玉米质体型AGPase小亚基和糖酵解关键酶PPDK1互作关系的研究

【目的】利用双分子荧光互补(BiFC)技术,在烟草叶肉细胞中分析玉米ADP-葡萄糖焦磷酸化酶质体型小亚基(AGPase-bt2)与丙酮酸磷酸双激酶(PPDK1)之间的相互作用。【方法】构建326-CYCHA-AGPase-bt2和326-CYNEE-PPDK1双分子荧光表达载体,转化农杆菌EHA105,瞬时浸染烟草叶肉细胞,激光共聚焦显微镜下观察AGPase-bt2和PPDK1的相互作用。【结果】双酶切试验表明,326-CYCHA-AGPase-bt2、326-CYNEE-PPDK1载体构建正确;PCR结果证实,植物表达载体成功转化到农杆菌EHA105中;浸染烟草叶片后,AGPase-bt2和PPDK1在叶肉细胞中高效表达,出现BiFC荧光信号。【结论】AGPase-bt2和PPDK1在植物细胞内存在真实互作关系。     

双分子荧光互补技术（BiFC）分析玉米SSⅠ与PPDK1之间的蛋白互作

【目的】分析玉米胚乳可溶性淀粉合成酶(SSⅠ)与质体型糖酵解途径关键催化酶丙酮酸磷酸双激酶(PPDK1)的蛋白互作关系,揭示可能发生互作的亚细胞位置。【方法】采用酶切连接的方法构建326-CYCHA-ss1和326-CYNEE-ppdk1双分子荧光互补表达载体,转化农杆菌EHA105,瞬时浸染烟草叶片组织,激光共聚焦显微镜下观察SSⅠ和PPDK1相互作用产生的荧光信号。【结果】双酶切试验鉴定表明,326-CYCHA-ss1和326-CYNEE-ppdk1重组载体构建正确;PCR结果证实,植物表达载体成功转化到农杆菌EHA105中;双分子荧光互补试验中,可观测到SSⅠ和PP-DK1相互结合而产生的黄色荧光信号。【结论】证实SSⅠ和PPDK1能够在植物活体细胞内发生真实的蛋白互作。     

家稗Pdk基因叶片特异性表达载体的构建及农杆菌的导入

【研究目的】构建含家稗Pdk基因的叶片特异性表达载体;【方法】通过PstI和SalI单酶切分别从质粒pRGN及pUCm-Pdk上获得Rubisco小亚基启动子和Pdk基因,将其连入表达载体pCAMBI1301,并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌EHA105;【结果】构建了由Rubisco小亚基启动子调控的Pdk基因植物表达载体p1301-Prbs-Pdk,选择标记基因为Hpt(潮霉素磷酸转移酶基因),经酶切和PCR鉴定,表达载体已成功导入农杆菌EHA105中;【结论】丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)是C4光合途径中的关键光合酶,本实验中构建了含有rbcs启动子的适于单子叶植物转化的Pdk基因表达载体,为提高转基因植物光合效率奠定了基础。     

拟南芥开花抑制因子TFL1与GRFs蛋白的相互作用

【目的】研究拟南芥开花抑制因子TFL1与2个GRFs家族成员GRF4和GRF7之间的互作关系,为进一步解析TFL1抑制植物开花的分子机制奠定基础。【方法】以拟南芥cDNA作为模板,利用基因特异性引物,克隆TFL1、GRF4和GRF7,分别连接入门载体pCR8,经菌落PCR扩增和测序鉴定分别获得这3个基因的入门载体TFL1-pCR8、GRF4-pCR8和GRF7-pCR8。利用LR重组的方法将上述3个入门载体分别与目标载体pGADT7和pGBKT7重组获得酵母双杂交试验载体TFL1-BD、GRF4-AD和GRF7-AD。将TFL1-BD载体分别与GRF4-AD或GRF7-AD载体共同转化酵母感受态细胞,于双缺(-Leu/-Trp)培养基上30℃培养2—3d直至长出酵母克隆,选取合适大小的酵母菌落转移到双缺(-Leu/-Trp)和四缺(-Leu/-Trp/-His/-Ade)缺陷培养基上,通过观察酵母菌落的生长情况判断TFL1与GRFs之间的互作关系。利用LR重组的方法将上述3个入门载体分别与目标载体px-nYFP和px-cYFP重组获得TFL1-nYFP、TFL1-cYFP、GRFs-nYFP、GRFs-cYFP双分子荧光互补试验载体,并分别转化农杆菌感受态细胞。将转化TFL1-nYFP或TFL1-cYFP载体的农杆菌分别与转化GRFs-nYFP或GRFs-cYFP载体的农杆菌共注射烟草叶片,培养48h后在荧光共聚焦显微镜下观察烟草细胞中YFP荧光的表达情况。通过YFP荧光信号的有无来判断TFL1与GRFs之间的互作关系。【结果】成功克隆到拟南芥中的3个基因,分别是534bp的TFL1、888bp的GRF4和798bp的GRF7,并分别获得其入门载体(TFL1-pCR8、GRF4-pCR8和GRF7-pCR8)、酵母双杂交试验载体(TFL1-BD、GRF4-AD和GRF7-AD)和双分子荧光互补试验载体(TFL1-nYFP、TFL1-cYFP、GRFs-nYFP和GRFs-cYFP)。在酵母双杂交试验中,相较于阴性对照组,共同转化TFL1-BD与GRFs载体的酵母菌落在双缺(-Leu/-Trp)和四缺(-Leu/-Trp/-His/-Ade)培养基上都生长较好,结果表明TFL1与GRF4、GRF7在酵母中直接相互作用。在双分子荧光互补试验中,相较于阴性对照组,将转化TFL1-cYFP载体的农杆菌与转化GRFs-nYFP载体的农杆菌共注射烟草细胞之后均在烟草细胞核内产生较强的YFP荧光信号;与此同时,将转化TFL1-nYFP载体的农杆菌与转化GRFs-cYFP载体的农杆菌共注射烟草细胞之后同样在烟草细胞核内产生较强的YFP荧光信号。结果表明,TFL1与GRF4、GRF7在烟草中直接相互作用。【结论】拟南芥开花抑制因子TFL1与GRFs家族的2个成员GRF4和GRF7均直接相互作用。     

转VEGF165基因红花的研究

【目的】构建转血管内皮生长因子165(VEGF165)基因的红花,为利用植物生物反应器规模化生产VEGF165奠定基础。【方法】采用PCR方法,克隆获得植物偏好性的VEGF165基因,将其与pOP质粒连接,构建重组质粒pOP-VEGF165,对其进行NcoⅠ和HindⅢ双酶切及PCR鉴定。采用冻融法将质粒pOP-VEGF165转入根癌农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导获得转化红花植株,经PCR鉴定得到转基因红花阳性植株。【结果】克隆获得了495bp的VEGF165基因片段,并成功构建了植物特异表达载体pOP-VEGF165,用其转化红花子叶后,共获得了8株转基因红花植株,其中2株鉴定为阳性。【结论】获得了转VEGF165基因的红花株系。     

水稻OsWRKY10与GFP融合基因的烟草转化及亚细胞定位观察

OsWRKY10是一个新的WRKY类转录因子。该项研究构建了OsWRKY1O基因与绿色荧光蛋白基因融合的增强表达载体pCamU.OsWRKY10-GFP。将载体转入根瘤农杆菌EHA105中，叶盘转化法转化烟草。转化植株经PCR鉴定呈阳性。通过荧光显微镜可检测到绿色荧光蛋白在根细胞的核中表达，并且OsWRKY10基因定位在细胞核。     

韧皮部特异性启动子的克隆及含绿色荧光蛋白报告基因新植物表达载体的构建

用PCR方法扩增得到了长度为966bp的笋瓜韧皮部蛋白2基因启动子片段,克隆人pUCm—T载体后,获得了新的重组质粒pUCm—PSP．分别用限制性内切酶酶切重组质粒和pCAMBIA1302植物表达载体,经回收、连接、转化和鉴定后,构建了由PSP驱动绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的新型植物表达载体pHZ03．利用细胞感受态法将新植物表达载体分别导入根癌农杆菌EHA105、GV3101、LBA4404和发根农杆菌Ri15834中．     

玉米根部特异性启动子的克隆及功能分析

【目的】从玉米幼根基因组DNA中克隆β-葡萄糖苷酶基因根部特异性启动子序列ZmGLU1P,并对其功能进行分析。【方法】利用PCR技术从玉米品种P138幼根基因组DNA中克隆玉米根部特异性启动子片段ZmGLU1P,将其与GUS基因融合,构建植物表达载体pCAMBIA121-ZmGLU1P,转化到EHA105根癌农杆菌中,通过根癌农杆菌介导法转化烟草NC89,对转化烟草植株进行PCR和Southern杂交检测。采集PCR和Southern杂交检测为阳性的转基因烟草的根、茎、叶,进行GUS活性的组织染色检测。【结果】克隆获得了ZmGLU1P片段,其长度为1 846 bp,与已报道的序列同源性达99%以上。转基因烟草植株的PCR和Southern杂交结果显示,成功地获得了转基因阳性植株;GUS活性检测表明,根中GUS活性最强,而在茎和叶等组织中GUS活性甚微,表明ZmGLU1P片段具有根部特异性启动子功能。【结论】玉米β-葡萄糖苷酶基因上游1 846 bp的片段ZmGLU1P具有根部特异性启动子功能,为根部特异性启动子。     

禽呼肠孤病毒σ3基因在烟草中的表达与鉴定

【目的】研究禽呼肠孤病毒S1基因编码的σ3基因在烟草中的表达及其表达产物的反应原性。【方法】根据Gen Bank中公布的禽呼肠孤毒株S1133的基因序列,设计特异引物扩增σ3基因,构建重组植物表达载体p BI121-σ3,热激法转化农杆菌EHA105感受态细胞,筛选含有重组质粒的p BI121-σ3的阳性工程菌株EHA105。采用农杆菌介导的叶盘法转化野生型烟草,卡那霉素筛选获得抗性植株。随后通过σ3基因的特异引物,PCR方法初步筛选获得转σ3基因的烟草植株。进一步对阳性植株通过实时荧光定量PCR方法检测σ3基因在转基因烟草中的拷贝数,以烟草自身单拷贝的内源基因核糖核酸还原酶-RNR2作为内参基因,通过梯度稀释分别构建RNR2及σ3基因的起始模板量和对应CT值的标准曲线,通过检测样品中σ3基因和RNR2基因模板量对数值的比值估算出σ3基因在转基因烟草中的拷贝数。并通过Western-blotting方法对转基因烟草中表达的σ3融合蛋白的反应原性进行分析。【结果】1通过双酶切和测序验证表明σ3基因插入位置、大小和读码框均正确,表明σ3基因已经成功的构建于植物表达载体p BI121的花椰菜花叶病毒(Ca MV)35S启动子的下游,以NOS为终止子,含有卡那霉素抗性标记(NPT II)。其表达的蛋白与下游的绿色荧光蛋白形成融合蛋白,其大小约为61.6 ku;2在转化筛选抗性植株的过程中采用350 mg·L-1的头孢霉素可以很好地抑制农杆菌的污染,100 mg·L-1的硫酸卡那霉素筛选压力能够很好地抑制非转化细胞的生长;3随机选取10株转化烟草进行PCR检测发现8株转化烟草可以扩增到清晰的目的条带约994 bp;4内参基因RNR2的标准曲线为y=-3.5352x+15.143,σ3基因的标准曲线为y=-3.5366x+1.8265,两个标准曲线的相关系数均接近于1。在检测的5株转化烟草中σ3基因的拷贝数均为4,阴性对照没有扩增。5Western-blotting显示σ3融合蛋白在转化烟草中可以正确表达,目的条带大小约为61.6 k D,与预计大小一致;σ3融合蛋白能够与禽呼肠孤病毒的阳性血清发生特异反应,表明该融合蛋白具有良好的反应原性。【结论】成功地构建了植物表达载体p BI121-σ3,筛选获得低拷贝的转σ3基因的烟草,σ3融合蛋白能够在烟草中表达且具有相应的反应原性,为进一步研究σ3基因的功能和利用植物作为生物反应器生产σ3蛋白口服疫苗的研发奠定了基础。     

水稻条纹病毒编码的NS2蛋白的亚细胞定位分析

通过RT-PCR克隆获得水稻条纹病毒（RSV）编码的蛋白NS2和拟南芥柯浩体蛋白Atcoilin的cDNA,将两者分别与表达载体pEarley102（带青色荧光蛋白,CFP）和pEarley101（带黄色荧光蛋白,YFP）同源重组.将构建好的重组载体分别转化到农杆菌EHA105中,通过农杆菌接种法将两者共同注射到本氏烟叶片表皮细胞中进行表达.在共聚焦显微镜下观察,NS2-CFP与Atcoilin-YFP能重叠在一起,表明RSV NS2定位于柯浩体.     

Virus Location and Lymphocyte Apoptosis in Lymph Nodes of Piglets Infected with PCV-2

The present study has been performed to understand the location of the virus, type of apoptotic cells, and their relation to lymph nodes of piglets infected with porcine circovirus type Ⅱ （PCV-2）. Nine 32-day-old conventional piglets free of infection with PCV-2 were used, and distributed into three groups： control group （n = 3）, piglets inoculated with PCV-2 alone （PCV-2, n = 3）, and PCV-2 inoculated and KLH immunostimulated group （PCV-2 ＋ KLH, n = 3）. Superficial inguinal lymph nodes from all piglets were collected for histological examination after 32 days postinoculation, and immunohistochemistry for PCV-2 detection. Location of apoptotic cells was detected with TdT-mediated dUTP nick end labeling （TUNEL） and cell cycle, and the apoptotic rates were measured by flow cytometry. The characteristic histopathological lesions of the piglets in PCV-2 and PCV-2 ＋ KLH were lymphocyte depletions in the cortex and paracortex of the lymph nodes, epithelioid-like macrophage infiltration, and intracytoplasmic inclusion bodies presented in epithelioid-like macrophages. PCV-2 was mainly found in epithelioid-like macrophages by immunohistochemistry. In the lymph nodes, lymphocytes presented higher apoptotic rates in the cortex by TUNEL, special B-cell areas, and similar apoptotic cells were found in this compartment in the control. The apoptotic rates of the lymph nodes were 0.41, 3.34, and 4.88% in the control, PCV-2, and PCV-2 ＋ KLH groups by flow cytometry, respectively. The apoptotic rates of lymph nodes for PCV-2 and PCV-2 ＋ KLH piglets were significantly higher than those for the control group （P〈0.05 and P〈0.01）. The proliferation index （PI） was 0.17_＋0.01, 0.12_＋0.01 and 0.12_＋0.04 in the control, PCV-2, and PCV-2 ＋ KLH group, the PI of the control group was higher than that of the other groups, but without the statistical difference. PCV-2 can induce lymphocyte depletion in lymph nodes of piglets by blocking cell proliferation and promoting apoptosis. This is one o     

不同授粉组合对‘富士’和‘新红星’苹果品质的影响

【目的】探讨不同授粉品种对苹果品质和香气物质成分差异的影响,为高效授粉树的选育和苹果品质的提高提供依据。【方法】采用自育高效授粉树‘红菱’‘红锦’‘红雾’的花粉,在‘富士’(Malus domestica‘Fuji’)、‘新红星’(M.domestica‘Starkrimson’)铃铛花期进行授粉,以授‘嘎拉’(M.domestica‘Gala’)花粉的果实为对照,对果实发育期间总类黄酮含量的变化进行研究,并在果实成熟时测定可溶性固形物、花色苷含量等品质指标及香气物质成分。【结果】不同的授粉品种条件下,‘富士’和‘新红星’苹果除可滴定酸外的各项品质指标均高于对照。‘富士’苹果经‘红菱’授粉后,其果形指数、硬度、花色苷、可溶性糖含量显著提高,分别为对照的1.12、1.15、1.28、1.12倍。‘新红星’苹果经‘红雾’授粉后,其单果重、果形指数、花色苷、可溶性固形物、可溶性糖含量均显著提高,分别为对照的1.22、1.12、2.48、1.10、1.11倍,其可滴定酸含量显著降低,仅为对照的75%。在果实发育的整个生长期内,不同授粉品种处理的‘富士’和‘新红星’苹果总类黄酮含量均高于对照,且不同品种间存在显著差异。在花后160 d,‘富士’经‘红菱’‘红锦’‘红雾’花粉授粉后,果实内总类黄酮含量与对照相比分别增长19.63%、28.72%、13.97%,‘新红星’在花后120 d分别增长14.18%、15.26%、4.24%,差异显著。‘红菱’‘红雾’‘红锦’和对照授粉处理的‘富士’和‘新红星’苹果总酯类挥发性物质的相对含量分别为50.20%、52.03%、42.68%、45.10%和71.08%、68.85%、71.83%、66.03%,‘红菱’授粉后‘富士’‘新红星’果实总酯类挥发性物质含量明显增加,其中2-甲基丁酸乙酯的含量分别为对照的1.14和203.91倍。‘富士’苹果中,‘红菱’‘红雾’‘红锦’授粉处理的果实乙酸-2-甲基丁酯的含量分别为对照的1.73、1.07、1.36倍;其己酸乙酯和乙酸丁酯的含量分别为对照的1.09、1.12、1.29倍和1.50、0.77、1.30倍。而在‘新红星’苹果中,经‘红菱’‘红雾’‘红锦’授粉后,乙酸-2-甲基丁酯和己酸乙酯的含量分别为对照的1.82、1.27、0.93倍和2.57、1.15、0.27倍;乙酸丁酯的含量分别为对照的7.83、3.48、3.30倍。此外,‘富士’和‘新红星’苹果经‘红菱’授粉后,其烃类物质含量明显高于对照,主要表现为法呢烯的增多。【结论】高效授粉树能显著提高‘富士’和‘新红星’苹果的外观和内在品质,并且与对照存在显著差异。不同授粉组合对‘富士’和‘新红星’苹果品质影响差异较大,经‘红菱’授粉,‘富士’和‘新红星’苹果品质有显著提高。     

喀斯特地区不同玫瑰混农林模式的土壤螨类群落结构特征

混农林业作为集约型土地利用和经营方式之一,运用于石漠化地区有利于土壤生物多样性的修复.2019年7月,对贵州省毕节市撒拉溪镇龙场村的玫瑰+大豆、玫瑰+苹果+大豆和玫瑰+玉米3种混农林模式样地中的土壤螨类进行了调查,以玫瑰单作为对照,共捕获土壤螨类1524头,隶属3目41科64属,以盖头甲螨属(Tectocepheus)...     

不同温度LED光萎凋对铁观音MEP上游关键基因和香气的影响

【目的】萜类化合物是乌龙茶挥发性芳香物质的重要组分,2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸途径（MEP）上游关键基因直接参与调控萜类化合物前体物质的合成。而乌龙茶香气的形成与萎凋工序密切相关,光照和温度是影响萎凋的重要因子,探讨LED光与温度在乌龙茶萎凋过程中对香气的影响,为提高乌龙茶萎凋叶香气品质提供参考。【方法】基于转录组数据,根据KEGG筛选出响应光照的MEP上游关键基因（DXS、DXR、HDS、HDR）。对一芽三叶铁观音鲜叶进行LED白光和不同温度（20℃（L20）、25℃（L25）、30℃（L30）、35℃（L35）和40℃（L40））萎凋处理,黑暗下温度（20℃（D20）、25℃（D25）、30℃（D30）、35℃（D35）和40℃（D40））萎凋处理;分别测定铁观音萎凋叶的香气组分和MEP上游关键基因的相对表达量。【结果】L30处理萎凋叶各基因表达量达到最大值,萜类基因（DXS、DXR、HDS、HDR）表达量分别为XY组（对照）的4.31、5.28、11.77、1.59倍,为D30处理的2.24、2.39、1.86和1.60倍。D30组各基因表达量为黑暗处理组最大,依次为XY组的1.92、2.21、6.34和0.99倍。L20处理萎凋叶的α-法呢烯芳樟醇氧化物（I、II）含量最高,较XY依次提高了15.05%、4.92%和15.13%;L30处理萎凋叶的橙花叔醇、芳樟醇和香叶醇含量最高,较XY组依次提高了3.71%、6.14%和15.28%;LED组铁观音萎凋叶主要香气组分含量均高于相对应的温度处理组。通过主成分分析法建立数学模型,对萎凋叶香气组分进行评估,得出L20组萎凋叶得分最高,L30组萎凋叶次之;与香气分析得出结果一致。【结论】铁观音萎凋叶基因表达量与香气含量的变化趋势不存在同步性;L30处理萎凋叶基因表达量、主要萜类香气物质含量和主成分分析得分均较高,这与铁观音生产上的萎凋温度相一致。萎凋温度过高（40℃）不利于萎凋叶萜类关键基因的表达和萜类化合物的形成。     

俄罗斯干线管道建设及其安全性

管道已成为输送石油、天然气和成品油的首选方式,而管道安全运行是管道运营管理的首要条件.介绍了俄罗斯的石油、天然气、成品油和氨干线管道的建设概况,分析了干线管道的事故状况和原因,旨在为我国油气管道在日常运行的安全监测、管理和防护等方面提供可以借鉴的经验.     

寄生虫引起的草鱼鳃病的组织病理比较研究

本文对草鱼的隐鞭虫病、车轮虫病、小瓜虫病、指环虫病、三代虫病及中华鱼蚤病六种寄生虫性鳃病的组织病理变化进行比较研究，寄生虫性鳃病均可引起鳃组织发生炎症反应，粘液分泌亢进，嗜酸粒细胞和淋巴细胞浸润；但又因病原体的种类不同，危害鱼的方式、方法不同，因此病理变化又有很大差别，对鱼危害较大的均为变质性炎，如隐鞭虫病；对鱼危害较小的则属增生性炎，如中华鱼蚤病．     

新疆数种蜘蛛记述

蜘蛛是农林害虫的重要天敌,而迄今新疆的蜘蛛区系资料缺乏。本文记述的7种蜘蛛分属4科,依次为:皿蛛科Linyphiidae的活跃皿蛛Linyphia impigra、兴旺侏儒蛛Meioneta beata和乡间侏儒蛛Meioneta rurestris,球腹蛛科Theridiidae的芦苇罗蛛Robertus arundineti,狼蛛科Lycosidae的顽皮豹蛛Pardosa lasciva,卷叶蛛科Dictynidae的开展婀蛛Argenna patula以及跳蛛科Salticidae的同足斑蛛Euophrys aequipes。     

民勤绿洲荒漠交错带三种沙丘类型的自然植被特征

基于对民勤沙井子地区植被调查数据,研究了固定沙丘、半固定沙丘和流动沙丘3种沙丘类型的自然植被特征.结果表明:从固定沙丘、半固定沙丘到流动沙丘,总盖度、灌木盖度下降,草本盖度增加.物种丰富度减小是物种多样性下降的主要原因.从植物的生活型来看,多年生草本和灌木类植物受沙丘类型的影响最大,而一年生草本和半灌木可存活于不同沙丘类型.白刺的生态优势度(重要值)由小到大依次为固定沙丘、半固定沙丘、流动沙丘.植物多样性与白刺的生态优势度呈负相关.不同沙丘类型白刺地上生物量变化明显,半固定沙丘白刺生物量最大.     

寄生虫引起的草鱼鳃病的组织病理比较研究

本文对草鱼的隐鞭虫病、车轮虫病、小瓜虫病、指环虫病、三代虫病及中华鱼蚤病六种寄生虫性鳃病的组织病理变化进行比较研究，寄生虫性鳃病均可引起鳃组织发生炎症反应，粘液分泌亢进，嗜酸粒细胞和淋巴细胞浸润；但又因病原体的种类不同，危害鱼的方式、方法不同，因此病理变化又有很大差别，对鱼危害较大的均为变质性炎，如隐鞭虫病；对鱼危害较小的则属增生性炎，如中华鱼蚤病．     

葡萄盆栽技术

葡萄盆栽技术,包括择土选种、露地扦插、田间管理、装盆及整形、肥水管理等内容,对葡萄盆栽爱好者有一定的指导意义。