猪CHPT1基因的发现及其表达谱分析

【目的】对猪脂肪组织RNA的Solexa测序结果进行分析整理,发现猪新转录本CHPT1基因。研究CHPT1在猪不同组织及脂肪细胞不同分化阶段的表达谱,以便为后续的基因功能研究奠定基础。【方法】取猪的背部脂肪组织提取RNA,建立cDNA文库,进行Solexa测序,对测序结果进行生物信息学分析。利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）及实时荧光定量PCR,克隆猪CHPT1基因的CDs区部分序列,并对其在不同组织及脂肪细胞不同分化阶段的表达谱进行分析。【结果】由Solexa测序分析结果发现,猪存在新转录本基因CHPT1,其对应的Tag表达量在180日龄大白猪与240日龄荣昌猪的脂肪组织中无明显差异,在3日龄与240日龄荣昌猪脂肪组织中表达差异达到20倍以上。克隆获得了其CDs区193 bp的cDNA序列。实时荧光定量PCR检测结果表明,CHPT1基因在3日龄和180日龄大白猪的各个组织中均有表达,其中在肝脏和肾脏中表达量较高,且表达量有差异。3日龄与180日龄大白猪相比,肾脏和脂肪组织中CHPT1的表达量均有显著差异。在猪前体脂肪细胞的时序表达结果中,CHPT1表达量呈先增加后降低的趋势,其中第2天表达量明显升高,于第6天达到最大值,之后降低。【结论】猪存在CHPT1基因,其在猪的各个组织中都有表达,对猪的脂肪沉积可能发挥着重要作用。     

延胡索去甲乌药碱合成酶基因CyNCS1克隆及其表达模式分析

【目的】克隆延胡索去甲乌药碱合成酶（norcoclaurine synthase,NCS）基因,分析其在延胡索异喹啉类生物碱合成中的关键作用。【方法】基于转录组数据库,利用逆转录PCR克隆延胡索CyNCS1基因及其启动子区域序列,采用生物信息学方法分析其编码蛋白的理化性质、结构特征及其启动子区域顺式作用元件,同时进行多序列比对和系统进化树分析,确定其进化关系;利用实时荧光定量PCR对其根、茎、叶及发育早、中、晚期块茎的组织表达模式进行分析;对茉莉酸甲酯（MeJA）、脱落酸（ABA）处理0,4,8,12 h的叶片进行表达谱分析,以体积分数75%酒精溶剂处理为对照（CK）,确定该基因的表达特征。【结果】CyNCS1基因开放读码框长873 bp,编码291个氨基酸,编码蛋白分子量为33.09 ku,等电点为6.90,具有去甲乌药碱合成酶保守的催化结构域（GDGGVGTV/IL、YKEKF和MIEGGHLDMG）,且不含信号肽,预测定位于细胞核中。多序列比对结果显示,CyNCS1与石生黄堇、罂粟的NCS蛋白同源性较高,分别为83.6%和82.1%;系统进化树结果显示,CyNCS1与石生黄堇CsNCS蛋白聚为一支,说明二者亲缘关系较近。该基因启动子区长2 238 bp,包含多种植物激素及低温、热胁迫等环境因子的顺式作用元件。实时荧光定量PCR结果显示,随着发育推进块茎中CyNCS1的表达量显著增高,且受到MeJA和ABA的诱导,MeJA处理8 h时表达量为0 h的3.10倍,ABA处理8 h为0 h的3.16倍;而对照CyNCS1表达量随时间推移无明显变化。【结论】克隆并鉴定了延胡索NCS酶基因CyNCS1,明确了其在发育进程中的表达模式,并确定该基因表达受MeJA和ABA的诱导。     

钩藤UrLAMT基因及其启动子的克隆与分析

【目的】克隆钩藤(Uncaria rhynchophylla)中马钱苷酸甲基转移酶(loganic acid methyltransferase,LAMT)基因及其启动子，对UrLAMT基因的组织表达及其对生物和非生物胁迫的响应进行分析，并对UrLAMT及其启动子的生物信息学进行分析，为进一步研究UrLAMT转录调控奠定基础。【方法】基于钩藤的转录组数据设计引物，采用PCR从钩藤cDNA中克隆UrLAMT序列，并对其进行生物信息学分析；采用实时荧光定量PCR，分析UrLAMT在钩藤不同组织(根、茎、叶、花、果实、钩)中的表达，以及对外源茉莉酸甲酯(MeJA)、遮光/复光胁迫的响应；利用FPNI-PCR技术克隆UrLAMT上游启动子序列，并验证其活性，结合酵母单杂交试验，分析相应转录因子与UrLAMT启动子的调控关系。【结果】克隆得到钩藤UrLAMT序列，其长度为1 137 bp，共编码378个氨基酸。UrLAMT蛋白质相对分子质量为42.64 ku，理论等电点为5.76，为亲水性蛋白，无信号肽，不含跨膜结构，定位在细胞质中；UrLAMT基因在钩藤叶中表达量最高，其次为根；UrLAMT均能响应MeJA和光；其与短小蛇根草和长春花的进化关系较近。UrLAMT启动子序列长度为1 141 bp，除核心响应元件外还含有多个光响应元件，UrLAMT启动子在酵母中与光调控转录因子HY5存在相互作用。【结论】获得了UrLAMT基因及其启动子序列，其在钩藤叶中表达量最高，可能受光诱导。     

山羊Eda基因的克隆、序列分析及表达

【目的】克隆山羊Eda基因CDS区全序列,并对其进行序列分析,研究Eda基因在毛囊生长周期不同阶段皮肤组织中的表达规律。【方法】以太行黑山羊为研究对象,采集其毛囊生长休止期、生长期和退行期背部皮肤组织,采用RT-PCR技术克隆山羊Eda基因,通过在线软件Blastn进行基因cDNA序列分析,用SMART进行氨基酸序列分析,利用SWISS-MODEL软件进行蛋白质结构分析;以β-actin为看家基因,采用实时荧光定量PCR技术对 mRNA在毛囊生长不同时期皮肤组织中的表达规律进行分析。【结果】太行黑山羊Eda-A1基因CDS区全长1 176 bp,编码391个氨基酸;Eda-A2比Eda-A1少6个碱基（nt1161-1166）,编码389个氨基酸;山羊Eda蛋白氨基酸序列相似性在不同物种间均大于90%。SMART分析表明,CDS编码的蛋白质包含了TNF、跨膜区以及胶原等结构域。SWISS-MODEL软件预测结果表明,Eda-A2与Eda-A1在蛋白质表面结构上存在明显差异。毛囊退行期的皮肤组织中,Eda mRNA表达量最高,且极显著高于毛囊休止期和毛囊生长期（P＜0.01）,毛囊生长期的表达量中等且显著高于休止期（P＜0.05）,毛囊休止期的表达量较低。【结论】Eda基因CDS区在物种间保守性较强,Eda mRNA在毛囊生长周期不同阶段表达量有差异,推测Eda基因对毛囊生长周期的调控有一定影响。     

小麦转录因子TaWRKY28基因克隆与抗旱性分析

【目的】克隆小麦TaWRKY28基因,通过农杆菌浸染法将其转化至拟南芥,研究转基因拟南芥植株生理生化指标变化,探究其在抵御非生物胁迫中的作用。【方法】采用RT-PCR方法,从小麦百农207 cDNA中克隆得到TaWRKY28基因,利用ProtParam等软件对其氨基酸序列进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR方法,分析TaWRKY28基因的组织表达特异性及在NaCl、ABA、H₂O₂、干旱和低温逆境胁迫下的表达情况;构建基因超表达载体,通过花序浸染法转化拟南芥,选取TaWRKY28基因相对表达量较高的转基因T₃拟南芥株系,测定拟南芥超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）的活性以及丙二醛（MDA）、H₂O₂和脯氨酸含量,研究TaWRKY28对拟南芥抗旱性的影响。【结果】成功克隆获得小麦TaWRKY28基因,该基因ORF全长为978 bp,编码325个氨基酸,相对分子质量为34.87 ku,理论等电点为9.27,含有1个WRKY保守结构域和1个C₂H₂锌指结构域,属于WRKY基因家族的第Ⅱ类成员。序列系统进化分析结果显示,小麦TaWRKY28与大麦HvWRKY2亲缘关系最近。亚细胞定位显示该基因位于细胞核中。qRT-PCR结果表明,TaWRKY28在小麦根、茎、叶、雌蕊和雄蕊组织中均有表达,但具有组织特异表达性,在叶中表达量最高,雄蕊中次之,雌蕊中表达量最低,且受NaCl、ABA、H₂O₂、干旱和低温胁迫后TaWRKY28表达会增强。对TaWRKY28转基因拟南芥植株的抗旱性分析表明,在干旱条件下,转基因植株的表型优于野生型,SOD、POD活性和脯氨酸含量显著增加,而H₂O₂和MDA含量显著降低,转基因植株抗旱性显著提高。【结论】克隆了小麦TaWRKY28基因,该基因可以增强转基因拟南芥植株的抗旱能力。     

桔小实蝇丝氨酸蛋白酶基因（BdorSer）的克隆与表达分析

【目的】克隆桔小实蝇丝氨酸蛋白酶基因（Bactrocera dorsalis serine protease,BdorSer）,研究BdorSer在不同组织和不同发育时期的表达情况,探索其可能参与的生理过程。【方法】采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆BdorSer,对其编码蛋白氨基酸序列信息和进化关系进行分析;采用实时荧光定量PCR（real-time PCR）方法,研究BdorSer mRNA在桔小实蝇不同组织及不同发育时期的相对表达量。【结果】克隆获得了BdorSer,该基因ORF全长1 239 bp。氨基酸序列一致性分析表明,BdorSer与拟暗果蝇（Drosophila pseudoobscura）丝氨酸蛋白酶（登录号XP_001352960）氨基酸序列的一致性最高,为65.8%。实时荧光定量PCR分析表明,BdorSer mRNA在桔小实蝇雌雄虫的不同组织中都有表达,且在触角中的表达量最高,分别是雌虫胸部的43.6和26.8倍。BdorSer mRNA在生殖节中表现出较大的性别差异表达特征,雄虫生殖节中的mRNA表达量是雌虫的18.25倍。BdorSer mRNA几乎在昆虫发育的各个时期都有表达,其中在卵及1,2,3龄幼虫中的表达量分别是10 d 蛹的 0.68,1.63,4.31和15.8倍。BdorSer mRNA随蛹的发育其表达量逐渐减低,1,4,7 d蛹中的表达量分别是10 d蛹的325,125和41倍。【结论】克隆获得了BdorSer,其表达的BdorSer蛋白可能在雄虫的生殖生理中发挥了作用,同时也可能参与了桔小实蝇的变态发育过程,尤其是1 d蛹的发育过程。     

羊草 CDPK 基因全长 cDNA 的克隆及原核表达

【目的】通过对羊草 Leymus chinensis CDPK 基因进行克隆及原核表达,为进一步研究CDPK基因的功能,探讨羊草适应生境分子机制提供理论基础.【方法】用RT-PCR结合RACE技术克隆了羊草钙依赖蛋白激酶（CDPK）基因,命名为Lc-CDPK;构建了羊草CDPK基因的原核表达载体,转化到大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,经SDS-PAGE分析CDPK蛋白的表达情况.【结果和结论】羊草CDPK基因全长cDNA序列为1 704 bp,包括1个1 647 bp的开放阅读框,编码548个氨基酸,从第81~339个氨基酸构成了具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化活性的S-TKc结构域,有4个保守的EF手型结构域;编码区核苷酸序列与其他禾本科作物比对后发现,与小麦CDPK基因的相似性最高,相似度为96%;IPTG诱导表达出相对分子质量为61 350的融合蛋白,表达产物大小与预计理论值相符.诱导7 h蛋白表达量最高,表达量占菌体总蛋白的49.1%.     

桔小实蝇14-3-3基因的克隆和表达谱分析

【目的】克隆桔小实蝇14-3-3蛋白的基因（Bactrocera dorsalis 14-3-3,Bdor 14-3-3）,研究Bdor 14-3-3 mRNA在不同组织和不同发育时期的表达情况,探索其是否参与了桔小实蝇的发育过程。【方法】采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆Bdor 14-3-3;采用实时荧光定量PCR（real-time PCR）方法,研究Bdor 14-3-3 mRNA在桔小实蝇不同组织及不同发育时期的相对表达量。【结果】克隆获得了Bdor 14-3-3基因,其编码区长度为747 bp,编码248个氨基酸残基。氨基酸序列一致性分析表明,在昆虫纲中,桔小实蝇与刺舌蝇14-3-3蛋白的序列一致性最高,为98.8%,与豌豆蚜的序列一致性最低,为85.4%。实时荧光定量PCR分析表明,Bdor 14-3-3 mRNA在桔小实蝇不同组织和发育时期都有表达;在雌虫头（去除触角）和翅中的相对表达量均较高,分别是触角的1.39和1.44倍;在雄虫胸和后足中的相对表达量均较高,分别是前足的1.28 和1.23倍。在蛹的早期发育过程中Bdor 14-3-3 mRNA表达量逐渐升高,到7 d蛹期相对表达量达到最高峰,是10 d蛹的4.91倍。【结论】克隆获得了Bdor 14-3-3基因,其表达的14-3-3蛋白可能参与了桔小实蝇的变态发育过程,尤其在蛹的发育过程中Bdor 14-3-3可能发挥着重要作用。     

银中杨DREB基因的克隆及表达

【目的】克隆银中杨抗逆转录因子DREB基因,为其功能的深入研究奠定基础。【方法】根据DREB AP2/EREBP保守区设计1对简并引物,采用PCR方法对银中杨（Populus albaxp）转录因子DREB基因中间片段进行克隆;再利用反向PCR方法对该基因的旁侧序列进行克隆,最终将两侧序列与中间片段拼接得到基因全长;同时,根据基因序-列设计1对特异引物,利用荧光定量PCR分析银中杨DREB基因在不同逆境胁迫中的表达情况。【结果】成功地从银中杨中克隆到1个DREB基因,命名为PaDREB（注册号：EF582843）。该基因序列长935 bp,ORF为819 bp,编码272个氨基酸;同源性比较与系统发育分析证实,银中杨DREB属于DREB转录因子家族,并与月季DREB2C具有较高的同源性;荧光定量PCR检测结果显示,盐、低温、干旱及ABA均能诱导DREB基因的表达。【结论】首次从银中杨中分离并克隆了DREB基因,并证实其参与了银中杨对盐、低温、干旱及ABA的应答。     

鸭梨GAPDH基因家族的克隆及其表达特征

【目的】从鸭梨中克隆GAPDH基因家族,筛选合适的鸭梨内参基因。【方法】采用同源克隆的方法,克隆鸭梨GAPDH基因家族,用半定量PCR方法分析4个鸭梨GAPDH基因在鸭梨幼叶、花蕾、盛花期花瓣、幼果期果肉和成熟期果心,以及幼果期、膨大期、成熟期和褐变期果心的表达特征。【结果】从鸭梨中成功克隆出了4个GAPDH基因,分别命名为PbGAPDHa、PbGAPDHb、PbGAPDHc1和PbGAPDHc2。其中PbGAPDHa和PbGAPDHb是由一个共同的祖先基因倍增进化来的,主要在鸭梨的幼叶中表达,其蛋白定位在质体;而PbGAPDHc1和PbGAPDHc2是一个基因的2种拷贝形式,在鸭梨的花、幼叶、果实等组织中表达量基本一致,在不同发育时期的果心中表达量也相近,其蛋白定位在细胞质。【结论】PbGAPDHc1和PbGAPDHc2适合作为鸭梨的内参基因。     

SA、MeJA、ACC和苹果轮纹病病原菌诱导湖北海棠MhWRKY1基因的表达

 【目的】从湖北海棠叶片中克隆MhWRKY1转录因子的全长cDNA序列,分析该基因在各种组织中(叶、茎、根)的表达特性,并分析SA、MeJA、ACC在叶、茎、根中诱导MhWRKY1基因的表达模式以及苹果轮纹病病原菌诱导条件下湖北海棠叶片中该基因的表达特性。【方法】利用电子克隆技术和RT-PCR验证相结合的方法,从SA诱导的湖北海棠全长cDNA文库中,克隆MhWRKY1转录因子的全长序列;利用生物信息学的方法对其进行结构和功能的初步分析;利用实时荧光定量RT-PCR技术分析该基因在不同组织中的表达以及在SA、MeJA、ACC和苹果轮纹病病原菌诱导下的表达特性。【结果】克隆了MhWRKY1基因的全长cDNA序列为1 338 bp,GenBank数据库登录号为FJ598139。生物信息学分析表明,该基因最大开放阅读框为993 bp,编码330个氨基酸。推导的氨基酸序列与杨树WRKY26、杨树WRKY20、大豆WRKY,马铃薯WRKY2、烟草WRKY、拟南芥WRKY7、水稻WRKY53的同源性分别为68%、68%、66%、60%,59%,49%和43%。该转录因子含有1个WRKY结构域,其N端含有1个WRKYGQK结构域,C端含有1个C2H2锌脂结构,属于第Ⅱ类型的转录因子。表达分析结果表明,MhWRKY1在叶和茎中的表达量较大,分别是根的4.81和3.75倍。在湖北海棠叶、茎、根中,SA、MeJA、ACC都可以诱导该基因的表达。另外,在所研究的72 h内,苹果轮纹病病原菌可以诱导该基因表达,且表达量在12 h达到最大,是未处理之前的9倍左右。【结论】MhWRKY1转录因子可能参与SA、MeJA和ET介导的植物抗病防卫反应的基本信号通路,并且参与对苹果轮纹病病原菌引起的防卫反应,在湖北海棠的的抗病过程中可能起着非常重要的作用。     

棉花GhPBL1基因克隆及抗枯萎病功能研究

【目的】克隆棉花中类受体胞质激酶（RLCK）基因GhPBL1,并进行抗枯萎病功能研究,为棉花抗病分子育种提供新的基因资源。【方法】基于枯萎病菌诱导棉花根部基因表达谱数据,并结合棉花数据库,从中筛选并克隆棉花RLCK家族基因GhPBL1,利用生物信息学软件分析其序列特征,采用实时荧光定量技术（qRT-PCR）检测基因在不同抗性品种的不同组织及枯萎病菌和外源激素处理下的表达情况,并通过病毒诱导基因沉默（VIGS）技术研究GhPBL1基因的抗枯萎病功能。【结果】GhPBL1基因的开放阅读框（ORF）为1116 bp,编码371个氨基酸残基,含有STYKc保守结构域,位于第81~360位氨基酸,属于RLCK家族基因。GhPBL1基因在抗病材料和感病材料的根、茎和叶中均有表达,且均在根中的相对表达量最高。枯萎病菌处理后,抗病材料中GhPBL1基因的表达水平明显高于感病材料。水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）均能诱导GhPBL1基因的表达,但该基因对SA胁迫响应时间早于MeJA胁迫。与对照植株（TRV:00）相比,TRV:GhPBL1沉默植株更易感病,且其抗病相关基因GhEDS1、GhCCR1、GhHCT1和Gh4CL的相对表达量显著（P<0.05）较低,但GhPR5基因的相对表达量极显著（P<0.01）较高。【结论】 GhPBL1基因具有明显的组织表达特异性,在抗病材料和感病材料中的表达水平存在差异,能被枯萎病菌诱导表达上调,且能响应SA和MeJA胁迫,推测GhPBL1基因在棉花抗枯萎病和外源激素胁迫中发挥正调控作用。     

紫花苜蓿高迁移率族蛋白基因MsHMG-Y调控花期的功能分析

【目的】开花是植物营养生长转向生殖生长的重要标志,对植物的生物量有重要的影响。紫花苜蓿作为世界上最重要的饲草作物之一,其产量和品质与开花时间密切相关。紫花苜蓿的最佳刈割时期是初花期,此时产量和品质最佳。前期获得一个与花期相关的编码基因HMG-Y,通过分析其结构及表达模式,探究其在开花调控途径中的功能,为揭示开花调节机制提供理论基础。【方法】同源克隆MsHMG-Y,并对其进行多序列比对和进化树分析。利用qRT-PCR检测不同组织和不同开花时期该基因的表达水平;分析MsHMG-Y受光照、赤霉素（GA3）、水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）诱导后的表达模式;观察过表达MsHMG-Y紫花苜蓿的表型,并分析开花促进因子与抑制因子的表达水平。【结果】MsHMG-Y与蒺藜苜蓿MtHMG-Y相似性最高,亲缘关系最近。组织特异性分析显示,MsHMG-Y在花、茎、叶中均有表达,其中,在父本和母本中均为花中表达量最高,叶中表达量最低;在早花表型父本的初花期表达量最高,在晚花表型母本的花芽分化期相对表达量最高。光周期分析表明,延长光照到16 h后,MsHMG-Y表达水平下调,延长光照到28 h后,MsHMG-Y表达水平持续低于对照组,说明该基因受光诱导后下调表达。外施50 μmol·L^-1 GA3、100 μmol·L^-1 SA、100 μmol·L^-1 MeJA后,与对照组相比,MsHMG-Y表达水平均上调,其中,GA3诱导1 h时表达量最高,为对照的3.5倍;SA诱导6 h时表达量最高,为对照的24倍;MeJA诱导3 h时表达量最高,为对照的11倍,说明该基因受3种激素诱导。表型观察发现,与对照相比,过表达MsHMG-Y紫花苜蓿开花较晚,促进开花相关基因的表达水平均下调,抑制开花相关基因的表达水平均上调,其中,表达量变化显著的有促进开花基因MsPHYA、MsGI和MsFTa1,分别降低了4.9、3.9和2.8倍,抑制开花基因MsTEM1和MsSVP的表达量分别提高了2.5和1.9倍。【结论】MsHMG-Y受光周期及外源激素GA3、SA和MeJA的诱导表达。MsHMG-Y对延迟苜蓿开花的调控机制有重要作用。     

病原诱导的小麦转录因子TaERF1b基因的分离和表达

 【目的】研究一个病原诱导的小麦ERF转录因子基因在对纹枯病菌、赤霉病菌防御反应中的作用。【方法】应用生物信息学、RT-PCR、RACE方法,从赤霉病菌诱导的小麦中,分离ERF转录因子基因的全长cDNA序列;利用半定量RT-PCR方法,分析该基因对小麦纹枯病菌、赤霉病菌及MeJA、ET和SA处理的应答表达情况。【结果】从赤霉病菌诱导的抗赤霉病小麦品种苏麦3号cDNA中,分离出1个编码ERF转录因子基因的全长cDNA序列。该基因暂被命名为TaERF1b,编码由280个氨基酸组成的蛋白质TaERF1b。TaERF1b具有保守的ERF/AP2结构域,但TaERF1b蛋白全长氨基酸序列与已克隆的ERF蛋白同源性较低（＜36.5%）。TaERF1b基因表达分析的结果表明,纹枯病菌、赤霉病菌侵染可快速诱导抗病小麦中TaERF1b基因的上调表达,该基因转录表达水平在防卫相关激素乙烯、茉莉酸处理早期显著增强,而且TaERF1b对外源乙烯、茉莉酸处理的响应时期早于对纹枯病菌、赤霉病菌的响应时期。【结论】分离出一个受病原诱导的小麦ERF新基因TaERF1b,其编码蛋白TaERF1b为植物ERF转录因子家族的一个新成员,可能通过茉莉酸、乙烯信号途径介导小麦对纹枯病菌、赤霉病菌的防御反应。     

甘蔗可溶性酸性转化酶（SoSAI1）基因的克隆及表达分析

【目的】克隆甘蔗可溶性酸性转化酶基因（SoSAI1）全长cDNA序列和5?侧翼启动子序列,并分析其序列特征和基因表达模式。【方法】利用RACE技术克隆SoSAI1的全长cDNA序列,应用生物信息学软件分析SoSAI1预期编码蛋白特征;采用Genome Walking技术克隆SoSAI1的启动子序列;采用实时荧光定量PCR分析不同生长期SoSAI1在甘蔗叶和茎中的表达,以及PEG 6000、100 mmol•L-1 NaCl和6℃胁迫下,SoSAI1在甘蔗苗期根和叶中表达模式。【结果】SoSAI1的cDNA序列全长为2 387 bp,ORF长2 058 bp,编码685个氨基酸,预测其分子量和等电点分别为74.44 kD和5.6,GenBank登录号为JQ406875。5?侧翼启动子序列长417 bp,含有胚乳特异表达顺式作用元件和参与干旱诱导的MYB结合位点,GenBank登录号为KC862314。SoSAI1表达在生理成熟期的花序和花序轴中较高,而在成熟茎和老茎中较低。15%PEG和6℃能诱导叶中SoSAI1表达,而15%PEG和NaCl能诱导根中SoSAI1表达。【结论】获得SoSAI1全长cDNA序列和部分启动子序列,SoSAI1在甘蔗生长发育和蔗糖积累,并在应对环境胁迫中发挥作用。     

烟草抗马铃薯Y病毒病相关基因NtPsaN的克隆及表达分析

【目的】从高抗PVY烟草品种VAM中克隆抗病相关基因,分析该基因的序列特征、进化关系和表达特性,研究其在烟草抗PVY防御反应中的作用,为培育抗PVY烟草新品种奠定基础。【方法】利用SSH结合cDNA芯片筛选出来的病害诱导特异表达基因片段,通过RACE技术克隆烟草抗病相关基因;生物信息学分析该基因保守结构域以及序列特征;采用MEGA4.0软件构建系统进化树;利用实时荧光定量RT-PCR技术研究该基因的表达特性。【结果】克隆了1个烟草抗病相关基因,命名为NtPsaN,该基因具有PsaN基因家族保守结构域,OFR长度507bp,编码168个氨基酸;构建了PsaN亚基系统进化树;实时荧光定量RT-PCR结果显示接毒之后该基因表达与不接毒对照相比有明显上调趋势。【结论】克隆得到一个烟草PVY抗病相关基因NtPsaN,其表达受PVY侵染诱导,该基因可能在烟草抵御PVY病害侵染过程中起重要作用。     

水稻WRKY80转录调节蛋白基因的分离与表达模式

【目的】分离水稻WRKY80,分析其编码蛋白的序列结构特征,了解其在各器官中以及病原接种、激素处理下的表达模式,为阐明其生物学功能奠定基础。【方法】基于水稻基因组数据库注释的Loc_Os03g63810基因的编码序列设计特异引物,用RT-PCR法从茉莉酸甲酯（MeJA）处理的水稻叶片中克隆WRKY80 cDNA 序列,运用生物信息学手段对推定的蛋白和启动子序列进行分析,用Northern杂交或实时荧光定量PCR方法研究基因的表达模式。【结果】 获得了WRKY80 cDNA序列,长1 392 bp,包含1个长1 164 bp 的完整开放读码框,编码387个氨基酸。WRKY80具有1个典型的WRKY 保守结构域,锌指类型为C2H2,归类于WRKY 第Ⅱ组;C-端为酸性结构区,且含连续的6个谷氨酰胺和8个丝氨酸,提示具有转录激活活性;预测其定位于细胞核。WRKY80与玉米和高粱等单子叶植物WRKY 的氨基酸序列同一性较高。WRKY80在各器官中组成性表达,在叶、根和穗中表达丰度较高,花中次之,在茎和颖果中丰度较低,且表达具有发育阶段相关性,在成熟叶、根中的表达分别高于幼叶和幼根;受稻瘟病菌、纹枯病菌、MeJA和乙烯利诱导表达,而水杨酸对其表达无影响。其表达模式与启动子顺式元件预测分析的结果基本一致。【结论】WRKY80具有转录因子的结构特征,推测其可能通过茉莉酸/乙烯介导的信号途径参与水稻的防御反应,也可能参与发育调控。     

受PVY诱导的烟草天冬氨酸蛋白酶基因Ntasp的克隆与分析

【目的】通过筛选并克隆烟草抗马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)相关基因,分析其在不同诱导时间的相对表达量,揭示烟草抗病毒诱导的分子机理,以期为烟草抗病毒病育种奠定基础。【方法】通过抑制差减杂交和cDNA芯片从PVY诱导的抑制差减杂交文库中筛选上调表达(Ratio2)的基因中间片段,用RACE技术克隆其cDNA全长,并利用实时荧光定量PCR分析其在不同诱导时期的相对表达量。【结果】从受PVY诱导的烟草叶片中筛选一条595bp的基因中间片段并克隆得到一个全长为1770bp的天冬氨酸蛋白酶基因Ntasp(GenBank登录号为GU144571),该基因编码506个氨基酸。多序列比对结果显示,该基因的编码产物与其它植物天冬氨酸蛋白酶家族成员具有高度的同源性,具有植物天冬氨酸蛋白酶典型的结构特征。实时荧光定量PCR分析表明,Ntasp在PVY接种早期上调表达。【结论】克隆得到一个烟草天冬氨酸蛋白酶基因Ntasp,其表达受PVY侵染诱导。     

甘蓝型油菜MAPK1在损伤和病原菌胁迫下的表达模式分析

【目的】分析BnMAPK1组织特异性表达特征,探究其在损伤和病原菌胁迫下的特征及参加的信号途径。【方法】在电子克隆的基础上,克隆BnMAPK1的启动子序列。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测BnMAPK1的诱导表达特征。【结果】从甘蓝型油菜中克隆了MAPK1的启动子序列,发现它含有多个激素响应元件和逆境胁迫响应元件。还发现植物激素茉莉酸甲酯（MeJA）、水杨酸（SA）、脱落酸（ABA）和过氧化氢（H2O2）,及损伤（wound）和核盘菌（sclerotinia sclerotiorum）均能在转录水平上激活BnMAPK1。甘蓝型油菜在损伤和接种核菌盘后,JA信号途径标志基因PDF1.2的表达量被诱导上升,而SA信号途径标志基因PR-1被抑制,推测甘蓝型油菜可能是通过茉莉酸（jasmonic acid,JA）信号途径响应损伤和病原菌入侵。【结论】甘蓝型油菜MAPK1受多种植物激素和胁迫的诱导,并且其启动子中含有多个激素响应元件和逆境胁迫响应元件,可能MAPK1在植物体抵抗外界多种胁迫中起重要作用,并且甘蓝型油菜可能是通过JA信号途径对损伤和病原菌入侵做出响应。