豌豆根瘤菌共生质粒pJB5JI对费氏中华根瘤菌共生固氮作用的影响

通过两亲本接合转移,将豌豆根瘤菌T83K3共生质粒pJB5JI转入费氏中华根瘤菌HN01及其质粒缺失突变株中,获得8个转移接合子,其中受体为HN01和pSfrHN01a缺失突变株HND28的接合子能够在大豆上形成有效根瘤,无论是人工传代还是与植物共生,外源质粒pJB5JI与受体菌内源质粒均能稳定存在,但不能在豌豆上结瘤,与大豆共生固氮能力和竞争结瘤能力与受体菌亲本相比没有明显变化.消除共生质粒的突变株HND29和共生质粒与pSfrHN01a质粒均消除的突变株HND100作受体菌的接合子,既不能在大豆上结瘤,也不能在豌豆上结瘤.研究结果表明,pJB5JI与HN01的3个质粒属于不同的不相容群.pJB5JI在HN01中的表达功能可能受到受体菌的共生质粒和染色体基因的共同影响.     

紫云英根瘤菌的质粒特征及内源抗药性

对22个野生型紫云英根瘤菌菌株的质粒和抗性基因的研究结果表明,不同紫云英根瘤菌菌株都含有1-4个数量不等的质粒,其分子量变幅在18.5-300Kb之间。大部分野生型分离菌具有不同程度的抗庆大霉素,卡那霉素,四环素和链霉素的能力;其中抗庆大素和抗卡那霉素的能力超出一般快生型根瘤菌的许多倍。对菌株HR104的热处理消除试验结果表明,抗庆大霉素的因子与其中的一个巨型质粒(p104c)相关。用消除质粒p104c的突变株回接寄主植物仍能够形成有效根瘤,说明该质粒的存在与共生固氮过程无关。     

费氏中华根瘤菌共生质粒缺失对结瘤和固氮能力的影响

费氏中华根瘤菌（Sinorhizobium fredii)HN01在大豆上的结瘤表现为非品种专一性，其共生质粒pSymHN01b在诱动转入另一非品种专一性结瘤菌株WWG18SR后，获得的转移接合子WWG18SRN1中的pSymHN01b缺失约40b。盆栽结瘤试验证明，pSymHN01b的缺失导致WWG18SRN1由非品种结瘤菌株转变为大豆品种专一性结瘤菌株，并失去了在所有供试的大豆品种上固氮的能力。在获得了完整的pSymHN01b的转移接合子WWG18SRN2存在时，WWG18SRN1在黑农33上的结瘤受到抑制。     

紫云英根瘤菌天然抗药性和质粒研究

从同一稻田的紫云英根瘤上共分离到１５４株紫云英根瘤菌。将来自该田块１０株紫云英的１００株根瘤菌列为分析组Ａ；来自同一植株不同根瘤的４０株根瘤菌列为分析组Ｂ；来自植株两个根瘤的１４株根瘤菌列为分析组Ｃ。对所有菌株１０种抗生素的抗药性测定表明，分析组３９个不同抗药类群；分析组Ｂ分为２２个抗药类群。同一根瘤的分离株其抗药性也存在差异。质粒检测显示所有菌株都含有质粒，质粒数为１－５条；质粒分子量主要在８     

外源质粒对根瘤菌共生性的影响

研究了接受外源质粒ｐＪＰ４的根瘤菌对豆科植物的共生性、固氮能力和根瘤结构的影响,以及质粒ｐＪＰ４引入根瘤菌后的表达。结果表明,接受了外源质粒ｐＪＰ４的根瘤菌保持了根瘤菌的共生性状、乙炔、还原酶活性,所形成的根瘤结构与亲本株没有明显差别;质粒ｐＪＰ４引入根瘤菌后,２．４－Ｄ的降解功能未得到表达。     

紫云英根瘤菌质粒的研究——Ⅱ紫云英根瘤菌(Rhizobium astragali)经高温和吖啶橙处理后结瘤和固氮突变株的产生和质粒的消除

用高温和吖啶橙处理紫云英根瘤菌菌株7653~r和S_(52)分别获得了表型性状为不结瘤(Nod~-)和结瘤而不同氮(Nod~+,Fix~-)突变株。与亲本菌株具有的两条大质粒带相比,上述突变株均丢失了其中的一个较大的质粒。这一结果初步表明:菌株7653~r的nod基因和S_(52)的nif或fix基因可能定位在已消除的那一个大质粒(pRa7-2和pRa5-2)上。     

紫云英根瘤菌质粒的研究 Ⅰ、五个菌株大质粒的分离纯化和菌株7653质粒的内切酶酶切图谱

用修改的Hirsch法从紫云英根瘤菌的五个菌株中分离出1—2个大质粒,比较研究了不同蛋白酶和菌液浓度对质粒分离效果的影响。用CsC1—EB密度梯度离心从菌株7653中提取出质粒DNA,得到其用不同的限制性内切酶作用的酶切图谱。     

根瘤菌竞争结瘤的研究进展

近年来已通过自然选育或基因工程技术获得了不少具有高效固氮能力的菌株。并在人工控制的条件下证明它们能够使豆科作物显著增产。但由于人工接种剂与土著根瘤菌的竞争结瘤问题一直未得到很好解决，阻碍了这些高效固氮菌株田间应用效果的发挥。尽管人们对这一问题已进行了大量的研究。但也根瘤菌结瘤基因的研究相比。我们对根瘤菌的竞争结瘤机制的认识仍非常有限。已有的研究结果表明，影响根瘤菌竞争结瘤的因素主要包括根瘤菌与宿主植物的遗传基因和生态学因素两个方面。     

Cd胁迫下接种根瘤菌对紫花苜蓿氮代谢的影响

为探讨接种根瘤菌对Cd胁迫下紫花苜蓿氮代谢的影响,采用盆栽试验,以2种紫花苜蓿（维多利亚、WL525HQ）为植物材料,研究Cd（0 mg·kg^-1和50 mg·kg^-1）处理土壤接种根瘤菌对两种紫花苜蓿的氮代谢关键酶活性和含氮化合物的影响。结果表明,Cd胁迫影响紫花苜蓿氮代谢,50 mg·kg^-1 Cd胁迫对未接种根瘤菌紫花苜蓿WL525HQ地上部硝酸还原酶（NR）活性的影响最大,NR活性较0 mg·kg^-1 Cd处理降低85.01%。0 mg·kg^-1 Cd处理时,WL525HQ接种根瘤菌后地上部谷氨酸合成酶（GOGAT）活性较未接种组提高95.53%,维多利亚接种根瘤菌后地上部天冬酰胺合成酶（AS）活性增加33.30%。50 mg·kg^-1 Cd胁迫时,与不接种根瘤菌相比,接种根瘤菌的WL525HQ地上部NR活性增幅最大（164.66%）,接种根瘤菌后维多利亚地下部NR活性与未接种处理相比提高99.46%。50 mg·kg^-1 Cd处理中,接种根瘤菌缓解了Cd胁迫对紫花苜蓿含氮物质积累的抑制,维多利亚、WL525HQ的可溶性蛋白含量分别比未接种组显著提高6.24%和5.82%,游离氨基酸含量增加16.10%和18.70%,维多利亚总氮含量显著提高9.48%。研究表明,接种根瘤菌可通过调节氮代谢关键酶活性来促进Cd胁迫下紫花苜蓿的氮素向蛋白质合成的方向转运积累,一定程度上缓解Cd对紫花苜蓿的伤害。     

侧孢芽孢杆菌质粒提取方法的探究

本试验以侧孢芽孢杆菌菌株BL-21和BL-22为材料,采用3种质粒提取方法对侧孢芽孢杆菌BL-21和BL-22的大型质粒进行提取,并通过凝胶电泳和紫外分光光度法对提取结果进行分析,试验结果证明,适合侧孢芽孢杆菌BL-21和BL-22的质粒提取方法是SDS裂解法,且该方法提取的结果稳定,质粒的产量和质量均符合分子生物学实验的要求。     

2株重组根瘤菌在4个大豆品种根圈中定殖动态的比较研究

在灭菌和未灭菌土盆栽缩影条件下，比较研究了重组大豆根瘤菌HN01DL和TA113QD在4个不同品种大豆根圈中的定殖动态与水平，并初步考察了其与共生效应的关系。结果表明：HN01DL在渝豆1号和宁镇1号大豆根圈表现出较强的适应性和竞争性，而TA113QD则在Williams大豆根圈的适应性较强，在宁镇1号大豆根圈的适应性较差，且供试菌在4种大豆根圈定殖动态与水平的差异在共生效应上也有一定程度的反映，但未达到显著水平。     

GDF-8干扰质粒转染绵羊耳成纤维细胞最佳条件研究

为了确定GDF-8基因干扰质粒转染绵羊耳成纤维细胞的最佳转染条件,试验采用脂质体转染法,探索了DNA用量、脂质体用量和转染时间等因素对转染绵羊耳成纤维细胞的影响。结果表明,DNA用量0.4μg、脂质体用量1.0μL、转染时间为6 h时,转染效果最好。     

乳酸乳球菌的质粒消除

质粒消除是鉴定质粒和获得无质粒菌株的重要方法,是乳酸菌进行遗传学改造所需的一项重要技术。试验采用高温和消除剂结合的方法,对乳酸乳球菌镉抗性菌株进行质粒消除,探讨温度、消除剂吖啶橙的用量和作用时间对乳酸乳球菌镉抗性质粒消除的影响。结果表明,39℃高温可以质粒消除,而37和41℃均无此效果;独自吖叮橙作用未获得质粒消除菌株;39℃高温-吖啶橙同时作用比高温-吖啶橙交替作用消除率高,而39℃高温-20μg·mL-1吖啶橙共同作用12d,消除率可达98%。根据消除结果,以疑似功能性质粒为模板,进行PCR扩增,获得预期片段,进一步证实了其功能。     

一种用高拷贝质粒载体制备BAC载体基本功能基因的新方法

[目的]简便有效地解决BAC载体序列因单一拷贝数带来的制备以及下游亚克隆操作的困难。[方法]选择适当的单一酶切位点,将单拷贝BAC载体质粒序列全部插入高拷贝质粒pUC119载体的适当位点。[结果]BAC载体基本功能基因序列在新质粒pUC119-BAC中失去了单一拷贝数控制功能,以高拷贝形式进行复制,利用单一酶切,可将BAC载体基本功能基因序列完整切下来,自连后重新恢复严格的单拷贝控制功能。[结论]利用高拷贝pUC119-BAC质粒,实现了BAC载体的基本功能基因序列高拷贝的复制和扩增,可以方便地用于分子克隆化重组病毒转移载体的构建或BAC文库的构建。     

具毒性质粒沙门氏菌的快速检测

针对沙门氏菌毒性质粒spvR基因设计PCR引物,检测具有毒性质粒的沙门氏菌.6株常见具有毒性质粒的沙门氏菌均获得特异性扩增,11株常见的无毒性质粒的沙门氏菌均未获得特异性扩增,5株非沙门氏菌检测结果均为阴性.结果表明,所设计引物具有高度特异性,适用于具毒性质粒沙门氏菌的快速检测.     

质粒pUC19-CM-D的构建及应用

[目的]用克降载体pUC19构建乳杆菌自杀质粒及乳杆菌基因缺失工程菌.[方法]以鼠李糖乳杆菌为研究对象,在质粒pUC19的多克隆位点插入氯霉素抗性基因构建pUC19-CCM载体;在pUC19-CM载体氯霉抗性基因的两侧均添加1个用于同源重组的同源臂,再构建成自杀质粒pUC19-CM-D.将自杀质粒pUC19-CM-D.将自杀质粒pUC19-CM-D转化乳杆菌进行抗生筛选即可得到目标基因被抗性基因替换的突变株.[结果]通过改造pUC19质粒,获得了可应用于构建鼠李糖乳杆菌D-乳酸脱氢酶基因缺陷型菌株的自杀质粒pUC19-CM-D.运用抗性基因替换方法来构建基因缺陷型菌株,在一定程度上避免了质粒整合带来的问题,同时提供了一个筛选标记,能够通过一次筛选即可得到缺陷型菌株.这种自杀质粒的改造和基因缺陷型菌株的构建方法具有通用性,可以应用于其他的载体和菌株.[结论]pUC19-CM-D质粒的构建及应用为乳杆菌基因缺失工程菌的构建提供了1个快速有效的手段,也为乳杆菌基因功能研究奠定了基础. Abstract： [Objective] The aims were to construct a new suicide plasmid of Lactobacillus and gene deletion engineering bacteria of Lactobacillus with pUC19 vector,[Methods]pUC19-CM was constructed by inserting a chloramphenicol resistant gene into the multi-cloning site of pUC19,and then two homologous fragments were cloned into each side of the pUC19-CM to construct suicide plasmid pUC19-CM-D.[Results]A replacement mutant strain,whose target gene was replaced by resistant gene,could be obtained by transforming the suicide plasmid pUC19-CMD into Lactobacillus for resistance screening. [Conclusion] The construction and application of pUC19-CM-D provided a fast and efficient means of construction of gene deletion engineering bacteria of Lactobacillus,and laid a foundation for study of gene function of Lactobacillus.