的反应原性。     

新疆卡拉库尔羊Fas基因原核表达载体的构建及表达

根据GenBank的羊Fas细胞凋亡因子序列设计1对特异性引物,将EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点引入到引物两端,同时加上保护性碱基。利用RT-PCR技术,从新疆卡拉库尔羊外周血淋巴细胞总RNA中扩增出特异性基因片段。将分离纯化后的PCR产物与pMD-18T载体进行连接,利用双酶切反应与菌液PCR对阳性重组克隆进行鉴定筛选,然后进行序列测定。使用原核表达载体pET28a来完成Fas的定向克隆,成功构建重组融合表达质粒pET-28a-Fas,然后将质粒转化至E.coli BL21感受态,设置不同IPTG浓度和诱导温度,选择最佳的表达条件,然后初步纯化重组融合蛋白。结果表明,在pET28a表达载体中,Fas基因的插入方向和读码框均正确;同时Fas基因也完成在E.coli BL21融合表达的目的,融合蛋白分子质量为39.7 ku。     

山羊痘病毒疫苗株 ORF103基因的克隆、 序列分析及原核表达

根据GenBank已登录的GTPV基因组序列,设计并合成1对特异性引物,以GTPV疫苗株基因组DNA为模板,PCR扩增获得ORF103基因片段并进行序列分析,再将该基因片段亚克隆于原核表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-ORF103,经鉴定正确后转化BL21感受态细胞进行诱导表达,并进行SDSPAGE和Western blot检测。成功克隆GTPV疫苗株ORF103基因片段。重组菌经IPTG诱导后成功表达分子质量约为35ku的重组蛋白,该蛋白能与山羊痘阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性。研究结果为GTPV的分子生物学特性研究提供资料,并为进一步研制GTPV抗体检测试剂盒奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒COE基因的原核表达和免疫原性分析

为研究猪流行性腹泻病毒中COE基因的原核表达情况及免疫原性,从感染猪流行性腹泻病毒的猪体内采集肠内容物、肠段及肠系膜淋巴结,参照GenBank中所收录的猪流行性腹泻病毒（PEDV）CV777株的COE基因序列设计1对特异性引物,通过RT-PCR扩增出COE基因,克隆到原核表达载体pET-32α上,并构建重组表达质粒pET-32α-COE,在大肠杆菌Rosetta中进行表达,并进行Western blot检测。结果显示,重组蛋白获得了高效的表达,并能与多抗血清发生特异的免疫印迹反应。COE基因是猪流行性腹泻病毒的中和抗原位点,具有良好的免疫学活性。     

麦洼牦牛 Hoxa10基因克隆、原核表达及组织表达谱

从麦洼牦牛肾脏组织提取总RNA,以已公布牛 Hoxa10编码区序列设计引物,RT PCR法克隆麦洼牦牛 Hoxa10基因;构建原核表达载体pET 32a(+) Hoxa10,并在大肠杆菌表达系统中表达,SDS PAGE检测融合蛋白;采用RT PCR检测该基因在麦洼牦牛各组织中的表达分布。结果表明：从麦洼牦牛肾脏中克隆 Hoxa10基因的CDs区,大小为285 bp,编码94个氨基酸残基,与牛、猪和绵羊的 Hoxa10同源性高;经IPTG诱导,pET 32a(+) Hoxa10在BL21中可表达1个大小约为28 ku的特异蛋白;在牦牛各组织中,肾脏和肺脏中表达较高,但在心脏表达量极低或不表达。     

杜仲Fls基因的克隆及原核表达

【目的】克隆杜仲黄酮醇合成酶基因(Fls)全长,对其开放阅读框(ORF)进行原核表达分析。【方法】以杜仲叶片为材料提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆杜仲Fls基因;Fls基因的ORF经限制性内切酶酶切,构建其原核表达载体pET-28a-Fls;最后利用IPTG诱导Fls基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。【结果】获得了黄酮醇合成酶基因全长序列,长度为1 220bp,ORF为1 011bp,编码336个氨基酸;成功构建了原核表达载体pET-28a-Fls;利用IPTG诱导Fls在BL21(DE3)中表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在约44ku处有特异性的蛋白条带出现。【结论】获得了杜仲Fls基因的全长和ORF,并成功对其进行了原核表达。     

犬细小病毒VP_2基因原核表达载体的构建与分析

从犬细小病毒/犬瘟热进口二联苗中提取犬细小病毒基因组DNA,以此为模板进行PCR扩增,PCR产物经BamH I和XhoI双酶切后,克隆至pET22b(+)质粒的相应位点上,构建了原核表达载体pET22b/VP2.重组质粒经限制性内切酶酶切和核苷酸序列分析表明,VP2基因已正确克隆到pET22b(+)载体上,从而成功地构建了pET22b/VP2表达载体.     

小麦TaSPL17基因的克隆、组织特异性表达及原核表达分析

具有SBP结构域的SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)蛋白是一类植物特有的转录因子,在植物的生长发育过程中发挥重要的调控作用。为了进一步研究小麦基因TaSPL17的功能,本研究通过同源克隆的方法,从普通小麦品种‘小偃22’中克隆得到TaSPL17基因全长CDS序列。生物信息学分析表明,该基因开放阅读框长度1 158bp,编码385个氨基酸,理论分子质量40.25ku,理论等电点为9.12。半定量RT-PCR结果显示,TaSPL17在小麦根、茎基部、叶片、幼穗中均有表达,在幼穗和茎基部中表达量最高,根次之,在叶片中表达量最少,表明TaSPL17基因可能与小麦的分蘖和穗部的发育有关。将基因TaSPL17与载体pGEX6P-1连接构建原核重组表达载体pGEX6P-1-TaSPL17,然后将其转入大肠杆菌DH5α并对诱导表达的时间、IPTG浓度、温度进行优化,SDS-PAGE分析表明,融合GST标签的TaSPL17在温度37℃,IPTG浓度为0.4mmol/L,诱导3h后表达量最大,有助于进一步纯化TaSPL17蛋白质。     

BVDV-2 E2基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据GenBank登录的BVDV-2 E2基因序列,设计特异性引物,对BVDV-2新疆SW分离株E2基因进行RT-PCR扩增,克隆入T载体中测序,然后亚克隆入华赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,构建重组表达载体pPIC9K-E2。用SalⅠ酶切线性化重组质粒pPIC9K-E2,电转化酵母GS115,通过G418筛选重组酵母菌GS115-pPIC9K-E2,用φ=1.5%甲醇诱导,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。SDS-PAGE分析证实表达的重组融合蛋白分子质量为23.2ku;Western blot分析表明,该重组蛋白可与BVDV-2多克隆抗体发生特异性血清学反应,证实表达的重组E2蛋白具有良好的反应原性。     

牛乳头瘤病毒2型L1基因真核表达载体的构建及真核表达

为在真核细胞中表达牛乳头瘤病毒2型(BPV2)衣壳蛋白L1基因。采用PCR方法从奶牛皮肤肿瘤病料中扩增BPV2沙湾分离株L1基因,克隆入pMD18-T载体中,测序后进行序列分析。以pcDNA 3.1(+)为真核表达载体构建重组表达质粒,转染入BHK-21细胞,通过间接荧光免疫试验检测BPV2-L1蛋白的表达。本研究成功构建pcDNA3.1(+)-BPV2-L1重组真核表达质粒,证实能表达出BPV2-L1蛋白,为BPV2DNA疫苗的研发提供了前期基础。     

新疆野生核桃 JfDREB1A基因的克隆与原核表达分析

为探究 DREB1A基因在新疆野生核桃响应低温胁迫中的作用及表达特性,以新疆野生核桃群体中的‘小矩圆’类型为试验材料,根据同源克隆的方法得到 JfDREB1A基因的cDNA全长序列,利用荧光定量PCR检测其在低温胁迫条件下的表达水平;将该基因片段重组到pET-28a(+)原核表达载体上,转化到大肠杆菌（DE3）感受态细胞中诱导表达。结果表明,获得了新疆野生核桃中的DREB1A,将其命名为 JfDREB1A,该基因的开放读码框长度为645 bp,具有典型的 DREB1/CBF转录因子结构特征,JfDREB1A蛋白与其他植物DREB1蛋白具有高度保守性,与核桃亲缘关系最近。RT-PCR分析显示在4 ℃低温胁迫下, JfDREB1A基因的表达量迅速上调,8 h时达到最大。成功构建了pET-28a-JfDREB1A重组表达质粒,得到大小约为29 ku的融合蛋白,与预测蛋白大小相符,该蛋白在大肠杆菌中最佳诱导条件是诱导剂IPTG浓度为0.5 mmol/L,诱导2 h。     

拟南芥At4g12500基因原核表达载体的构建

[目的]构建拟南芥At4g12500基因的原核表达载体。[方法]以野生型Col-0拟南芥基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增出At4g12500基因编码序列,用BamHⅠ和XhoⅠ对目的片段进行双酶切后,与BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后的pET-28a质粒连接,以得到原核表达载体。[结果]该试验成功地构建了pET28a-At4g12500原核表达载体,并已转化至E.coil BL21(DE3)表达菌株中。[结论]为后续At4g12500基因的表达与功能分析奠定基础。     

犬瘟热病毒H基因原核表达质粒的构建

为H蛋白进一步表达作为诊断用抗原、建立特异的犬瘟热病毒(CDV)抗体检测方法及CDV的预防奠定基础,以已构建含有犬瘟热病毒H基因的pMD18-H质粒为模板,利用合成的特异性引物进行PCR扩增,得到1824bp的目的DNA片段,将所得H基因克隆至经相同双酶切处理后的pET32a(+)原核表达载体中,获得重组质粒pET32...     

TmFAD2和BnFAD3双基因载体的构建及转化株脂肪酸分析

必需脂肪酸亚油酸(18∶2)和亚麻酸(18∶3)在植物中的合成过程一直备受研究者的关注。本研究利用旱金莲中合成亚油酸的油酸脱饱和酶基因TmFAD2及甘蓝型油菜中合成亚麻酸的亚油酸脱饱和酶基因BnFAD3,在pRD400骨架载体的基础上,构建同时表达TmFAD2和BnFAD3的串联双价载体pSFF。通过农杆菌介导的花序浸蘸法完成pSFF对拟南芥哥伦比亚野生型的转化,观察发现转基因植株的第1对真叶有不同程度的畸形。按照畸形程度将其划分为4个等级,气相色谱分析4个等级叶片及其后代种子中脂肪酸的组成及含量,发现随着畸形程度的增高,叶片和种子中亚麻酸C18∶3含量都呈现降低的趋势。     

小反刍兽疫病毒疫苗株N和M基因的克隆、序列分析及原核表达

根据GenBank已登录的PPRV基因组序列,设计并合成2对特异性引物,以PPRV疫苗株基因组为模板,经RT-PCR扩增获得N和M基因并进行序列分析,再将2个基因插入到原核表达载体pET-28a中,经鉴定正确后转化BL21感受态细胞进行IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE和Western blot检测。成功克隆PPRV疫苗株N和M基因,重组菌经IPTG诱导后表达分子质量为57.7ku N蛋白(核衣壳蛋白)和38.1ku的M蛋白(基质蛋白),2个蛋白均能与小反刍兽疫阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性。     

表皮葡萄球菌8-32-B 株aap基因domain B的原核表达

为获得表皮葡萄球菌aap基因domain B片段的原核表达产物,采用PCR方法扩增引起新疆南疆地区奶牛乳房炎的表皮葡萄球菌株aap基因domain B片段,并克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组质粒pET-32a(+)-aap,将重组质粒转化至宿主菌E.coli BL21中诱导表达。结果表明,克隆得到aap基因domain B片段为2 316bp,Aap蛋白分子质量184.5ku。在宿主菌E.coli BL21中表达的最佳诱导时间为4h,IPTG最佳诱导浓度为0.75mmol/L;纯化时洗杂缓冲液中咪唑浓度为40mmol/L,洗脱缓冲液中咪唑浓度为200mmol/L时可以获得单一Aap蛋白。