H5N1亚型禽流感病毒对鸡的致病性研究进展

对鸡感染H5N1亚型禽流感病毒（AIV）后的临床表现、大体病变、病理组织学、生理生化指标、细胞免疫功能、病毒的组织分布和细胞凋亡的研究进展进行概述,探讨了该病毒对鸡高致病性的分子基础．     

一株鸭源H4N8亚型禽流感病毒的全基因测序及遗传进化分析

【目的】禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)根据其表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin, HA)和神经氨酸(neuraminidase, NA)的不同,可分为16种HA和9种NA亚型。根据其致病力的差异可分为高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus, HPAIV)和低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus, LPAIV)。虽然H4亚型禽流感病毒为低致病性AIV,感染家禽表现为无症状感染,但其对禽类甚至是哺乳动物是一个潜在的威胁,因此必须要加强对H4亚型禽流感病毒的调查监控。【方法】为了探讨H4亚型禽流感病毒的分子特征及遗传演化规律,对2010年在中国华东地区某活禽市场进行流行病学监测时分离到的一株H4N8亚型禽流感病毒A/duck/Nanjing/1102/2010（简称DK/NJ /1102）进行了全基因组序列测定及遗传进化分析。通过常规的血清学试验确定其HA亚型,提取病毒总RNA,并通过RT-PCR方法分别扩增出其各基因片段,连接 pGEM-Teasy载体上后进行序列测定。利用GenBank中的BLAST工具进行核苷酸序列的同源性分析,并与GeneBank 中的H4亚型流感病毒及其它相关序列进行遗传进化分析。【结果】DK/NJ/1102的HA基因与Mongolia 分离株A/duck/Mongolia/274/2007(H4N3)的核苷酸同源性最高,为98.9%。推导的氨基酸剪切位点序列为“P-E-K-A-S-R-G”,符合典型的低致病性禽流感病毒特征;NA基因与华东地区分离的鸭源毒株A/Duck/Eastern China/n91/2009(H3N8)核苷酸同源性最高,达99.4%;PB1、PA和NP基因均与H1亚型禽流感病毒亲缘关系最近;M基因与A/wild duck/Korea/CSM4-12/2009(H5N1)核苷酸同源性最高,高达99.9%;NS基因与韩国2009年分离的H7N7亚型流感病毒遗传距离最近。NS1蛋白的80-84处氨基酸没有发生氨基酸缺失。【结论】该H4N8亚型禽流感病毒基因组构成比较复杂,可能是一株多基因重组病毒。     

Phylogenetic and epidemiological characteristics of H9N2 avian influenza viruses in Shandong Province,China from 2019 to 2021

H9N2 avian influenza virus(AIV) has widely circulated in poultry worldwide and sporadic infections in humans and mammals. During our surveillance of chicken from 2019 to 2021 in Shandong Province, China, we isolated 11 H9N2AIVs. Phylogenetic analyses showed that the eight gene segments of the 11 isolates were closely related to several sublineages of Eurasian lineage: BJ/94-like clades(HA and NA genes), G1-like clades(PB2 and M genes), and SH/F/98-like clades(PB1, PA, NP and NS genes). The isola...     

一株H9(N2)型禽流感病毒HA基因的克隆与序列分析

利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增出禽流感病毒(H9亚型)血凝素的cDNA。通过T-A连接将已加A尾的PCR产物连接到线状克隆载体pGEM-Teasy vector,转化J M109感受态细胞,在含氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆。经PCR扩增,进一步确证为目的片段。对目的片段进行测序,结果获得该毒株的HA基因全长。与已知序列进行同源性比较,同源性最高的可达98%,表明这些分离株的亲缘关系较近;系统发育分析表明,该毒株属欧亚种系;通过血凝素裂解位点的氨基酸序列分析可知,该分离株的HA切割位点上未见到典型的高致病力毒株H5、H7所具有的一系列碱性氨基酸,其排列顺序为-PARSSRGLF-。所克隆的基因为禽流感病毒HA基因芯片的研究奠定了基础,同时为诊断和预防AI提供了理论依据。     

广西鸡源H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定及遗传进化分析

[目的]明确广西鸡源H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的分子遗传变异规律及其对公共卫生安全的影响,为H9亚型禽流感(AI)的防控提供参考依据.[方法]从广西某肉鸡养殖场采集病料,经SPF鸡胚接种进行病毒分离,对初步鉴定为H9亚型AIV分离株的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS等8个基因片段进行克隆测定及遗传进化分析,同时对分离毒株的生物学特性进行测定.[结果]从广西发病鸡群中分离获得一株H9N2亚型AIV,命名为A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2).分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2)HA基因的裂解位点为PSRSSR↓GLF,具有典型的低致病性AIV(LPAIV)分子特征,在遗传进化关系上属于4.2.5分支,与国内常用H9N2亚型AIV疫苗株所属的4.2.3分支存在一定差异;其他7个基因也分别来源于不同的AIV亚型.分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016 (H9N2)同时具备与α-2,3唾液酸和α-2,6唾液酸受体结合的特性,且具有感染人类的潜在风险;其感染鸡群后病毒分布主要集中在气管、肺脏和脾脏,可通过呼吸道和消化道同时排毒,且在攻毒后第1d即开始排毒,第5d为排毒高峰.[结论]从广西发病鸡群中分离获得的A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2)属于LPAIV,是由不同亚型AIV重组产生的H9N2亚型新毒株,可导致鸡群疫苗免疫失败,且具有感染人类的潜在风险.     

禽A类传染病毒力检测软件的开发

运用生物信息学软件对GenBank中收录的30株禽流感病毒（AIV）和30株新城疫病毒（NDV）全基因组序列间的差异,以及对应的HA基因片段和F基因片段上的差异进行了分析,发现2条片段上均存在保守序列,该保守序列可作为区分禽流感病毒和新城疫病毒的指纹序列;设计2对扩增简并引物,建立RT-PCR-Sequence技术,并获取目的基因片段序列。在此基础上,开发出禽A类传染病毒力检测软件,通过对该指纹序列的分析,不仅可以区分AIV和NDV,还能同步测定这些病毒的毒力情况。该技术对AIV和NDV标准株的测定结果与已知信息完全吻合,并能准确判定测序错误的基因序列。     

禽流感病毒LAMP快速诊断方法的建立

参考禽流感病毒(AIV)基质蛋白(M)基因设计了两对引物,特异性识别其6个不同位点,建立了基于颜色判定的环介导等温扩增反应(LAMP)方法。试验对不同禽源病毒进行了测试,结果发现该方法仅特异性地检出禽流感病毒(H9和H5亚型)核酸,对AIV病毒的检测极限为10 EID50。人工感染病料检测结果与鸡胚病毒分离法的符合率为967%。数据表明,建立的LAMP方法特异、敏感、简便,在禽流感的诊断中具有很大的临床应用潜力。     

检测H9亚型AIV的压电免疫传感器的研究

[目的]研制检测H9亚型禽流感病毒的压电免疫传感器。[方法]用巯基丙酸在镀银电极石英晶体自组装巯基丙酸单分子膜再通过N-乙基-N-′（3-二甲氨基）丙基碳化二亚胺盐酸（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）偶联抗H9亚型禽流感病毒的特异性单抗构建传感器芯片,建立可以检测H9N2亚型禽流感病毒的免疫传感器。[结果]该方法具有较好的特异性,不与H5亚型流感病毒和新城疫病毒（NDV）反应;检测灵敏度达到20~100EID50。[结论]该研究为深入研究检测禽流感病毒的免疫传感器奠定了基础,为其他相关病毒的监测提供了一种新途径。     

Development of a cELISA for effective detection of the antibody against H7 subtype of avian influenza virus

H7 avian influenza viruses(AIVs) normally circulated among birds before. From 1996 to 2012, human infections with H7 AIVs(H7 N2, H7 N3, and H7 N7) were reported in Canada, Italy, Mexico, the Netherlands, the United Kingdom and the USA. Until March 2013, human infections with H7 N9 AIVs were reported in China. Since then, H7 N9 AIVs have continued to circulate in both humans and birds. Therefore, the detection of antibodies against the H7 subtype of AIVs has become an important topic. In this stu...     

H5亚型AIV HA和HA1的Sf-9昆虫细胞表达及其作为检测抗原的初步比较分析

利用杆状病毒表达系统,在昆虫细胞Sf-9中分别表达了H5亚型禽流感病毒的HA、HA1。相同表达条件下,Western Blot分析比较表明,HA、HA1均与H5亚型AIV抗血清反应,且不与H7、H9亚型AIV抗血清发生交叉反应,具有良好的特异性;以Western Blot检测鸡、鸭AIV抗血清,初步表明,重组杆状病毒表达的HA、HA1均可作为H5亚型AIV血清检测的抗原,HA优于HA1。     

Glycosylation of the hemagglutinin protein of H9N2 subtype avian influenza virus influences its replication and virulence in mice

N-Linked glycosylation of hemagglutinin(HA) has been demonstrated to regulate the virulence and receptor-binding specificity of avian influenza virus(AIV). In this study, we characterized the variation trend of naturally isolated H9 N2 viruses for the potential N-linked glycosylation sites in HA proteins, and explored any important role of some glycosylation sites. HA genes of 19 H9 N2 subtype AIV strains since 2001 were sequenced and analyzed for the potential glycosylation sites. The results showed that the viruses varied by losing one potential glycosylation site at residues 200 to 202, and having an additional one at residues 295 to 297 over the past few years. Further molecular and single mutation analysis revealed that the N200 Q mutation lost an N-linked glycosylation at positions 200 to 202 of the HA protein and affected the human-derived receptor affinity. We further found that this N-linked glycosylation increased viral productivity in the lung of the infected mice. These findings provide a novel insight on understanding the determinants of host adaption and virulence of H9 N2 viruses in mammals.     

表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸭肠炎病毒的构建

【背景】H9亚型禽流感病毒（AIV）存在宿主范围扩大、毒力增强的趋势,并为其他亚型AIV重排提供基因,给养禽业和公共卫生造成极大威胁。水禽不仅是流感病毒的宿主,更是其天然储存库,在禽流感病毒的传播和变异中发挥着重要作用。因此有效控制水禽感染对养禽业健康发展、公共卫生安全具有重要意义。鸭肠炎病毒（DEV）属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率。DEV基因组大,免疫原性好,具有开发成活疫苗载体的潜力。【目的】构建缺失gE基因、表达H9亚型AIV HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA,探讨重组病毒rDEV-△gE-HA作为防治DEV-AIV的二联重组活载体疫苗的可行性。【方法】以H9N2亚型禽流感病毒HA基因作为靶基因,构建含有HA基因表达盒的转移载体pT-gE-HA,将其与携带绿色荧光蛋白标记的重组rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞后,进行蚀斑筛选、纯化表达HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA;利用PCR、基因测序鉴定重组病毒;在CEF中连续传代重组病毒20次,测定外源基因传代稳定性。以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,分析重组病毒rDEV-ΔgE-HA对致死性DEV强毒攻毒保护效果;将不同剂量（10 ³-10 ⁶TCID₅₀）rDEV-△gE-HA免疫鸭,免疫后14、21、28 d分别采集血清,测定H9血凝抑制（HI）抗体,并在免疫后28 d,以10 ⁸EID₅₀的剂量静脉注射H9N2 AIV（A/duck/GD/08）,攻毒后2 d,采集喉拭子,进行病毒分离试验。【结果】将构建的转移质粒载体pT-gE-HA与rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞,经过3轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△gE-HA。PCR鉴定及基因测序结果显示,HA基因成功地插入到DEV基因组中,替换了绿色荧光蛋白。重组病毒在CEF中至少能稳定传代20代。重组病毒rDEV-ΔgE-HA以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,能抵抗致死性DEV强毒攻击。重组病毒rDEV-ΔgE-HA免疫易感鸭后14 d,各剂量免疫组均能检测到H9 HI抗体效价;免疫后21日,各组抗体效价水平略有上升,10 ³TCID₅₀剂量免疫组HI抗体效价达到1:2 ⁴,而10 ⁴-10 ⁶TCID50剂量免疫组HI抗体效价在1:2 ^2.4-1:2 ³。免疫鸭后28 d,用H9N2 AIV进行攻毒,10 ³、10 ⁴、10 ⁶TCID₅₀免疫组均未从喉拭子分离到病毒H9N2,说明能完全保护,阻止喉头排毒,而10 ⁵TCID₅₀免疫组保护率为80%（4/5）,1/5病毒分离阳性。【结论】成功构建了稳定表达H9亚型AIV HA基因的重组DEV,该重组病毒保留了亲本毒的免疫原性,能抵抗致死性DEV强毒的攻击;免疫鸭后能诱导产生AIV HI抗体,尽管HI抗体滴度不高,但至少80%免疫鸭能阻止排毒。该研究为研制DEV-H9亚型AIV二联重组活载体疫苗奠定了基础。     

新型H3N3亚型禽流感病毒对鸡致病性与传播性研究

新型禽流感病毒对家禽养殖业可造成严重经济损失，及时发现和阻断其传播具有重要意义。2022—2023年，本实验室在我国发病鸡群中监测到新型H3N3亚型禽流感病毒的出现和传播。本研究对发病鸡群开展了临床发病情况调查，对分离病毒进行了全基因组演化分析，并对分离的代表性病毒进行了鸡致病性以及空气传播性试验。结果表明：1)H3N3最早于2022年12月在华东地区发生产蛋下降的蛋鸡群出现，随后陆续在华东、华北、东北等多个地区的鸡群中监测到，发病群体主要为产蛋鸡，鸡群发病率高，死亡率低(1%～5%),主要引起产蛋率急性下降(10%～40%)。2)病毒全基因组序列分析显示，H3N3病毒为新型重排病毒，由鸡群中流行的H3N8病毒与H10N3病毒重排产生，6个内部基因来源于H9N2病毒。3)与H3N8病毒类似，新型H3N3病毒对鸡群高度易感，可在鸡鼻甲、气管、肺等呼吸器官中高效复制并排毒，引起呼吸系统严重病理损伤。4)空气传播性结果表明，新型H3N3病毒可在鸡群之间空气传播，而H3N8病毒不能在鸡群间空气传播。综上，新型H3N3禽流感病毒对鸡具有较强的致病性和传播性，有可能成为新的优势流行病毒，对我国家禽...     

新型H3N8亚型禽流感病毒分离鉴定与鸡致病性研究

为调查我国多个省份鸡群中发生一种以眼睑肿胀出血、呼吸道症状、产蛋鸡产蛋率急性下降为特征的传染性疾病的致病病原,本研究对发病鸡群进行流行病学调查,病原分离鉴定,病毒全基因序列分析,并对分离病毒进行了动物回归试验。结果表明:1)该病自2021年12月首先发现于广东省某三黄鸡群,随后陆续在福建、安徽、江苏、河南等多个省份鸡群中发生,鸡群发病率高,后期易继发感染细菌,死亡率1%~10%;2)实验室初步诊断为H3N8亚型禽流感;3)全基因组序列分析表明,该病毒为新型禽流感病毒,系欧亚禽分支H3基因、北美禽分支N8基因与G57基因型H9N2病毒内部基因组成的三源重排病毒;4)新型H3N8病毒对SPF鸡高度易感,感染鸡表现为眼睑肿胀出血,轻微呼吸道症状;病理变化为哈德氏腺黏膜坏死,鼻甲、气管纤毛上皮细胞坏死,黏膜下层炎性细胞浸润,肺脏支气管肺炎;病毒可通过口咽和泄殖腔排毒,排毒时间为5~7 d;病毒在鼻甲、气管和肺脏中可高效复制,并且可以在哈德氏腺等肺外脏器复制。综上,新型三源重排H3N8禽流感病毒对鸡高度适应,对呼吸系统致病性较强,应尽快开展系统的流行病学监测,及早对病毒的源头及传播途径进行防控,力争将这种新型病毒消灭在流行早期阶段。     

番鸭体内H5亚型禽流感HI抗体与抗感染关系研究

对经过H5N1油苗免疫的50日龄番鸭,按HI抗体水平分组后,进行人工接种HPAIV,通过试验鸭的临床症状、病理变化和排毒情况综合判断HI抗体水平与保护力之间的关系。结果表明,HI抗体水平在5.0log2以下时,番鸭群可感染HPAIV,出现临床症状,表现不同程度的病理变化,并有排毒现象。抗体水平达到3.0log2~5.0log2的免疫番鸭群已具有一定的抵抗力,可以延缓发病时间,降低发病程度。随抗体水平的升高,发病与排毒的程度有所下降。当抗体水平达6.0log2及以上时,番鸭对人工接种HPAIV具有完全抵抗能力,不排毒。因此,番鸭对H5N1亚型HPAIV具完全抵抗力的HI抗体水平的临界保护滴度为6.0log2。     

H9N2禽流感病毒全基因组密码子使用偏好性及影响因素分析

【目的】探究H9N2禽流感病毒(AIV)全基因组的密码子使用偏好性及影响因素。【方法】选取2010—2018年国内H9N2 AIV流行毒株的全基因组为研究对象,分析其碱基组成特性、最优密码子、密码子使用偏好性的影响因素以及病毒对宿主密码子使用模式的适应性。【结果】H9N2 AIV的全基因组中AU含量高于GC。大部分最优密码子以A或U结尾,有效密码子数(ENC)平均值为52.86,提示存在密码子使用偏好性但偏好性较低。密码子使用偏好性主要受到突变压力和自然选择的共同作用,其中自然选择(所占比例为61.79%～76.15%)作用大于突变压力(所占比例为23.85%～38.21%)。H9N2 AIV对人Homo sapiens的密码子适应指数平均值为0.739～0.741,提示H9N2AIV禽流感病毒可能已适应人类的密码子使用模式。【结论】本研究为H9N2 AIV的基因进化分析、已有疫苗的密码子优化和新型疫苗(密码子去优化疫苗)研制提供了理论依据。     

禽肉产品中禽流感与新城疫病毒多重RT-PCR检测方法的建立

根据禽流感病毒NP基因和新城疫病毒F基因各设计1对引物,经优化单项RT-PCR(sRT-PCR)反应体系,建立的多重RT-PCR(mRT-PCR)同时检测禽流感、新城疫的极限分别为10-2.5 EID50/0.1 mL和10-3.75 EID50/0.1 mL,mRT-PCR检测禽流感的敏感性与sRT-PCR一致,mRT-PCR检测新城疫的敏感性较sRT-PCR敏感性下降2个数量级。特异性试验表明,mRT-PCR仅检测到不同亚型(H1、H3、H5、H6和H9)禽流感、不同毒力新城疫病毒,对其他9种禽病原体和SPF鸡尿囊液均未扩增出片断。mRT-PCR检测39株禽流感H1、H5和H9亚型病毒、41株不同宿主源新城疫病毒,结果与sRT-PCR、HI试验完全一致;mRT-PCR和病原分离法同时检测人工感染鸡的组织脏器,2种方法检测禽流感的符合率为93.8%(30/32),检测新城疫的符合率为95.2%(20/21);采用mRT-PCR和病原分离法同时对35份进口禽产品、32份鸡粪拭子检测,2种方法检测禽流感的符合率为100%(67/67),对新城疫的符合率为97.1%(65/67)。病原分离法的检出率虽高于mRT-PCR,经统计学分析,两者差异不显著。     

"呼感特"对NDV和AIV的抑制试验

观察了抗病毒新药“呼感特”对鸡新城疫病毒 (NDV)和禽流感病毒 (AIV)在鸡胚中生长的抑制情况 ,结果发现 :经不同药物浓度感作的NDV和AIV在相应鸡胚中生长时 ,和对照组相比 ,鸡胚的保护率明显升高 ,病毒的增殖效价显著降低。同时 ,药物浓度越高 ,这种影响愈明显 ,且AIV组的变化比相应NDV组的变化更明显。     

NDV La Sota株与H_9N_2亚型AIV血凝谱的比较研究

为进一步研究NDV与AIV的生物学特性,为二者的鉴别诊断提供科学的依据,应用微量血凝(HA)试验比较观察NDV(La Sota)与AIV(H9N2)对鸡等17种动物红细胞的血凝谱。结果显示:NDV(La Sota)与AIV(H9N2)均可凝集鸡、鸭、鸽、鹌鹑、麻雀、喜鹊、赤颈鸫、三趾鹬、鹰鸮、长耳鸮、羊、小白鼠和人(O型)的红细胞,均不凝集兔的红细胞,但对牛、犬、猪红细胞的血凝特性有明显的差异。NDV(La Sota)可凝集这3种动物的红细胞且凝集效价均较高,而AIV(H9N2)对其则不具有凝集作用。表明NDV(La Sota)与AIV(H9N2)对不同动物红细胞血凝谱具有一定的差异性,特别是对不同哺乳动物红细胞的血凝性差异明显。     

Localization of Avian Influenza Virus in Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Chicken Tissues by In Situ Hybridization

In this study, in situ hybridization （ISH） was developed to detect avian influenza＇virus （AIV） in Madin-Darby canine kidney （MDCK） cells and formalin-fixed, paraffin-embedded chicken tissues. A cDNA probe corresponding to a region of AIV nucleoprotein （NP） gene was synthesized and labeled with digoxigenin. Probe specificity was determined by AIV infected MDCK cells in vitro and the results showed that strong cytoplasmic staining was only detected in AIV-infected cells. Various tissues were collected from 12 h to 35 days post-infection （PI） following inoculation with the H9N2 subtype A1V. AIV was localized in the epithelial cells of the duodenum and cartilage of the throat and trachea at 12 h PI. Tissues from uninfected chickens were negative. The finding of this study indicated ISH was a sensitive and specific technique to detect and localize AIV as well as to study AIV pathogenesis.