干旱胁迫下八棱海棠PCD特征检测及类caspase基因片段的克隆与分析

【目的】为了探明类caspase蛋白酶参与植物PCD的机制,【方法】以八棱海棠(Malus robusta Rehd.)实生苗为试验材料,对植株进行轻度干旱胁迫,检测叶片PCD的发生,并应用RT-PCR技术克隆类caspase基因。【结果】结果表明,轻度干旱胁迫后3周的叶片出现细胞染色质凝聚、胞质皱缩、细胞核变形等细胞凋亡的形态学特征。提取叶片DNA,观察到DNA呈现明显的"DNA Ladder",表现出典型的细胞程序性死亡的生化特征。在此基础上提取叶片RNA,采用RT-PCR获得长度为555 bp的类caspase基因片段。【结论】经同源性分析该片段与其他果树的同源序列相似性超过80%,提示该区段为保守序列。比对苹果基因组,八棱海棠基因组中存在半胱氨酸蛋白酶基因,该基因为单拷贝,并且存在2个同源基因,这为揭示干旱胁迫下八棱海棠调控PCD的机理及环境适应的分子机制奠定了基础。     

苹果砧木八棱海棠和新疆野苹果耐盐性的比较

新疆南疆盐渍化土壤苹果栽培极需抗盐砧木,作者以八棱海棠(Malus robusta Rehd)和新疆野苹果(Malus sieversii Roem)为试材,在不同盐浓度胁迫下盆栽,研究其若干生理生化指标和叶片的解剖结构。结果表明,在不同胁迫强度下,从叶片细胞质膜透性看,八棱海棠比新疆野苹果耐盐潜力略高;从可溶性蛋白含量看,八棱海棠具有比新疆野苹果更强的抑制细胞脱水能力。叶片解剖观察表明,与新疆野苹果相比,八棱海棠的叶片组织结构在高盐胁迫下表现更稳定。     

干旱胁迫诱导苹果属植物细胞程序性死亡的研究

用聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG6000) 对苹果属植物平邑甜茶(Malus hupehensis pampReld. ) 和新疆野苹果〔M. sieversii (Ledeb) Roem. 〕幼苗进行水分胁迫处理, 通过Southern杂交和Western杂交的方法检测胁迫条件下幼苗体内DNA Ladder及Caspase23蛋白酶。Southern杂交结果表明, 干旱处理后, 两种苹果的根和叶片中都有DNA Ladder产生; Western杂交结果显示, 在苹果的叶片中有杂交印迹,而根中没有。这说明干旱胁迫可以诱导两种苹果属植物发生细胞程序性死亡, 并且在细胞程序性死亡过程中叶片中都有类Caspase-3蛋白酶的产生。     

新疆苹果矮化砧木抗寒性主成分及隶属函数分析

通过对不同苹果矮化砧木品种间叶片的可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸和丙二醛含量以及过氧化物酶活性的测定,采用主成分及隶属函数综合分析评价方法,对8种苹果矮化砧木品种抗寒能力进行综合评价。结果表明:苹果矮化砧木品种间的抗寒力可用可溶性蛋白、丙二醛和可溶性糖含量来衡量,且苹果砧木的抗寒力大小为八棱海棠+Y-1YB0009八棱海棠YC0002八棱海棠+SH1八棱海棠+SH12八棱海棠+SH6平邑甜茶+Y-1平邑甜茶+SH1平邑甜茶。     

不同苹果砧木对连作土壤微生物及酶活性的影响

为了更好地利用砧木抗性来综合防控苹果连作障碍,以平邑甜茶（Malus hupehensis Rehd.）、富平楸子 [M. prunifolia（Willd）Borkh.]、八棱海棠（M. micromalus Makino）、新疆野苹果 [M. sieversii （Le deb.）Roem.]、山荆子 [M. baccata（Linn.）Borkh.] 为试材,探讨了不同苹果砧木对连作土壤中的酶活性、微生物以及酚酸类物质的影响。结果表明：以平邑甜茶为砧木的土壤磷酸酶活性最高,八棱海棠为砧木的土壤蔗糖酶活性最高,富平楸子为砧木的土壤脲酶活性最高;平邑甜茶为砧木的土壤真菌数量最低,富平楸子和平邑甜茶为砧木的土壤细菌数量较高,平邑甜茶为砧木的土壤细菌/真菌比值最高。从总酚酸含量来看,平邑甜茶为砧木的土壤酚酸含量最低,八棱海棠为砧木的土壤酚酸含量最高。综上,平邑甜茶为砧木的土壤真菌数量最少,土壤总酚酸含量最低,且相关土壤酶活性较高,说明其对连作土壤环境的改善效果最佳,更适合作为砧木综合防控苹果连作障碍。     

缺锌胁迫对苹果砧木幼苗形态及其锌积累的影响

 在人工气候室条件下,采用溶液培养法研究了缺锌胁迫下平邑甜茶（Malus hupehensis Rehd.）和小金海棠（Malus xiaojinensis Cheng et Jiang）两种苹果砧木幼苗生长量、根系构型参数、根系活力和锌积累量的动态变化。结果表明：缺锌条件下,两品种均表现不同程度的植株矮小,新生叶片黄化且簇生,节间缩短,根尖膨大等缺锌症状,小金海棠表现缺锌症状比平邑甜茶延迟7 d 左右。长期锌缺乏使平邑甜茶根系生物量显著降低。两品种缺锌植株根系长度、表面积、体积、根尖数从21 d 开始均低于对照;60 d时平邑甜茶较对照分别下降45.47%、44.2%、47.18%、43.14%,小金海棠分别降低38.95%、31.90%、32.58%、35.52%,平邑甜茶被抑制程度大于小金海棠。根系平均直径处理大于对照,且小金海棠表现根系膨大症状较平邑甜茶晚10 d。锌缺乏条件下小金海棠根系活力达最大比平邑甜茶晚15 d。处理和对照幼苗锌含量均表现为根系 > 茎 > 叶片,且小金海棠处理植株 > 平邑甜茶处理植株。平邑甜茶对缺锌胁迫较敏感,根系易受到伤害;小金海棠在缺锌胁迫下锌含量下降速率慢,对缺锌胁迫有较强的抵御和耐受能力。     

水分胁迫条件下苹果幼苗叶绿体抗氧化代谢研究

以苹果属八棱海棠和平邑甜茶组培幼苗为试材，研究了不同浓度ＰＥＧ６０００溶液处理条件下幼苗叶绿Ｏ_２~－和Ｈ_２Ｏ_２代谢变化。结果表明，随着水分胁迫的加重，苹果属植物叶绿体光合放氧活性和ＰＳⅡ电子传递活性先上升而后下降；叶绿体Ｏ_２~－和Ｈ_２Ｏ_２产生速率持续上升；ＳＯＤ、ＣＡＴ、ＡｓＡ－ＰＯＤ、ＧＲ活性在轻度水分胁迫条件下显著上升，在重度水分胁迫条件下显著下降，脂质过氧化产物ＭＤＡ含量则呈相反的趋势；叶绿体ＡｓＡ和ＧＳＨ含量随水分胁迫而下降；叶绿体膜脂质组分随水分胁迫而出现饱和脂肪酸含量上升，不饱和脂肪酸含量下降，不饱和脂肪酸指数下降，类脂中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的这种变化主要发生在ＭＧＤＧ、ＤＧＤＧ、ＳＬ和ＰＧ中。综合分析阐明了水分胁迫条件下苹果属植物叶绿体Ｏ_２~－和Ｈ_２Ｏ_２产生与清除的生理机理。种间各指标比较表明，水分胁迫条件下八棱海棠幼苗叶绿体比平邑甜茶具有较强的抗氧化能力。     

缺锌胁迫对苹果砧木幼苗抗氧化能力和激素含量的影响

 在人工气候室条件下,采用溶液培养法研究了缺锌胁迫对平邑甜茶（Malus hupehensis Rehd.）和小金海棠（M. xiaojinensis Cheng et Jiang）两种苹果砧木幼苗SOD、POD和CAT的活性,膜质过氧化水平及内源激素IAA、GA3、ZR和ABA含量的影响。结果表明,缺锌胁迫下,两品种叶片和根系中SOD活性显著下降,POD和CAT活性、MDA含量不同程度增加,但小金海棠SOD活性下降幅度较平邑甜茶小,POD和CAT活性增加比例大,且MDA积累量低。缺锌使两种砧木幼苗不同器官中IAA、GA3含量显著降低,ZR、ABA含量增加;小金海棠缺锌植株IAA、GA3、ZR含量较平邑甜茶高,ABA含量低。平邑甜茶缺锌植株膜质过氧化水平高,对缺锌胁迫较敏感,小金海棠在缺锌胁迫下抗氧化能力强,促进生长的激素含量高,对缺锌胁迫有较强的抵御和耐受能力;平邑甜茶缺锌植株膜质过氧化水平高,对缺锌胁迫较敏感。     

苹果5种砧木幼苗对连作土壤的适应性差异研究

 以苹果砧木新疆野苹果[Malus sieversii（Ledeb.）Roem.]、莱芜难咽（M. micromalus Makino）、平邑甜茶（M. hupehensis Rehd.）、山荆子[M. baccata（L.）Borkh.]和八棱海棠（M. micromalus）为试验材料,应用盆栽方法研究其对连作土壤的适应性差异。结果表明：连作条件下各砧木叶片光合速率和光合色素含量均低于非连作。平邑甜茶叶片光合速率降幅最小,仅为7.06%,其叶绿素a和类胡萝卜素含量降幅亦较小,分别为9.15%和8.17%。5种砧木根系抗氧化物酶活性及丙二醛（MDA）含量较各自对照升高。与对照相比,连作处理平邑甜茶根系超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性增幅均最小,分别为3.72%、26.60%和23.78%;平邑甜茶根系MDA含量增幅最小,为15.24%,莱芜难咽增幅最大,为54.56%。最终连作对5种苹果砧木的外在影响表现为生物量、株高和地径的下降,其中平邑甜茶适应性较强。     

水分胁迫下苹果实生苗茉莉酸的积累及其与水分的关系

 用气相色谱法测定苹果抗旱种新疆野苹果[Malus sieversii (Ledb) Roem. ]和较不抗旱种平邑甜茶[M. hupehensis (Pamp) Rehd.]根系、叶片和木质部汁液茉莉酸(jasmonic acid , JA) 对快速和缓慢水分胁迫的反应。结果表明, 两个种对水分胁迫反应灵敏。水分胁迫下两个种叶片气孔阻力与根系、木质部汁液中JA 含量呈显著对数相关关系, 而与叶片中JA 含量相关不显著。     

高温对平邑甜茶幼苗生物发光与能量代谢的影响

 以平邑甜茶[Malus hupehensis (Pamp) Rehd. var pingyiensis Jiang]当年实生苗为材料,研究了高温胁迫对幼苗生物发光的影响以及ATP含量、总呼吸、抗氰呼吸等的变化。结果表明,高温胁迫初期,平邑甜茶幼苗叶片超弱发光和荧光强度均下降,但随着高温胁迫时间的延长,两者均逐渐回升,并在48h时基本恢复到对照水平;但叶片磷光强度在高温胁迫的48h内一直逐渐升高;高温胁迫下,叶片的总呼吸速率降低,抗氰呼吸速率升高,同时ATP生成量也明显降低,显示高温胁迫下平邑甜茶叶片的生物发光与呼吸途径和能量代谢的改变密切相关。     

低磷胁迫下平邑甜茶根构型与磷吸收特性的变化

为揭示苹果适应低磷胁迫的机制,以平邑甜茶[Malus hupehensis （Pamp）Rehd.]为材料,采用水培方式研究了缺磷和复磷条件下根系磷吸收和根构型参数的变化。结果显示,平邑甜茶幼苗在缺磷营养液中培养120 h期间,根系磷最大吸收速率始终高于对照,并趋向一个较稳定的差值;缺磷处理最初12 h内根系磷吸收米氏常数Km值提高,但72～120 h明显下降。缺磷处理的平邑甜茶幼苗转到完全营养液中培养12～120 h,根系对磷的转运效率影响不大,而与磷的亲和力下降,并逐渐恢复到正常状态。平邑甜茶幼苗在缺磷条件下培养至11 d时,一级侧根总长度低于对照,但在17～26 d时,一级侧根总长度明显提高。结果表明,平邑甜茶在短期内主要通过磷吸收动力学的变化来适应缺磷胁迫,较长时期则通过根构型的变化来适应。     

平邑甜茶幼苗生长、根构型及吸收特性的容器调控

 以平邑甜茶[Malus hupehensis (Pamp.) Rehd.] 幼苗为材料, 研究了栽培容器形状对幼苗新梢生长、幼苗根构型特征及根系营养吸收特性的影响。结果显示, 生长在“深窄盆”中的幼苗新梢生长量最大, 主根粗, 侧根多且短, 毛细根丰富, 对钙及锌的吸收能力较强, 但根系活力及根系对磷、铁的吸收能力较弱; “等高径盆”中幼苗新梢生长量小, 根冠比接近1, 主根细短、一级侧根少且粗长, 对钾的吸收能力较强; “浅宽盆”幼苗根冠比最大, 一级侧根数量、长度和粗度居中, 二级侧根粗长, 根系活力及根系对磷、铁的吸收能力较强, 但对钾、钙及锌的吸收能力弱。     

水杨酸对根际低氧胁迫八棱海棠幼苗活性氧代谢的影响

 采用营养液水培系统,以苹果砧木八棱海棠(Malus robusta Rehd.)为试材,用叶面喷施的方法,研究了外源水杨酸(salicylic acid ,SA)对根际低氧胁迫下八棱海棠叶片活性氧(ROS)代谢的影响。结果表明：低氧胁迫下八棱海棠叶片丙二醛(MDA)、超氧阴离子 (O₂)、过氧化氢(H₂O₂)、谷胱甘肽(GSH)含量和抗氧化酶活性均高于对照,而抗坏血酸(AsA)含量低于对照;外源SA明显抑制MDA和O₂的积累,显著增强超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)的活性。说明SA作为化学诱抗剂,可抑制低氧胁迫下苹果幼苗体内活ROS的产生,提高抗氧化酶的活性,降低膜脂过氧化水平,从而减轻低氧胁迫对植株的伤害。     

低温对山定子和平邑甜茶幼苗根系氮代谢酶及游离氨基酸的影响

以苹果砧木山定子(Malus baccata Borkh.)和平邑甜茶(Malus hupehensis Rehd.)实生苗为试材,研究低温(昼10℃/夜2℃)对根系氮代谢关键酶活性和氨基酸含量的影响。结果表明:低温诱导山定子和平邑甜茶根系谷氨酰胺合成酶(GS)活性,与常温对照相比两砧木活性分别增加了119%和317%。低温同时降低了谷氨酸合酶(NADH-GOGAT)和谷氨酸脱氢酶(NADH-GDH)活性,两砧木NADH-GOGAT活性分别为常温对照的6.11%和48.43%,NADH-GDH活性分别为常温对照的47.07%和33.84%。低温对平邑甜茶GS活性和NADH-GDH活性的影响大于山定子,说明平邑甜茶对低温胁迫较敏感;山定子根系NADH-GOGAT活性受低温影响较大,而低温对平邑甜茶根系NADH-GOGAT活性没有明显影响。GS/GDH比值分析表明,低温前后根系中铵同化途径均以GS/GOGAT为主,但低温使GS/GOGAT途径在根系中的作用明显加强,尤其对平邑甜茶的效果更明显。低温增加了山定子和平邑甜茶根系游离氨基酸总量,山定子和平邑甜茶分别比对照增加了78.34%和89.79%,平邑甜茶游离氨基酸含量高于山定子。低温处理前根系中游离氨基酸以苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸和谷氨酸为主,低温处理后以苏氨酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸为主,低温显著提高了根系精氨酸的含量。     

外源NO对干旱胁迫下平邑甜茶幼苗叶绿素荧光参数和光合速率的影响

 以20%聚乙二醇（PEG6000）处理模拟干旱,利用一氧化氮（nitric oxide,NO）供体硝普钠（sodium nitroprusside,SNP）处理平邑甜茶[Malus hupehensis（Pamp.）Rehd.]幼苗,探讨外源NO对水分胁迫下平邑甜茶幼苗叶绿素荧光参数和光合速率的影响。结果表明：水分胁迫下平邑甜茶幼苗Fo显著上升,F_v/F_m、q_P、ETR、Yield、叶绿素含量和光合速率显著降低,q_N在胁迫的前3 d呈上升趋势,之后大幅度下降;通过外施不同浓度的SNP（100 ~ 700 μmol · L^-1）均使水分胁迫下平邑甜茶幼苗 F_o上升及F_v/F_m、ETR、q _P、Yield、叶绿素含量和光合速率下降幅度明显减小。不同处理缓解作用为：300 μmol · L^-1 SNP > 500 μmol · L^-1 SNP > 100 μmol · L^-1 SNP > 700 μmol · L^-1 SNP,其中300 ~ 500 μmol · L^-1 SNP处理缓解效应明显,但以300 μmol · L^-1 SNP处理效果最好。     

水分胁迫下湖北海棠根系线粒体及细胞死亡特性研究

用20% PEG6000处理湖北海棠(Malus hupehensis Rehd. ) 根系, 研究了水分胁迫条件下根系线粒体膜电位(Δψm) 、线粒体H₂O₂含量、细胞程序性死亡关键酶类caspase23 /7活性的变化。结果显示,在20% PEG6000处理前6 d, 根系线粒体Δψm缓慢降低, 第6天后急剧下降。线粒体H₂O₂含量在处理的第1～6天里缓慢升高, 第6天后则快速上升。TUNEL原位检测显示, PEG6000处理能够使根系切片上出现清晰的阳性反应斑点, 且随着处理时间的延长阳性反应斑点增多; 处理第3天和第6天, 根系中类caspase23 /7活性较低, 而处理第9天和第12天时类caspase23 /7活性成倍升高, 这表明20% PEG6000能够诱导湖北海棠根系细胞程序性死亡。     

平邑甜茶MhHSP70的特征及其对镉和渗透胁迫的反应

 以平邑甜茶为试材,通过RT-PCR及RACE技术,获得了一个热激蛋白基因HSP70的全长cDNA序列,命名为MhHSP70,GenBank登录号为HQ876864;该基因全长2 307 bp,序列高度保守,编码650个氨基酸,与苹果、番茄和烟草亲缘关系最近。在根系和叶片中,热激蛋白基因MhHSP70的表达均受镉和渗透胁迫（非热胁迫）诱导,并且随着硫酸镉和氯化钠处理浓度的升高以及聚乙二醇（PEG）处理时间的延长,MhHSP70的表达量逐渐增强。