牛早期胚胎的性别鉴定PCR技术的研究

根据牛SRY(Y-染色体性别决定基因)基因序列自行设计合成3对常规PCR引物作为牛性别鉴定特异性引物,对15头公牛、20头母牛的样品进行检测.结果表明,第2对引物可清晰扩增出公牛基因组DNA750 bp左右条带,而母牛基因组DNA无此扩增条带,证明这条引物可以应用于牛的早期胚胎性别鉴定研究与应用.     

牛早期胚胎性别鉴定PCR反应体系的优化研究

根据牛SRY基因序列设计合成2对巢式PCR引物作为性别鉴定引物，根据牛酪蛋白基因序列设计了一对引物作为内标引物建立了牛胚胎性别鉴定的PCR反应体系。同时对常规PCR和巢式PCR在牛早期胚胎性别鉴定中的实用性进行比较。15头公牛、13头母牛的DNA样品检测结果表明：使用巢式PCR公牛可以扩增出205bp的SRY基因片段和403bp的酪蛋白基因片段，母牛只能扩增出403bp的酪蛋白基因片段；而使用常规PCR时公牛扩增出255bp的SRY基因片段和403bp的酪蛋白基因片段，母牛只能扩增出403bp的酪蛋白基因片段，其性别鉴定结果和实际完全一致。由于巢式PCR只需10个细胞就可以在紫外透射分析仪下看到扩增结果，而常规PCR则需要20～30个细胞，所以胚胎性别鉴定时使用巢式PCR效果更好。试验采用巢式PCR鉴定了10个奶牛胚胎的性别，同时还对血清是否会对试验结果产生影响进行了研究。     

中国麦洼牦牛、美国荷斯坦奶牛的性别鉴定

根据中国黑白花奶牛的ZFX、ZFY基因序列设计引物ZFY1、ZFX2、ZFY3,对中国麦洼牦牛、美国荷斯坦奶牛ZFX、ZFY基因片段进行PCR体外扩增和性别鉴定.结果显示ZFY1、ZFX2引物对ZFX、ZFY都能扩增出一条652bp片段;ZFY基因特异性引物ZFX2、ZFY3只能对雄性扩增出一条359bp的片段;特异性引物ZFX2、ZFY3能对中国麦洼牦牛、美国荷斯坦奶牛进行性别鉴定.     

中国麦洼牦牛、美国荷斯坦奶牛的性别鉴定

根据中国黑白花奶牛的ZFX、ZFY基因序列设计引物ZFY1、ZFX2、ZFY3，对中国麦洼牦牛、美国荷斯坦奶牛ZFX、ZFY基因片段进行PCR体外扩增和性别鉴定。结果显示：ZFY1、ZFX2引物对ZFX、ZFY都能扩增出一条652bp片段；ZFY基因特异性引物ZFX2、ZFY3只能对雄性扩增出一条359bp的片段；特异性引物ZFX2、ZFY3能对中国麦洼牦牛、美国荷斯坦奶牛进行性别鉴定。     

奶牛胚胎工厂化生产的应用研究

本实验对20头荷斯坦青年奶牛进行活体采卵,共获卵母细胞131枚,回收率65.17%。以牛雄性特异序列BOV97M和牛属1.715卫星DNA序列设计引物进行PCR扩增,将发育至囊胚阶段的胚胎性别鉴定,共检测25枚胚胎,12枚为雌性,13枚为雄性,把雌性胚胎进行移植,怀孕3头,受胎率25%,产出母犊3头,准确率100%。     

扩增SRY基因鉴定牛、羊胚胎性别的初步研究

本研究利用本试验室设计的SRY基因3对常规PCR引物扩增牛SRY基因和羊的SRY基因,结果表明：第2对引物扩增出公牛和公羊基因组的DNA 750 bp左右清晰条带,而母牛、母羊基因组DNA元此扩增条带,说明第2对引物可以应用于牛和羊的早期胚胎性别鉴定;     

扩增SRY基因鉴定牛、羊胚胎性别的初步研究

本研究利用本试验室设计的SRY基因3对常规PCR引物扩增牛SRY基因和羊的SRY基因,结果表明:第2对引物扩增出公牛和公羊基因组的DNA 750 bp左右清晰条带,而母牛、母羊基因组DNA无此扩增条带,说明第2对引物可以应用于牛和羊的早期胚胎性别鉴定;     

兔早期胚胎PCR性别鉴定体系的建立

根据兔SRY基因序列设计两对引物作为兔雄性特异性引物,根据兔APP基因序列设计1对引物作为内标引物,分别建立了兔早期胚胎性别鉴定的双重PCR和巢式PCR反应体系,在不同浓度的基因组DNA和兔早期胚胎上进行性别鉴定应用,同时,对兔SRY巢式PCR引物特异性进行了分析。结果表明,多重PCR扩增兔基因组DNA可以准确判定其性别,扩增灵敏度为100pg基因组DNA;多重PCR鉴定24枚兔32细胞桑椹胚性别,只能对整胚成功鉴定。巢式PCR,公兔基因组DNA扩增出282bp的SRY基因片段,母兔没有扩增产物,扩增灵敏度为10pg;对24枚兔32细胞桑椹胚性别鉴定结果表明,巢式PCR可以对少至4个胚胎细胞进行准确鉴定,同一胚胎结果符合率为100%(24/24)。SRY引物只对兔雄性基因组DNA特异,而其他动物(人、牛、绵羊、小鼠)雄性DNA及兔的冲卵液,均无PCR产物。     

利用性别决定基因(SRY)进行牛早期胚胎性别鉴定的研究

利用牛性别决定基因(SRY)和酪蛋白αs1基因(CSN1S1)分别设计雄性特异性引物和内标引物,两对引物均各设计一对嵌套式引物进行多重PCR和多重巢式PCR,用于牛早期胚胎性别鉴定。SRY基因和CSN1S1基因外、内引物扩增片断长度分别为357bp、232bp、528bp和367bp。实验结果表明,这两个引物组合建立的多重PCR扩增体系均有较高的扩增稳定性和准确率,但在常规PCR体系中,它们的灵敏度均不高(约50pg,相当于16个细胞的DNA量),这在一定程度上限制了其在胚胎性别鉴定中的应用。而由二者建立的巢式PCR灵敏度可达到5pg,故可以很好地满足胚胎性别鉴定的需要。     

采用四引物ARMS-PCR方法检测奶牛乳腺组织DGAT1基因单核苷酸多态性

试验旨在快速有效地检测泌乳奶牛的二酰甘油转酰基酶1（diacylgycerol acyltransferase 1,DGAT1）乳脂量性状的优势等位基因K232A单核苷酸多态性,确定DGAT1基因型进而确定泌乳性状,为中国荷斯坦奶牛分子标记辅助选择提供技术支持。选取6头泌乳初期（3头为高乳产量牛,3头为低乳产量牛）中国北方荷斯坦奶牛为研究对象,提取乳腺组织基因组DNA,分别设计1对外引物和1对内引物,建立一种四引物ARMS-PCR体系快速检测奶牛乳腺组织DGAT1基因单核苷酸多态性。结果发现,外引物扩增片段长度为512 bp,为PCR反应的阳性对照,基因型为232K扩增片段长度为369 bp,基因型为232A扩增片段长度为181 bp。PCR结果显示,6头牛的乳腺组织样本均由外部引物扩增出长度为512 bp的片段,泌乳期高乳产量奶牛和泌乳期低乳产量奶牛乳腺组织的特异性扩增片段长度均为181 bp。表明本研究选取的6头奶牛样本DGAT1基因K232A多态性均为232A型。提示该PCR鉴定方法能够快速有效地鉴定奶牛DGAT1基因型,可用于中国荷斯坦奶牛分子标记辅助选择。     

秦岭羚牛性别鉴定的初步研究

根据牛的Sry基因核心序列设计合成1对引物F1、R1。应用PCR技术对羚牛(TAKIN)Sry基因进行扩增,结果在羚牛雄性样本扩增出1条带(230 bp),而在雌性样本未见扩增带,显示了Sry基因的性别特异性,应用这1对引物对60只未知性别的羚牛组织样本进行了性别鉴定,结果雄性14个,雌性46个。该试验为羚牛种群性别比率及其种群动态变化机制研究提供了资料。     

哺乳动物胚胎性别鉴定试剂盒的研究

依据牛、山羊、兔、猪等哺乳动物SRY基因高度同源性设计一对22 bp的SRY引物,按照3×2×3因子组合,建立了PCR扩增胚胎DNA最适条件。采用此最适条件扩增了15个羊-兔异种克隆胚胎DNA,结果表明PCR法可以用来鉴别哺乳动物胚胎的性别。采用设计的性别鉴定引物,按照最优PCR扩增胚胎DNA条件配制了PCR性别鉴定试剂盒。     

应用PCR检测隐孢子虫卵囊的研究

隐孢子虫病是一种重要的人畜共患原虫病。为了在临床样品中更准确、快速地检测隐孢子虫卵囊，从初步纯化的含有不同数量隐孢子虫卵囊的样品中和含有不同数量隐孢子虫卵囊的奶牛粪便中，直接提取DNA或用DNA纯化试剂盒对提取的奶牛粪便中卵囊DNA进行纯化之后用作PCR模板，用1对人工合成寡核苷酸作为PCR引物，扩增片段大小为452bp。优化了Mg^2 浓度、引物浓度和dNTP浓度，并进行了特异性检验。建立的PCR具有隐孢子虫属特异性，不仅扩增出新鲜样品DNA提取物中的目的片段，而且扩增出放置6年之久的DNA提取物中的目的片段。样品经过初步纯化之后，最低检测值100个卵囊／ml；从含有隐孢子虫卵囊的奶牛粪便中提取DNA，尔后经过DNA纯化试剂盒纯化，PCR最低检测值为10^5个卵囊/g粪便。     

基于Nc2和Nc5基因的新孢子虫PCR方法的建立

本试验筛选了新孢子虫病PCR检测的引物,运用《新孢子虫病检疫技术规范》(SN/T 3499-2013)对根据犬新孢子虫Nc2和Nc5基因设计的PCR引物进行了评价。此外,同时运用F1/R1、F2/R2和SN/T 3499 F/SN/T 3499 R共同对14份荷斯坦牛和19份西门塔尔牛全血DNA进行PCR检测,旨在筛选出特异性较好的引物,建立新孢子虫病PCR检测方法和了解当地不同品系牛患新孢子虫病的感染率。结果显示,3对引物分别扩增出105、128和231 bp目的片段,均与预期目的片段大小相符;其中,F1/R1与SN/T 3499 F/SN/T 3499 R的最低检测量相同,为19.9 fg/μL,F2/R2最低检测量为199 fg/μL,说明F1/R1和SN/T 3499 F/SN/T 3499 R引物的敏感性更好;运用F1/R1、F2/R2引物分别对19.9 pg/μL和199 fg/μL模板重复进行4次扩增,均出现了较明亮的扩增条带,证明两对引物重复性较好。33份血液样品共检出6份阳性DNA,阳性率分别为21.43%和15.79%,检出复合率为100%。以上结果说明F1/R1和F2/R2引物均可作为新孢子虫病PCR的诊断引物,本试验初步建立了新孢子虫PCR方法,同时初步了解了当地牛群中新孢子虫感染情况,为有效预防和控制新孢子虫病提供了科学的理论依据。     

牙釉质基因鉴定麇鹿性别

性别鉴定是调查野生种群雌雄性比的重要方法,对野生动物种群管理具有重要意义。而牙釉质(AMEL)基因在性染色体上具有较高的保守性,在鉴定动物性别方面得到了应用,本次试验采用北京麋鹿生态实验中心的15头糜鹿组织样本,其中11个来自雄性麇鹿鹿茸,4个来自雌性糜鹿静脉血液。对所取样本分别进行基因组DNA提取、AMEL基因片段PCR扩增、纯化、测序。得到了AMEL基因鉴定和实际雌雄性别个数差异不显著(P>0.05)。结果表明:雌性麋鹿产生1条322 bpX带和1条N带,雄性麋鹿则产生322 bpX带和277 bpY带以及1条N带,雄鹿(10/10)和雌鹿(4/4)性别鉴定结果分别都与实际性别符合,所以,使用鹿茸角和血液样本进行AMEL.基因扩增电泳分析可以对糜鹿性别鉴定。     

Establishing the Screening PCR Diagnostic Method of Neosporacaninum Based on Nc2 and Nc5 Genes

To screen applicable PCR diagnostic primers of Neosporacaninum based on Nc2 and Nc5 genes,two pairs of primer were designed according to the Nc2 and Nc5 genes sequences conserved region and"Quarantine Protocol For Neosporosis"(SN/T 3499-2013)were applied to verify the characteristic of primers.14 Holstein and 19 Simmental cattles blood DNA were detected using these primers by PCR to select specific primers which would be used to establish the new detection method and understand the neosporiasis infection rate of different local cattle farms.The results showed that 105,128 and 231 bp gene fragments were amplified using three pairs of primers,which were consistent with the expected fragment size.The F1/R1 and SN/T 3499 F/SN/T 3499 R minimum detectable amount both were 19.9 fg/ μL and the minimum amount of F2/R2 was 199 fg/ μL,indicating that F1/R1 and SN/T 3499 F/SN/T 3499 R were more sensitive than F2/R2.The bands were bright when used F1/R1,F2/R2 primers to amplify 19.9 pg/μL and 199 fg/μL DNA samples,proving two primers had good repeatability.6 positive samples were detected among 33 blood samples,and the positive rate was 21.43% and 15.79%,the recombination rate was 100%.It showed that F1/R1 and F2/R2 primer were both suitable to detect eneosporosis by PCR and the method was preliminary established.The condition of local cattle Neosporacaninum infections were learned.This study could provide a scientific basis for the effective prevention and control of neosporosis.     

牙釉质基因鉴定山羊性别的研究

根据牙釉质(amelogenin,AMEL)同源基因在山羊X、Y染色体上存在不同程度碱基缺失的特点,设计1对引物,对山羊血液基因组DNA混合样进行PCR扩增,将PCR产物纯化、克隆并测序;然后对46个山羊血液DNA样本(♀:22个,♂:24个)进行性别鉴定。结果显示,雌性山羊样品经扩增只产生一条非特异性条带,雄性山羊样品产生一条非特异性条带和一条特异性条带;非特异性片段长度为349 bp,特异性片段为289 bp;46个山羊血液DNA样本鉴定结果与实际性别对比,雌性准确率为100%(22/22),雄性准确率为100%(24/24)。     

应用Sry-PCR扩增鉴定狍(Capreolus capreolus)的性别

根据人的SRY基因核心序列设计合成1对引物C1、C2，应用PCR技术对野生狍(Capreolus capreolus)Sry基因(哺乳动物Y染色体DNA雄性特异区)进行扩增．结果在野生狍雄性样本扩增出1条带(221bp)．而在雌性样本未见扩增带．显示了Sry基因的性别特异性。应用这1对引物对42个未知性别狍肌肉组织样本进行了性别鉴定．结果雄性22个，雌性20个。对Sry-PCR产物克隆测序，得到185bp的Sry基因部分核苷酸序列。本试验为狍种群性别比率及其种群动态变化机制研究提供了资料。     

火烈鸟性别鉴定的分子标记方法

由于火烈鸟在外观上雌雄极为相似,很难用常规方法对其性别进行鉴定。本试验首次确立了利用PCR技术对火烈鸟性别进行鉴定的分子标记方法。从火烈鸟血液中提取总基因组DNA,针对性染色体上的CHD基因和EE0.6序列,筛选了4对引物进行特异性扩增,其中3对引物组合成2个组(A/B和B/C)进行多重PCR。结果表明,3组引物都在雄性个体中扩增出1条片段,在雌性中扩增出2条片段;待测群体中雄性个体11只,雌性个体6只。经检验,利用3组引物都能准确鉴定火烈鸟性别,为该物种在分子水平上的性别鉴定奠定了基础。