应用双重PCR检测产毒素多杀性巴氏杆菌

参照有关文献设计了2对引物。分别扩增多杀性巴氏杆菌的Kmt及toxA基因。以使同时检测并区分产毒素与非产毒素多杀性巴氏杆菌。该PCR能检出10^3cfu菌量的模板。特异性试验表明。这2对引物都不能从猪的其他6种常见病原菌扩出特异性的带。对扩增的2个PCR产物测序结果表明，2序列都有很高的保守性，从而进一步证明了该PCR方法的特异性及灵敏性。临床应用，从386份病料分离出66株多杀性巴氏杆菌，其中有8株均能同时扩出457bp和864bp的片段，而其他54株只能扩出457bp的片段。     

产毒素多杀性巴氏杆菌菌落双重PCR检测方法的建立

为建立快速特异的PCR方法以及同时检测并区分产毒素与非产毒素多杀性巴氏杆菌,本研究根据GenBank登录的多杀性巴氏杆菌KMT1基因和toxA毒素基因序列,设计合成了2对特异引物。特异性试验表明产毒素多杀性巴氏杆菌C51-6扩增出了460bp和1854bp的2条目的片段,而不产毒素多杀性巴氏杆菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌、支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌和鸡白痢沙门菌的扩增均为阴性;敏感性试验表明该PCR方法能从含450CFU的菌液中扩增出相应的目的片段。同时用豚鼠皮肤坏死试验和小鼠致死试验对该PCR方法进行了验证。     

多杀性巴氏杆菌毒素的研究进展

多杀性巴氏杆菌毒素(Pasteurella multocida toxin,PMT)是一种由D型多杀性巴氏杆菌分泌的毒素蛋白,作为猪萎缩性鼻炎的主要致病因子而备受关注。PMT作为一种有丝分裂原,通过细胞内多条信号通路影响细胞的生长和分化。PMT可分为N端和C端两大结构域,N端被认为与受体结合以及跨膜转运有关,C端具有催化活性。近年来,也有人认为PMT与致癌因素有关。随着PMT研究的深入,PMT疫苗也正成为研究的一个热点。本研究就PMT胞内活性、结构与功能等最新研究进展进行概述。     

猪多杀性巴氏杆菌皮肤坏死毒素的毒力及免疫原性研究

为研究致猪萎缩性鼻炎的主要病原体—多杀性巴氏杆菌皮肤坏死毒素(PMT)的毒力及免疫原性,本研究从A型多杀性巴氏杆菌中提取、纯化该毒素后获得粗提的PMT,含量约为3 200μg/mL,纯度约2.2％;经纯化后纯度可达90％以上;将不同剂量的PMT感染小鼠,测定其半数致死量(MLD50),同时将不同剂量PMT感染仔猪,测定...     

猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及毒素检测

多杀性巴氏杆菌(pasteurella multocida，Pm)在世界各地分布非常广泛，在畜禽中带菌率较高，有资料指出，猪的鼻道深处和喉头内，带菌率为30．9％。多杀性巴氏杆菌按荚膜的不同可分为A、B、C、D和E5个血清型，其中A、B和D型已在猪中发现；多杀性巴氏杆菌还有16个体细胞血清型，在猪中检测到的有血清3型与5型，     

产毒多杀性巴氏杆菌研究进展

产毒多杀性巴氏杆菌 (T Pm)是引起猪传染性萎缩性鼻炎的主要病原菌。对 T Pm的检出及高效疫苗的研制是根除猪传染性萎缩性鼻炎的关键。产毒多杀性巴氏杆菌毒素是一种皮肤坏死毒素 ,也是一种活性很强的有丝分裂原 ,单独就可引起细胞 DNA的合成及分裂。基于此毒素的特性 ,已经建立了诸如豚鼠皮肤坏死实验、小鼠致死实验、细胞促生长实验、胎牛肺细胞毒性实验、EL ISA及 PCR等方法来检测产毒多杀性巴氏杆菌。随着人们对产毒多杀性巴氏杆菌毒素活性的研究 ,猪传染性萎缩性鼻炎的疫苗也逐渐向更安全、有效的毒素疫苗发展。文章主要对 T Pm的检测方法、毒素生物学活性及疫苗的发展进行了概述     

产毒多杀性巴氏杆菌的生物学试验与ToxA基因鉴定

本试验基于T＋Pm产生皮肤坏死毒素的生物学活性,采用豚鼠皮肤坏死试验检测Pm分离物所产毒素的特征并进行病理组织学观察;针对猪萎缩性鼻炎Pm菌株的toxA基因选择不同引物,鉴别T＋Pm与T—Pm分离物。针对ToxA基因中的1230bp片段,将分离自有萎缩性鼻炎临床症状猪群的17株多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamultocida,Pro）进行PCR扩增,其中4株Pm分离菌株确定为产毒多杀性巴氏杆菌（ToxingenicPasteurellamultoci da,T＋Pm）,占23．53％（4／17）。本试验丰富了猪源多杀性巴氏杆菌的基因资源,在猪萎缩性鼻炎的诊断、防制和净化上具有应用价值。     

猪源D型产毒素多杀性巴氏杆菌毒素基因的原核表达

参照GenBank收录的产毒素多杀性巴氏杆菌toxA基因序列(AF240778),设计一对引物,从猪源D型产毒素多杀性巴氏杆菌中扩增出toxA编码区3 858 bp的片段,将其克隆至原核表达载体PET-32a,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中进行融合表达多杀性巴氏杆菌毒素。SDS-PAGE和Western blot分析证实,该表达产物以包涵体形式存在,大小约175 ku。动物试验结果表明,重组蛋白具有良好的免疫原性、反应原性及一定的生物学活性。通过间接ELISA方法检测抗毒素的猪阳性血清,表达重组蛋白较天然蛋白具有更高的特异性,为多杀性巴氏杆菌毒素进一步应用奠定了基础。     

应用巢氏PCR方法快速检测猪鼻拭子样品中产毒素多杀性巴氏杆菌

根据产毒素多杀性巴氏杆菌的toxA基因序列,设计了2对特异性引物,扩增的片段大小分别为864和447 bp,从而建立了一种能直接从猪鼻拭子中快速检测产毒素多杀性巴氏杆菌的巢氏PCR方法。该方法能检出26CFU菌量以上的模板DNA,且不能从猪的其它7种常见病原菌扩增到特异性条带。通过对5个不同地区阳性猪群中采集的146份临床鼻拭子样品进行巢氏PCR检测和细菌分离鉴定,结果2种方法同时为阳性的样品有44份,同时为阴性的样品有97份,另有5份样品只有巢氏PCR检测为阳性,巢氏PCR检测与细菌分离鉴定的符合率为96.58%。试验表明:巢氏PCR方法能快速、灵敏地从猪鼻拭子样品中检出产毒素多杀性巴氏杆菌,适合临床进行大规模病原学检测,具有良好的应用前景。     

猪源D型产毒素多杀性巴氏杆菌toxA基因的克隆与表达

皮肤坏死毒素（Dermonecrotic toxin，DNT）是产毒素多杀性巴氏杆菌（Toxigenic Pasteurella multocida，T^＋Pm）的主要毒力因子和保护性抗原。以猪源D型T^＋Pm的基因组DNA为模板，用PCR方法扩增得到了编码DNT的toxA全基因编码序列，共4019bp。将其克隆到pMD18-T载体并测序，结果表明，toxA基因序列与GenBank已报道的5个toxA基因序列的同源性达99．8％以上。将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-KG的GST基因下游，转化BL21（DE3）大肠杆菌，经IPTG诱导表达，获得大小约173000的融合蛋白。Western blot结果表明，该融合蛋白具有良好的反应原性。动物试验表明，该重组蛋白可以诱导小鼠产生高水平的抗体，并可抵抗致死剂量的天然DNT毒素攻击。     

菌落多重PCR鉴定不同荚膜血清型的多杀性巴氏杆菌

参照文献报道的多杀性巴氏杆菌KMT1基因和荚膜生物合成位点hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJf、cbD基因的序列合成了6对特异性引物,建立了多杀性巴氏杆菌种和型的菌落多重PCR方法。结果表明,本所保藏的A、B、D、E、F各型多杀性巴氏杆菌均扩增出了相应的预期片段,PCR结果与Biolog鉴定结果和Carter氏间接血球凝集试验结果相一致;而支气管败血波氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、大肠埃希菌、猪链球菌和粪肠球菌的扩增均为阴性。     

猪的胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌复合PCR检测方法的建立

在已经建立猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)、猪多杀性巴氏杆菌(PM)、副猪嗜血杆菌(HPS)的单项PCR诊断方法的基础上,通过对扩增条件的优化,成功地建立了APP、PM、HPS的复合PCR实验室诊断方法,利用一次PCR反应,即可同时扩增出APP的342bp、PM的457bp和HPS的821bp的特异性片段。该复合PCR能同时检测到100个每种细菌或50pg的APP或HPS的DNA和500pg的PM的DNA。该三重复合PCR的敏感性同已报道的单PCR一致。该方法的建立对临床上进行这3种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测都具有重要意义。     

大灰袋鼠多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定

2010年5月,北京动物园饲养的1只大灰袋鼠急性死亡。解剖发现其胰腺、心肌、大网膜、肾上腺等大面积出血。无菌采集肝、脾、大网膜接种于血琼脂培养基,分离到一株细菌。对细菌纯培养物进行形态学观察,并分别做氧化酶、触酶、糖发酵等生化特性试验,初步判定为多杀性巴氏杆菌。同时,API鉴定系统显示,该菌为氧化酶阳性、触酶阳性。API20E鉴定试纸鉴定为多杀性巴氏杆菌,鉴定百分率为90%。用该菌的培养物对6只小白鼠做致病性试验。6只小鼠均于6 h内死亡,经剖检均从心血中分离到较纯的多杀性巴氏杆菌。进一步说明分离到的菌株为多杀性巴氏杆菌。     

猪源多杀性巴氏杆菌PCR鉴定方法的建立

为建立一种灵敏、特异的猪源多杀性巴氏杆菌PCR检测方法,根据GenBank已公布的多杀性巴氏杆菌plpE基因序列的保守片段设计合成引物,经plpE基因阳性质粒构建、反应条件的优化、特异性试验和敏感性试验,对猪源多杀性巴氏杆菌特异性PCR检测方法进行了研究;并将该PCR方法用于检测来自四川省6个规模化猪场的64份疑似多杀性巴氏杆菌肺部组织样品。结果显示,建立的PCR方法具有良好的特异性和敏感性,检测的敏感性为5×101拷贝的目的基因;多杀性巴氏杆菌(A、B、D血清型)PCR均为阳性、APP和HPS等病原均为阴性;64份临床疑似样品中检出36份样品阳性,阳性检出率为56.2%。以plpE基因初步建立的多杀性巴氏杆菌PCR检测方法具有较好的特异性、重复性、敏感性和可靠性,可用于多杀性巴氏杆菌的检测鉴定。     

猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌复合PCR检测方法的建立

目的建立可以同时检测猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的快速而可靠的PCR检测方法。方法和结果根据胸膜肺炎放线杆菌的Apx-VIA基因序列、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的16SrRNA基因序列设计5条引物。猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌模板的PCR扩增产物大小分别为342bp,485bp和1258bp。复合PCR对1～12型猪胸膜肺炎放线杆菌标准株,6株多杀性巴氏杆菌标准株,1～15型副猪嗜血杆菌以及25株经生化鉴定确认为上述三种细菌的分离株的基因组DNA作为模板进行检测,均获得预期大小的扩增产物。以猪放线杆菌、吲哚放线杆菌等14种常见细菌作为阴性对照进行PCR检测,结果仅有支气管败血波氏杆菌产生了可以和上述三个特异性条带明显区分的PCR产物。复合PCR针对胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的敏感性分别为14pg、34pg和37pg。结论本研究建立的复合PCR特异性好,敏感性高,可以用于猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的快速检测。