不同浓度的FSH对猪腔前卵泡体外培养的影响

为确定不同浓度的FSH对猪腔前卵泡体外培养的影响,探讨最佳培养体系,比较了M199培养液中3种FSH浓度(0.5、1、2IU/mL)对腔前卵泡体外培养的影响。结果表明:FSH浓度为2IU/mL时腔前卵泡的生长率最高,2 IU/mLFSH与0.5IU/mLFSH相比,在卵泡生长率、成腔率和存活率上都存在着显著差异(P<0.05)。3个处理组腔前卵泡前5d生长率与后5d相比差异极显著(P<0.01)。结论:高浓度的FSH能显著地促进腔前卵泡的生长和腔的形成,且能够提高腔前卵泡的成活率。猪腔前卵泡体外培养呈前高后低的生长模式。     

水牛腔前卵泡体外培养效果影响因素的研究

 【目的】主要探讨水牛腔前卵泡体外培养的影响因素。【方法】采用梳刮法从沼泽型水牛的卵巢中回收得到腔前卵泡，而后用McCoy's5a培养液在96孔培养板中体外培养5～10 d，在显微镜下观测腔前卵泡的形态与增长情况，并用台盼蓝染色鉴定腔前卵泡的存活情况。【结果】在培养液中添加100 µg•L-1的FSH能显著提高腔前卵泡培养5和10 d后的增长幅度，当同时添加50 mg•L-1的维生素C时增长幅度进一步加强；添加50 mg•L-1的维生素C能提高腔前卵泡培养10 d后的形态正常率，但对卵泡增长及存活没有影响；添加50 µg•L-1的EGF能提高腔前卵泡培养5 d的增长幅度，但对培养10 d后腔前卵泡的作用不显著。随着卵泡的直径增加，体外存活率升高，增长的幅度上升，异常率下降。60～100 µm的腔前卵泡用三维培养法（琼脂糖包埋）体外培养10 d的直径增长幅度显著高于二维培养法（琼脂糖铺底）和普通培养法，且形态异常显著低于二维培养法和普通培养法；100～140 µm卵泡用二维培养法培养的增长幅度最大，培养成活率最高。【结论】FSH能促进水牛卵泡的体外增长，维生素C能维持卵泡的正常形态结构，且两者的协同作用显著；水牛卵泡体外发育能力随其体积的增大而增强；三维培养法适宜于培养60～100 µm的卵泡，而二维培养法有利于100～140 µm卵泡的体外发育。     

成熟培养基对猪卵母细胞的影响

评估NCSU23和TCM199两种培养基对猪卵母细胞体外成熟、孤雌激活以及核移植重构胚发育的影响。分别以NCSU23和TCM199为基础培养基,向其中添加相同浓度的半胱氨酸、激素和生长因子,作为猪卵母细胞体外成熟培养液,培养44 h(5%CO2、39℃、饱和湿度),挑选第一极体;成熟后的卵母细胞进行孤雌激活和核移植重构胚操作,144 h后观察囊胚数。结果表明,NCSU23组与TCM199组对卵母细胞体外成熟(68.18%和67.55%)、孤雌囊胚率(38.40%和37.60%)与核移植囊胚率(23.79%和21.38%)无显著影响(P>0.05),但是两者对孤雌囊胚细胞数的影响差异显著(分别为38.4和37.6个细胞)(P<0.05)。NCSU23成熟培养基能够使胞质成熟完全,提高囊胚细胞数,有利于妊娠的发生。可见,以NCSU23为基础培养基的体外成熟液有利于猪卵母细胞体外发育。     

小鼠腔前卵泡体外发育和体外排卵的研究

为探明小鼠腔前卵泡体外发育及体外排卵的特征和规律性 ,为利用卵巢资源奠定基础 ,采用机械方法分离未成熟小鼠腔前卵泡进行体外培养 .以 α- MEM加亚硒酸钠、维生素 C,L-谷氨酰胺、丙酮酸钠为基础培养液 ,分组添加 10 %的 2种不同来源的血清和 1μg/ m L FSH.在多卵泡培养体系中 ,培养 9～ 10 d,每天观察其体外发育情况 ,测定卵泡和卵母细胞大小 .培养结束时 ,用 h CG进行体外诱导排卵 .结果表明 :体外培养过程中 ,腔前卵泡贴附培养皿底 ,相互聚集粘附形成团状结构 ,在细胞铺层微滴培养中 ,卵泡呈单个生长 ,并发育形成卵泡腔或腔样结构 ;经9d体外培养 ,小鼠腔前卵泡达到排卵前大小 (>40 0 μm) ,卵母细胞从开始时的 5 3.2 μm生长到 6 8.0～ 70 .8μm,总存活率为 6 1.0 % ;卵母细胞的大小及存活率在不同的血清添加组间差异不显著 ;用 h CG可诱导体外排卵 ,发生卵泡破裂 ,卵母细胞排出 ,卵丘细胞扩展 ,卵母细胞生化泡破裂 ,放出第一极体 .总排卵率达 5 9.5 % .因此 ,采用多卵泡培养体系 ,小鼠腔前卵泡能够发育至成熟排卵 .     

猪体细胞克隆胚胎的体外生产试验

 【目的】通过优化猪体细胞核移植程序,建立获得克隆囊胚的有效方法。【方法】比较不同电激活参数、不同体外培养条件对猪体细胞克隆胚发育能力的影响。【结果】选用1.5 kV?cm-1、80 μs 和1 DC的参数组合,对猪核移植重构胚进行电融合和电激活,可获得较高的卵裂率和最高的囊胚发育率（分别为71.4%和14.3%）,且囊胚发育率显著高于其它组（P＜0.05）;0.4% BSA NCSU 23 培养液培养克隆重构胚72 h,半量换液并未改善克隆胚的发育,但添加10% FBS 可显著提高囊胚发育率（15.1%对10.3%,P＜0.05）和DNA 完整率(56.8%对46.6%,P＜0.05) ;采用猪卵泡颗粒细胞（pGC）共培养体系未能显著提高克隆胚发育率（P＞0.05）,但卵丘细胞（pCC）单层共培养时,囊胚发育率显著高于对照组（16.7%对9.8%,P＜0.05）,培养5 d 的克隆胚凋亡率也显著低于对照组（39.5%对54.2%,P＜0.05）。【结论】采用1.5 kV?cm-1、80 μs 和1 DC 的参数组合对猪克隆重构胚进行电融合和电激活,以0.4% BSA NCSU 23培养液作 pCC 单层共培养72 h,然后换用10% FBS NCSU 23 培养液,可明显提高囊胚发育率。     

FSH对牛腔前卵泡体外发育的影响

为探讨FSH对牛腔前卵泡体外发育的影响,在McCoy’s 5a基础无血清培养液中,分别加入浓度为0、1、10、50及100 ng/mL FSH,观察培养不同时间腔前卵泡的生长和存活情况。结果显示,在培养6 d后添加50及100 ng/mL FSH组腔前卵泡及其卵母细胞直径都较对照组及其他处理组有较大幅度的增长(P<0.01);添加10 ng/mL以上FSH组腔前卵泡在培养后期的体外存活率也有明显提高(P<0.05),表明适宜浓度的FSH对培养后期腔前卵泡体外发育具有显著的促进作用。     

颗粒细胞对山羊卵泡卵母细胞体外成熟和体外受精的影响

试验系统研究了颗粒细胞对山羊卵泡卵母细胞体外成熟和体外受精的影响。COCs、机械裸卵和自然裸卵的体外成熟率分别为68.3%、45.6%和6.1%,组间差异显著(P<0.05),卵裂率分别为41.5%、8.1%和0,差异显著(P<0.05)。对照组和15×104个/ml、150×104个/ml颗粒细胞组卵母细胞体外成熟率分别为65.9%、60.2%和64.6%,无显著差异(P>0.05),但均显著高于1 500×104个/ml(50.0%)和1.5×108个/ml(30.3%)颗粒细胞组(P<0.05)。颗粒细胞单层共培养系统卵母细胞成熟率为75.8%,显著高于150×104个/ml颗粒细胞条件培养液组(63.4%)和M199培养液组(66.7%)(P<0.05)。颗粒细胞单层共培养系卵裂率为50.0%,显著高于150×104个/ml条件培养液组(36.7%)和M199培养液组(38.2%)(P<0.05)。     

一氧化氮供体硝普钠对猪腔前卵泡体外培养的影响

研究在培养液中添加不同浓度(0.000、0.001、0.010、0.100、1.000 mmol/L)一氧化氮供体硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)对猪腔前卵泡体外培养的影响.结果表明,SNP对猪腔前卵泡存活、发育和腔的形成、卵母细胞正常发育有一定促进作用,但高浓度会产生抑制作用.体外培养后,各处理组卵泡直径差异不显著(P＞0.05);处理第4天,0.001mmol/L SNP处理组卵泡存活率(85.28%)显著高于1.000mmol/L SNP处理组(70.60%,P＜0.05);0.001 mmol/L SNP处理组卵泡成腔率(79.81%)和卵母细胞正常率(50.93%)显著高于1.000 mmol/L SNP处理组(55.22%,35.00%,P＜0.05);0.001mmol/L SNP处理组COC回收率(23.27%)著高于其余处理组(P＜0.05),其余各处理组差异不显著(P＞0.05);1.000mmol/L SNP处理组颗粒细胞凋亡率显著高于其他各组(P＜0.05),而0.001mmol/L SNP处理组颗粒细胞凋亡率显著低于其他各组(P＜0.05),其余各组间差异不显著(P＞0.05).     

培养液对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎早期体外发育的影响

[目的]提高卵母细胞体外成熟质量,优化猪早期胚胎体外培养体系。[方法]以改良TCM199,NCSU-23培养液为基础液,分别添加10%的猪卵泡液（PFF）和10%的优质胎牛血清（FBS）进行卵母细胞体外成熟培养,以成熟率、孤雌胚胎体外发育率等为指标,研究不同培养液对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的影响。[结果]猪卵母细胞在TCM199,TCM199＋FBS和TCM199＋PFF组成熟42 h的成熟率分别为（54.2±3.5）%、（68.5±3.2）%和（69.3±3.7）%,在NCSU-23,NCSU-23＋FBS和NCSU-23＋PFF组成熟42 h的成熟率分别为（51.6±3.3）%、（63.2±3.1）%和（65.5±3.5）%,添加10%的FBS和PFF在0.05水平上显著提高了卵母细胞成熟率;6组不同成熟培养液得到的成熟卵母细胞在孤雌激活后囊胚发育率差异不显著,但TCM199＋PFF组的囊胚细胞数（36.5±4.8）在0.05水平上显著高于TCM199和NCSU-23组的囊胚细胞数（18.7±3.2和15.5±2.4）。[结论]改良TCM199,NCSV-23培养液中添加10%PFF和10%FBS可显著促进猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎早期体外发育。     

添加物对小鼠腔前卵泡体外培养的影响

为探讨培养添加物对小鼠腔前卵泡生长成熟的影响,在培养液中分别加入不同体积分数的犊牛血清（ＦＣＳ）,牛卵泡液或添加促性腺激素,对小鼠腔前卵泡进行了培养。结果表明,５％以上犊牛血清明显提高腔前卵泡存活率,而１０％以上犊牛血清能明显促进卵泡的生长发育,２０％以上牛卵泡液可抑制卵母细胞的体外自发成熟分裂,并能促进腔前卵泡的生长发育,在不含犊牛血清的培养液中加入促卵泡素（ＦＳＨ）,促黄体素（ＬＨ）或ＦＳＨ＋     

二种分离液对牛腔前卵泡卵母细胞体外培养效果观察

本实验通过２种无血清分离液,采用机械方法分离牛腔前卵泡卵母细胞,体外培养７ｄ,观察其体外培养效果结果表明,Ｍ１９９Ｈｅｐｅｓ组腔前卵泡卵母细胞发育率为６３．４％,ＰＢＳ组为３０．３％,二者差异极显著（Ｐ＜０,０１）;第７ｄ 卵泡平均增长直径以Ｍ１９９Ｈ＿组好于ＰＢＳ组,分别为（２８． ７± ２１． ２）μ和（２１． ６± ８． ０）μｍ,次级卵泡（Ｓｃ）增长速率大于初级卵泡（Ｐｍ）     

卵泡大小及卵泡液对牛卵母细胞体外受精后发育的影响

 以屠宰场牛卵巢为材料，研究了卵泡大小和卵泡液对牛卵母细胞体外成熟、受精和培养后发育潜力的影响。试验1：按照卵泡大小将卵丘卵母细胞复合体（COCs）分为4个试验组：＞8 mm组、2～8 mm组、腔前卵泡（PF）卵母细胞组和混合（将前3种卵母细胞混合）组。结果表明，卵泡大小直接影响卵母细胞受精后的发育，同时，源自不同大小卵泡的卵母细胞混合培养，可以促进未成熟的腔前卵泡内卵母细胞的发育。试验2：将源自优势卵泡（＞8 mm）、小卵泡（2～8 mm）和混合（所有卵泡液混合）的牛卵泡液（BFF），按照10%添加到成熟培养液中，3个试验组的卵裂率和囊胚率均高于没有添加BFF的对照组(P<0.05)，但添加10%的优势卵泡液使卵母细胞和胚胎发生粘连，易于造成丢失。试验3：与未添加BFF的对照组相比，成熟培养液中分别加入10%、20%和40%的混合BFF，均可明显促进卵母细胞受精后的发育(P<0.05)，但20%组和40%组出现卵母细胞及胚胎粘连。因此，成熟培养液中添加10%的混合BFF较为适宜。     

卵泡液对不同大小牛腔前卵泡体外培养过程中E2分泌的影响

Φ60~150μm牛腔前卵泡在有、无促性腺激素存在下,分别添加0、10%、15%、20%牛卵泡液(BFF)的McCoy′s 5 a无血清系统体外培养15 d,测定其雌二醇(E2)分泌量。结果显示:各添加卵泡液组在培养3、6、9、12 d的E2分泌量均显著高于对照组(0组)(P<0.01)。当培养液中有促性腺激素(FSH、LH)存在下,各添加卵泡液组的E2分泌量更高,其中添加10%牛卵泡液组中Φ>100μm腔前卵泡在培养6 d时E2分泌量达最高,为48.96±11.54 pg/mL。表明培养液中添加一定比例牛卵泡液(BFF)可显著刺激体外培养腔前卵泡E2的分泌,促性腺激素存在下更加强了卵泡液对E2分泌的刺激作用。     

猪卵泡液和胎牛血清对猪小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响

本研究探讨了猪卵泡液(pFF)和胎牛血清(FCS)对猪小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响。将猪小腔卵泡(直径<2mm)卵母细胞-卵丘复合体(COCs)以15～35枚为一组随机置于添加不同浓度(0、5%、10%、20%)pFF(试验一)或不同浓度(0、5%、10%、20%)FCS(试验二)的改良TCM-199成熟液中培养44～48h,观察卵母细胞的核成熟率和卵丘扩散情况。试验一结果显示,成熟液中添加10%pFF与对照组和添加5%、20%pFF组相比,显著提高猪小腔卵泡卵母细胞的核成熟率(28 2%比20 5%、20 9%、22 3%;p<0 05);添加5%和20%pFF组与对照组相比,它们的小腔卵泡卵母细胞核成熟率之间差异不显著(p>0 05);添加5%pFF组的COCs卵丘细胞呈现第3类扩散,添加10%和20%pFF组的COCs卵丘细胞呈现第4类扩散,而不添加pFF的对照组的COCs卵丘细胞呈现第2类扩散。试验二结果显示,成熟液中添加10%FCS与对照组和添加5%、20%FCS组相比,明显提高猪小腔卵泡卵细胞的核成熟率(60 0%比37 5%、40 2%、43 9%;p<0 05);添加5%和20%FCS组与对照组相比,它们的小腔卵泡卵细胞核成熟率之间差异不显著(p<0 05);FCS在COCs体外成熟培养的前22～24h促进了卵丘扩散(3个处理组的COCs卵丘细胞呈现第3类扩散,而对照组COCs的卵丘细胞呈现第2类扩散)。研究结果表明:(1)成熟液中添加pFF可促使猪小