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从大豆(花生豆1号)未成熟种子中提取总RNA,逆转录形成cDNA第一条链。根据genebank中大豆llS球蛋白Gy5的cDNA序列设计引物,用PCR方法扩增Gy5的cDNA序列,克隆到pUC19质粒载休上,并测定其全序列。用限制性内切酶PstI和EcoRI酶切重组质粒,将目的片段与质粒pCAMBIA1301连接,构建成植物表述载体并转化到农杆菌中,以便于以后的研究利用。 相似文献
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亚麻CAD基因克隆及反义表达载体的构建 总被引:1,自引:0,他引:1
本试验以亚麻(Linum usitatissimum L.)品种Argos为材料,分离了高纯度的RNA.用简并引物以RT-PCR的方法,克隆了亚麻CAD基因cDNA部分序列,长度为477bp,构建了pGEM-T-CAD质粒.用限制性内切酶EcoR I酶切pGEM-T-CAD质粒和载体pGEM-7Zf(-),进行连接,构建成中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒.用限制性内切酶Xba I和BamH I双酶切中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒和pBI121栽体,进行连接,构建了亚麻CAD基因反义植物表达载体pBI121-antiNTCAD. 相似文献
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本试验以亚麻(Linum usitatissimumL.)品种Argos为材料,分离了高纯度的RNA。用简并引物以RT-PCR的方法,克隆了亚麻CAD基因cDNA部分序列,长度为477bp,构建了pGEM-T-CAD质粒。用限制性内切酶EcoRI酶切pGEM-T-CAD质粒和载体pGEM-7Zf(-),进行连接,构建成中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒。用限制性内切酶XbaI和BamHI双酶切中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒和pBI121载体,进行连接,构建了亚麻CAD基因反义植物表达载体pBI121-antiNTCAD。 相似文献
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甜菜蔗糖磷酸合成酶基因的克隆及序列分析 总被引:1,自引:0,他引:1
甜菜蔗糖磷酸合成酶(Beta vulgaris sucrose phosphate synthase,BvSPS)是甜菜体内控制蔗糖合成的关键酶之一。根据Genbank上的BvSPS序列(Genbank accession no.X X81975),利用RT-PCR方法,从甜菜体内扩增获得了BvSPS基因的cDNA全长,并将其连接到pMD 18-T载体上。通过利用PstI、XbaI和EcoRI对重组质粒pMD 18-T-BvSPS进行酶切鉴定,进一步确定了重组质粒的正确性。利用生物信息学软件分析结果表明,该基因cDNA全长为3138bp,编码1045个氨基酸,蛋白质分子量为118.18kDa,等电点为6.15,该蛋白被预测定位于细胞核内。 相似文献
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大豆种子不仅富含蛋白质,而且赖氨酸含量较高,利用大豆高赖氨酸基因能够弥补谷类作物种子赖氨酸含量的不足.运用现代分子生物学技术,从高蛋白大豆南农87C-38中克隆11S球蛋白Gy7全基因及cDNA序列.经生物公司测序后,利用vector NTI软件将所克隆的Gy7全基因及cDNA序列与Genbank(AF319776和AF319777)报道的序列进行比对分析,同源性分别为99%和99.6%.序列比对结果显示,Gy7基因cDNA与Genbank报道的序列之间所有的核苷酸差异都位于第3外显子.由此推测,第1、第2和第4外显子编码的氨基酸对于G7多肽形成特定高级结构可能具有非常重要的作用,它们在进化过程中受到的选择压力可能比第3外显子更强.根据遗传密码表推测,克隆的Gy7与Genbank报道的cDNA序列所编码的多肽,两者存在2个氨基酸组成的差异.大豆球蛋白Gy7优质基因的获得为今后利用转基因技术改良水稻、小麦等谷类作物的营养品质奠定了基础. 相似文献
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构建大豆fad3c基因的沉默载体,旨在为培育生物安全的高油酸低亚麻酸转基因大豆奠定基础。从高蛋白大豆黑农35中克隆大豆种子特异表达启动子GY1;从高油大豆黑农37中克隆fad2-1b基因内含子1;从5个转基因受体大豆中克隆fad3c基因片段,作为正向臂和反向臂。构建筛选标记基因为bar,启动子为GY1,内含子为fad2-1b基因内含子1的双T-DNA载体。将双T-DNA载体转化大肠杆菌DH5α,酶切和序列分析鉴定表明扩增得到的重组质粒正确,命名为pDT-GFAD3I。 相似文献
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巴西橡胶HMG—CoA还原酶基因cDNA的扩增与克隆 总被引:3,自引:2,他引:3
从橡胶树高产无性系(热研7—33—97)的新鲜胶乳制备总RNA,采用磁吸附法从总RNA纯化mRNA,加反转录酶得到cDNA,以cDNA为模板,设计并人工合成一对特异引物,采用聚合酶链式反应(PCR技术)扩增到一段约1.0kb的DNA片段,用1%低融点琼脂糖电泳回收目的DNA片段,然后将目的DNA克隆到pGEM—5Zf(-)质粒载体上。 相似文献
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根据NCBI中发表的大豆Rubisco小亚基基因(rbcS)序列(AF303939-1)设计特异引物,以吉农13大豆为实验材料,采用Trizol法提取叶片总RNA,通过RT-PCR克隆大豆rbcS的cDNA。将该基因与原核表达载体pET-30a(+)连接,转化大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞,双酶切鉴定后筛选阳性克隆,测序结果显示:rbcS全长 696bp,其中开放阅读框为537bp,编码178个氨基酸;选择含大豆rbcS cDNA阳性克隆菌液IPTG诱导,经SDS-PAGE分析,诱导表达出分子量为29.1kDa的融合蛋白,表达产物大小与预计理论值相符。诱导7h蛋白表达量最高,为64.15%。 相似文献
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Summary The potato leafroll virus (PLRV) coat protein (CP) gene was directly cloned from the total RNA extracted from virus-infected
plants. First strand cDNA synthesis was not necessarily specific; it was equally efficient using either random or CP-specific
primers. The viral sequence encoding the coat protein was specifically amplified from the total population of cDNA molecules
by polymerase chain reaction (PCR), using specific primers bordering the CP gene. The unique amplified product thus obtained
was cloned blunt-end into the pT7T318U plasmid vector, and the authenticity of the cloned gene verified by sequence analysis.
This cloning strategy obviates the need for virus purification. Sequence comparison of the CP gene of the Italian isolate
and those of five other PLRV isolates revealed a close similarity to the three European and the Canadian isolates, and a more
distant relationship with the Australian one. 相似文献
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重叠延伸PCR克隆拟南芥ACCase基因和植物表达载体构建 总被引:1,自引:0,他引:1
植物的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酸单酰辅酶A,是脂肪酸合成的第一步,该步骤是种子脂肪酸合成与含油量形成的关键调控步骤。拟南芥中的真核形式ACCase基因cDNA长约7,000bp,难以直接克隆。本研究先通过常规PCR将其cDNA分成八个重叠的片段分别扩增出来,再用重叠延伸PCR将得到的片段逐步拼接成长度为6890bp的完整的基因序列,测序证实克隆序列正确无误,最后将其克隆到农杆菌转化植物的载体上。序列分析发现ACCase基因的开放阅读框长度为6765bp,编码一个含2254个氨基酸残基的多肽链,推测其分子量约为250KDa。ACCase基因的成功克隆为利用该基因调控油料作物的含油量奠定了良好基础,同时为克隆长度较大的基因提供了一种经济可行的方法。 相似文献
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采用3'RACE方法对香蕉(Musa AAA Cavendish Subgroup)ACC合成酶含3'末端的cDNA进行扩增,扩增产物被克隆到pCR*2.1载体上,转化大肠杆菌DH5α,筛选到重组质粒(pACS2),并对插入片段进行序列测定。结果表明,3'RACE产物长1 680 bp,其中一个开放读框内的核苷酸序列编码444个氨基酸,氨基酸序列包括了ACC合成酶中所应具有的7个高度保守区。同时该产物还有长269 bp的3'末端,并具有完整的Poly(A)尾(24mer)。 相似文献
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大豆胞囊线虫病(soybean cyst nematode,SCN)是大豆生产上的重要病害,野生大豆是拓宽大豆抗病育种遗传基础的重要种质资源。为开发野生大豆资源,利用SLAF-seq技术,以杂交组合“绥农14×ZYD03685”的亲本、 126个F2单株及其衍生的F2:3家系为试验材料,进行了SLAF标签的开发、遗传图谱的绘制和QTL分析。共获得7783个SLAF标签用于遗传图谱绘制,遗传图谱总长度为2664.2 cM,20个连锁群的平均长度为133.21 cM。两个SCN 抗性QTL(qSCN-1 和qSCN-2)分别位于Chromosome(Chr)18 4.25~4.31 Mb和Chr18 13.50~13.81 Mb,分别解释了 22.96%和10.96%的抗性(胞囊指数)变异,QTL区段内分别包含了6个和14个基因。qSCN-2 区段未见有前人关于 SCN抗性QTL的报道,为新的QTL。本研究为SCN抗性机制解析和利用ZYD03685进行SCN抗病分子育种提供了 相似文献
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播种后遭遇渍害是南方夏大豆生产面临的主要逆境危害之一。为研究不同大豆种质播后对浸水耐性差异表现,以种子浸种120h模拟渍害条件,测定137份大豆材料浸泡液电导率,并进行标准发芽试验,统计种子发芽势(GPP)、发芽率(GP)、正常苗率(NSP)等指标,并利用主成分分析、聚类分析等分析方法对多个指标进行多元统计分析,利用综合耐浸水指标及简易指标对大豆种子耐浸水能力进行等级划分,筛选耐浸水能力强的大豆材料。结果表明,浸水处理120h后,GPP、GP、NSP、轻微损伤粒率(SISP)、严重损伤粒率(IBSP)、烂粒率(DSP)及电导率等6个指标的变异系数均大于50%,GPP、GP和NSP同大豆百粒重呈显著负相关,电导率同百粒重呈显著正相关。利用主成分分析提取两个主成分:“健康因子”和“过渡因子”,贡献率分别为64.45%和15.83%,根据两因子得分矩阵进行聚类分析,可将供试材料划分为3类。利用综合指标法将137份大豆材料划分为5种耐浸水级别,表现耐浸水的大豆材料9份,并在GP、GPP、NSP三个简易耐浸水指标筛选中同时表现耐浸水的大豆材料5份,可作为进一步筛选鉴定的对照种质资源。大豆浸泡液电导率与种子正常苗率相结合可作为大批量筛选耐浸水种质的指标。 相似文献
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本研究基于电子克隆获得的大豆GmASADH 基因cDNA序列,根据其编码区设计特异引物,以大豆品种小鹦哥豆总RNA为模板,通过RT-PCR 获得了约1130bp的cDNA片段,T/A 克隆后进行序列测定。测序结果显示,GmASADH基因家族有两个成员,命名为GmASADH1(FJ581425)和GmASADH2(HM015631)。GmASADH1编码区长度为1134bp,编码378个氨基酸,由7个外显子和6个内含子构成,定位于Gm08染色体。GmASADH2编码区长度为1131bp,编码377个氨基酸,由7个外显子和6个内含子构成,定位于Gm05染色体。两个基因在氨基酸水平上的相似性达到了96.02%,在二级及三级结构上均有不同程度的差异。ASADH蛋白含有NADB_Rossmann superfamily和Semialdhyde_dhC superfamily结构域。 相似文献