利用拟南芥rd29A启动子驱动AtNHX1基因提高烟草耐盐性

拟南芥液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因(AtNHXl)在植物耐盐机制中有重要作用.为了鉴定AtNHX1基因功能和创制耐盐烟草新种质,本研究用农杆菌介导法将rd29A启动子驱动的AtNHX1基因导入烟草(Nicotiana tabacum L.),获得72株卡那霉素抗性再生植株,17株在MS+85.5 mmol/L NaC1培养基上生长良好.对其进行PCR、Southern杂交和Northern杂交检测,证实AtNHX1基因已整合到烟草基因组中,并进行正常转录,且其转录受盐逆境的诱导.在含盐(85.5、171、256和342 mmol/L NaCl)培养基上进行对照植株和转基因植株生长及叶片丙二醛含量的分析,结果显示,转基因株系的生长势和根发生能力明显优于对照,且叶片丙二醛含量显著低于对照,表明rd29A启动子驱动AtNHX1基因的导入和表达可显著提高转基因烟草植株的耐盐性.结果提示rd29A启动子驱动的AtNHX1基因表达单元可在异源植物中正常转录和表达,可用于植物耐盐基因工程育种.     

体外改组强耐盐基因NHXFS1在烟草中的表达及耐盐性分析

位于植物液泡膜的 Na+/H+逆向转运蛋白(NHX1)是将 Na+区隔化到液泡中的主要蛋白,对植物耐盐性起着极其重要的作用。NHXFS1 基因是以拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)和菊花(Flos chrysanthemi)的液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白基因 AtNHX1、OsNHX1 和 DmNHX1 为模板,通过 DNA家族改组技术,对其进行体外定向分子进化获得的一个功能显著增强的新基因。本研究利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumerfaciens)介导的叶盘法将 NHXFS1 基因转入烟草 (Nicotiana benthamiana)中,通过潮霉素抗性筛选出再生植株,经PCR 和 Southern blot 鉴定证实 NHXFS1 基因成功地整合到烟草基因组中。耐盐性测试结果显示,高盐胁迫条件下,萌发期和幼苗期的转基因烟草长势明显优于对照组,与对照组相比,转基因烟草叶片中积累了更多的脯氨酸和Na+。 RT-PCR和 Real-time PCR 结果表明,NHXFS1 基因在烟草中正常表达,盐胁迫条件下NHXFS1基因在根、茎、叶中的表达量分别上调了 1.01、0.60 和 1.79倍,跟对照组相比有明显提高(P<0.05)。研究结果提示,体外改组获得的新基因 NHXFS1 在植物耐盐基因工程和分子育种中具有较大的应用价值,同时也证明通过基因改组方法开发新基因用于改良植物耐盐性是可行的。     

转Na+/H+antiporter(Nhap)基因烟草植株的获得及耐盐性鉴定

Nhap基因编码一种质膜Na /H 逆向转运蛋白,在耐盐方面具有重要的研究价值。实验利用根癌农杆菌(Agrobac-teriumtumefacience)介导的叶盘法将Nhap基因转入烟草(Nicotianatobacum),经PCR和RT-PCR检测已获得转Nhap基因烟草的再生植株。同时从发芽率、存活率、叶绿素含量、Na 含量及耐盐性表现进行了F1代转基因烟草的耐盐性检测。结果表明,转基因烟草的发芽率、存活率、叶绿素含量均较对照高,Na 含量较对照有所下降,并且转基因烟草在200mmol/LNaCl处理下,仍能正常存活、生长,而对照烟草的生长却受到抑制。即转基因F1代烟草的耐盐性得到了显著的提高。     

表达液胞膜AtNHX1的转基因白三叶提高了耐盐性

以白三叶吸胀种子的子叶为转化体,用农杆菌介导法将拟南芥液胞膜Na+/H+ 逆向转运蛋白基因AtNHX1转入白三叶,经过筛选、分化和再生,得到了具有卡那霉素抗性的转基因植株。对这些植株进行PCR、Southern 印迹和 Northern 杂交分析,结果表明,外源目的基因已经整合到白三叶基因组中并且得到了表达。室内耐盐性试验结果表明,表达AtNHX1的转基因植株总叶面积和地上部分干重都显著高于非转基因对照,说明液胞膜上的AtNHX1基因有助于提高白三叶耐盐性。     

种植与组培9年的转AhDREB1基因毛白杨耐盐性比较

为了对栽培9年后转AhDREB1基因毛白杨的耐盐性进行评价,并探究田间种植与组培继代2种不同生长条件对转基因毛白杨耐盐性的影响,以从大田种植9年的转AhDREB1基因杂种毛白杨[(Populus tomentosa×Populus bolleana)×P.tomentosa]中获得的株系(T46-F)和组培继代9年的2个转基因杂种毛白杨株系(T46、T12),以及非转基因杂种毛白杨株系(CK)为试材,通过对外源基因进行PCR检测,发现9年后AhDREB1基因仍然稳定整合在转基因植株中。通过不同浓度的Na Cl胁迫试验,对各株系的相对电导率进行分析,进一步选择测定0.6%浓度Na Cl处理水平下各株系的株高、地径生长量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性、丙二醛(MDA)含量、脯氨酸含量和叶绿素相对含量,对不同转AhDREB1基因毛白杨株系的耐盐性进行分析和比较。结果表明,所有株系的相对电导率、MDA含量均随Na Cl浓度增加而增大,但高盐浓度下转基因株系T46-F、T46、T12的相对电导率、MDA含量均显著低于CK。无论是在非盐条件,还是0.6%Na Cl胁迫下,AhDREB1基因的导入均能显著提高毛白杨植株的SOD、POD活性,脯氨酸含量。其中0.6%浓度Na Cl胁迫下,T46-F、T46、T12的SOD活性分别是CK的2.51倍、3.20倍、2.55倍;POD活性分别是CK的1.23倍、1.63倍、1.10倍;脯氨酸含量分别是CK的1.51倍、1.69倍、1.62倍。此外,转AhDREB1基因毛白杨叶绿素含量下降显著低于CK,同时株高、地径生长量显著高于CK。组培继代9年的转基因株系的脯氨酸含量、株高生长量显著高于在大田种植9年的转基因毛白杨,而相对电导率显著低于大田种植转基因株系,说明组培继代培养更有利于保持转基因毛白杨的耐盐性。综上可知,转AhDREB1基因显著提高了毛白杨的抗氧化酶活性,调控渗透调节物质的积累,从而减轻细胞膜的氧化损伤,降低了相对电导率,提高了毛白杨的耐盐性,综合考虑各个指标,各株系耐盐性的大小顺序为T46T12T46-FCK。本研究为通过转AhDREB1基因提高植物耐盐性提供了理论参考。     

毛竹液泡膜Na+/H+逆向运输蛋白基因克隆及表达分析

植物Na+/H+逆向转运蛋白具有稳定细胞质内Na+浓度和调节pH值的功能,对植物的耐盐性具有重要的作用。利用RT-PCR和RACE技术分离出毛竹(Phyllostachys pubescens)Na+/H+逆向转运蛋白编码基因PpNHX1的cDNA序列,全长2290bp(GenBank登录号为GU295174)。该基因的编码蛋白PpNHX1包含545个氨基酸残基,进行BLASTp比对,发现其与芦苇(Phragmites communis)PcNHX1、水稻(Oryza sativa)OsNHX1的序列同源性分别为89%和88%。系统发育分析表明,PpNHX1蛋白与禾本科植物液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的亲缘关系较近,与质膜型Na+/H+逆向转运蛋白亲缘关系较远。以半定量RT-PCR检测PpNHX1基因的表达情况,发现PpNHX1受到200mmol/L NaCl胁迫的诱导,在4h内的表达量随NaCl处理时间延长持续增强,其中根部的表达增强幅度明显高于茎和叶;但4h后,PpNHX1在根与叶中的表达量均有所下降。推断PpNHX1基因在盐胁迫下的表达调控与毛竹耐盐能力密切相关。     

植物盐诱导基因的研究进展

阐述了的几年有关植物盐诱导基因的研究进展,主要淑及与以下几个方面有关的分子克隆或基因：（１）渗透调节,包括对脯氨酸、甜菜碱、糖醇代谢的调节;（２）光合作用与代谢;（３）钙调蛋白;（４）通道蛋白;（５）胚相关蛋白等,并对本研究领域的发展趋势进行了讨论。     

7种植物K~＋/H~＋逆向转运蛋白的生物信息学分析

K＋/H＋逆向转运是普遍存在于几乎所有生物体内的重要离子平衡机制之一。该机制主要由多基因家族KEA（K efflux antiporter）介导。然而,长期以来对KEA的功能特征和生理意义的认识,除了在大肠杆菌中有零星的报道之外,绝大部分尚为空白。本文通过生物信息学分析,比较了7个植物物种KEA的同源和进化关系,发现KEA家族中的部分成员在物种进化过程中具有极高的保守性。以模式植物拟南芥为例,进一步研究了KEA的蛋白质跨膜结构、关键结构域和亚细胞定位预测等。结果表明,AtKEA大多具有10～12个跨膜结构,是典型的膜蛋白,在跨膜区的N端有多个丝氨酸磷酸化调控位点;都含有K＋/H＋交换结构域和相应的调控域,推测其能够介导K＋/H＋交换。基因芯片研究表明,AtKEA在根、茎、叶、花和荚果等不同组织器官的表达丰度不同,表明KEA基因家族各成员的生理功能具有时空分异性。上述结果可为进一步深入研究植物K＋/H＋逆向转运系统的功能提供借鉴。     

盐胁迫下宁夏枸杞Na+吸收及Na+/H+转运蛋白与H+-ATPase基因表达的研究

为从分子水平揭示宁夏枸杞钠的吸收积累机理,本试验采用原子吸收分光光度法和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法,对盐胁迫下宁夏枸杞根中Na⁺、K⁺含量以及质膜和液泡膜Na⁺/H⁺转运蛋白与H⁺-ATPase基因表达水平进行测定分析。结果表明,相同胁迫时间下,随着NaCl处理浓度的增加,枸杞根系中Na⁺浓度总体呈缓慢增加趋势,K⁺含量呈先增加后减少趋势,Na⁺/K⁺比值呈先减少后增加趋势;编码质膜和液泡膜的Na⁺/H⁺转运蛋白基因LbSOS1、LbNHX1以及液泡膜H⁺-ATPase基因LbVHA-C1表达量均呈升高趋势,质膜H⁺-ATPase基因LbHA1表达量呈先升高后降低趋势。相同NaCl处理浓度下,随着胁迫时间的延长,Na⁺含量总体呈增加趋势,K⁺含量呈先增加后减少趋势,Na⁺/K⁺比值呈增加趋势。LbSOS1、LbNHX1表达量总体呈先升高后降低趋势,LbVHA-C1、LbHA1表达量总体呈降低的趋势。相关性分析显示,不同胁迫时间下,枸杞根中LbSOS1、LbNHX1、LbVHA-C1和LbHA1表达量与Na⁺含量存在一定的正相关或负相关。上述结果表明,在低浓度NaCl胁迫时,维持枸杞体内较高的K⁺/Na⁺比值是宁夏枸杞耐盐的主要方式之一,同时也说明在胁迫初期,质膜和液泡膜的Na⁺/H⁺转运蛋白与H⁺-ATPase参与了枸杞细胞中Na⁺及时排出胞外和区隔于液泡,从而保持了根细胞内Na⁺的稳定性。此外,随着胁迫时间的延长和NaCl处理浓度的增加,LbSOS1、LbNHX1、LbVHA-C1和LbHA1的表达水平均降低,而 Na⁺积累量大幅增加,致使枸杞抗盐性降低。本研究揭示了宁夏枸杞的耐盐机理,为利用宁夏枸杞改良宁夏大面积盐碱地提供了理论依据。     

转碱蓬SsNHX1基因烟草的耐盐抗旱性研究

烟草是重要的模式植物和经济作物,盐害和干旱两种环境因子对其生长发育、产量和品质都危害很大。为了提高烟草的耐盐抗旱性,本研究利用农杆菌介导的遗传转化法在烟草中过量表达了碱蓬液泡膜Na~+/H~+逆向转运基因SsNHX1,对转基因烟草的耐盐及抗旱性进行表型鉴定和各项生化指标的检测,以期得到耐盐抗旱表性良好的SsNHX1转基因烟草。表型分析发现,SsNHX1基因过表达株系L1和L5的抗盐能力比野生型显著提高,表现为盐胁迫条件下仍能保持旺盛的生长且根系的伸长未受抑制。SsNHX1过表达株系在叶片和根系中积累了更多的Na~+和K~+,同时Na~+含量增长速率较快,而K~+含量降低速率较缓,并可维持较高的叶片相对含水量和叶绿素含量,及较低的丙二醛含量和相对电导率。干旱胁迫发现,过表达株系受干旱胁迫程度更小,并在复水后迅速恢复正常生长。同时,过表达株系的丙二醛含量和相对电导率显著低于野生型,且维持了较高的叶片相对含水量及叶绿素含量。这些结果说明SsNHX1基因在烟草中过量表达后,降低了盐胁迫和干旱胁迫对烟草根系及细胞膜的损伤,并通过调节离子含量、降低细胞的渗透势,维持了叶片较高的相对含水量和叶绿素含量,最终提高了烟草的抗盐和抗旱性。