冠突散囊菌和植物乳杆菌联合发酵对绿茶液态饮料品质的影响

为了抑制冠突散囊菌发酵绿茶液态饮料中儿茶素的降解,本研究采用植物乳杆菌和冠突散囊菌对绿茶液态饮料进行联合发酵,试验通过响应面法优化了联合发酵绿茶液态饮料工艺,并采用高效液相色谱（HPLC）法和顶空固相微萃取串联气质联用（HS-SPME/GS-MS）法分别检测了联合发酵绿茶液态饮料中儿茶素含量和香气成分。结果表明,在干茶添加量10βg·L^-1、冠突散囊菌添加量10βmL·L^-1的前提下,联合发酵绿茶液态饮料的最佳工艺条件为植物乳杆菌添加量20βmL·L^-1、蔗糖添加量75βg·L^-1、30℃下静置发酵3βd。在此工艺下联合发酵绿茶液态饮料中总儿茶素含量为1β419.94βμg·mL^-1,与冠突散囊菌发酵绿茶液态饮料（848.72βμg·mL^-1）相比,显著增加（P<0.05）;且醇类化合物（30.27%）、醛类化合物（15.25%）、烃类化合物（11.35%）、酯类化合物（9.86%）和酮类化合物（9.01%）含量与未发酵绿茶液态饮料相比均显著增加（P<0.05）。     

二步发酵法在西番莲果皮酵素加工中的应用

以西番莲果皮为对象,研究酿酒酵母菌、乳酸菌二步发酵工艺,制备乳酸菌和酿酒酵母菌活菌数高、多酚保留好、风味醇和的果皮浆。通过单因素和正交优化实验,以酿酒酵母菌和乳酸菌活菌数、总酚、乙醇生成量为指标,分别优选了单一乳酸菌和酿酒酵母菌发酵的工艺参数,在此基础上,通过测定总酸含量、活菌数、总酚含量等指标的变化,确定二步法发酵西番莲果皮浆的工艺参数为：发酵总时间40 h,酿酒酵母菌初始接种量1.5%,在29 ℃下发酵16 h后,再接入2.0%复合乳杆菌（干酪乳杆菌∶植物乳杆菌=1∶1）,在37 ℃下继续发酵24 h至终点。制备的西番莲果皮发酵液中,复合乳杆菌活菌数为8.93 lg CFU/mL,酿酒酵母菌活菌数为7.78 lg CFU/mL,总酚含量为24.00 μg/mL,总酸含量为4.40 mg/mL。二步发酵法发挥了酿酒酵母菌产香、产乙醇抑制杂菌,以及乳酸菌提高酸度、保留多酚物质的优点。     

生防枯草芽孢杆菌Czk1固体发酵工艺条件优化

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Czk1是一株具广谱拮抗、促生和诱导植株产生抗病性的根际益生菌。为了全面资源化利用农业废弃物中的有机养分和促进对植物土传病害的生物防治,本研究以Czk1为研究对象,以鸡粪为底肥,分别利用玉米秸秆、菌糠、椰糠堆肥为原料,采用液固两相发酵工艺,以稀释平板菌落计数法测定活菌总数和芽孢数,经过单因素和正交试验方法,明确Czk1固体发酵物料的配方、工艺参数和培养条件。得出Czk1固体发酵的最优条件：最佳原料为菌糠鸡粪堆肥,Czk1接种重量为10%,黄豆粉添加量为10%,含水量为40%,发酵温度为37℃,翻抛1次/72h,在此条件下,Czk1菌株中的芽孢活菌数量总量可以达到8.63×10⁸ CFU/g,芽孢数为8.37×10⁸ CFU/g。其次,发酵效果较佳的原料为秸秆鸡粪堆肥,Czk1接种量为10%,添加5%黄豆粉,40%含水量,发酵温度为37℃,翻抛1次/72 h,此条件下,Czk1接种菌株中的活菌数量总量可达到6.53×10⁸ CFU/g,芽孢数为5.97×10⁸     

茶叶籽乳杆菌的分离鉴定及其发酵作用特性研究

为阐明茶叶籽水浆发酵微生物种类及其在发酵过程中的作用特性,对发酵5βh的茶叶籽水浆发酵液进行微生物分离与提纯,从中分离纯化出1株菌株。经形态观察、16βS rDNA及pheS基因测序与比对、系统发育树的构建与分析,确定该菌株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum ssp. Plantarum）;命名该菌株为茶叶籽乳杆菌（Lactobacillus plantarum ssp. plantarum JJZ21）,菌种保藏号为CCTCC M 2016471。在茶叶籽水浆发酵过程中,发酵液中茶叶籽乳杆菌的数量在5βh之后逐渐快速增加,至12~15βh之间达到最大值,之后又逐渐降低,至22βh后,逐渐趋于稳定。伴随茶叶籽乳杆菌数量的增加,发酵液中的干物质含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量及其pH均明显下降,呈极显著（P<0.01）负相关性。茶叶籽乳杆菌通过消耗发酵液中的可溶性糖及可溶性蛋白等物质,向发酵液中分泌乳酸等酸性有机物,导致发酵液pH逐渐降低,为发酵液中的油脂体上浮以及茶叶籽水浆发酵分层现象发生奠定了基础。     

香蕉果酒接种发酵和自然发酵过程中乳酸菌菌落变化及有机酸代谢特征

香蕉营养丰富、活性物质含量高，可作为深加工产品的优质原料。香蕉果酒是香蕉精深加工产品中的重要一类。由于香蕉果浆碳水化合物含量较高、酸度低、糖分高，其酿造过程中适宜各种微生物的生长繁殖，特别是乳酸菌数量的变化与酸类物质的产生密切相关。乳酸菌群落的变化容易增加发酵过程的风险，造成香蕉酒挥发酸含量超标、品质低下等不良结果。因此明确香蕉果酒发酵过程中自然存在的乳酸菌的生长繁殖规律及其对有机酸代谢的影响，可为精准调控发酵过程、提高产品质量提供理论依据。试验设置商业酵母Lalvin K1^TM接种发酵过程（K1）与香蕉果汁自然发酵过程（SF）2组对比，采用实时定量PCR方法和高效液相色谱法对香蕉汁接种发酵（K1）与自然发酵过程（SF）中酵母菌、乳酸菌的生长规律以及有机酸的含量变化进行监测。结果表明：2种发酵处理下，酵母菌和乳酸菌的生长规律有差异；K1酵母菌主导的发酵过程中，乳酸菌的生长受到显著抑制，最大生长量仅为4.0×10⁶ CFU/mL，而酵母菌生物量为1.2×10⁷ CFU/mL；在自然发酵过程中，乳酸菌与酵母菌的生长周期完全错开，但对乳酸菌的生物量无显著影响，乳酸菌与酵母菌的生长量分别达到1.0×10⁷ CFU/mL和1.6×10⁷ CFU/mL。2种发酵过程均表明，酵母菌和乳酸菌的生长存在竞争与抑制关系；有机酸代谢主要与乳酸菌菌落数量相关，不同有机酸的总体变化趋势一致；在发酵过程中，乳酸含量逐渐增加，乙酸含量呈先增后降的趋势，二者在自然发酵样品中的累积量均高于接种发酵；柠檬酸、苹果酸、酒石酸含量整体呈下降趋势。     

海南鱼酸中乳酸菌的分离鉴定

从海南鱼酸中分离出4株优势乳酸菌L2、L3、L8、L11,根据形态、生理生化特征和分子生物学特征鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。其中L2菌株产酸速率最快,可用于鱼酸纯种发酵。     

水稻细菌性谷枯病菌的实时荧光PCR检测技术研究

 水稻细菌性谷枯病菌Burkholderia glumae于2007年被列为我国进境植物检疫性有害生物,国内急需建立针对该菌切实可行的检测技术, 以有效控制它在我国的传播。采用实时荧光PCR（real time fluorescence PCR）和经典PCR技术进行水稻细菌性谷枯病菌检测。研究结果表明,供试所有谷枯病菌都能产生139 bp左右的特异性片段,非谷枯菌株均无特异性片段产生。两种检测方法的灵敏度比较发现,常规PCR技术在病菌浓度为104CFU/mL时即可检测到,实时荧光PCR技术在病菌浓度为102CFU/mL时即可检测到,后者比前者的灵敏度高100倍。将模拟带菌种子与灭菌种子按1∶100混合,实时荧光PCR技术可以检测到该菌的存在。     

大豆GmGolS基因高温胁迫应答及启动子活性分析

肌醇半乳糖苷合成酶(GolS)是棉子糖系列寡糖(RFOs)生物合成途径中的关键酶。为探究大豆GmGolS基因的高温胁迫调控机制,通过实时荧光定量PCR检测GmGolS在高温胁迫下的表达量,通过PCR从大豆基因组DNA中扩增GmGolS基因启动子序列,将其连接到植物表达载体pCAMBIA1301上并转化烟草,通过GUS组织化学染色和实时荧光定量PCR检测GmGolS启动子的高温诱导启动活性。结果表明：高温胁迫可以强烈诱导GmGolS的表达。1 739 bp的GmGolS启动子序列中含1个生长素响应元件、1个干旱诱导的MYB转录因子结合位点、2个厌氧诱导元件、1个防御和胁迫响应元件、1个脱落酸响应元件、1个茉莉酸响应元件和1个缺氧诱导元件。成功获得3棵GmGolSP转基因烟草植株。GmGolS启动子的活性可以被高温胁迫诱导。     

解淀粉芽胞杆菌的GFP标记及定殖能力

采用改良的海藻糖电转化法获得GFP标记菌株X5-GFP、BQA2-GFP,显微镜观察标记菌株在土壤和水培中的番茄根际的定殖情况。结果表明:标记菌株单独或与青枯菌先后加入进行处理,番茄根际标记菌株的种群数量变化趋势都是一致的。在土壤番茄根际中,X5-GFP单独处理后当天的菌量为1.05×106CFU/g,随之菌量逐渐下降;处理30 d后,为1.50×10~3CFU/g;而BQA2-GFP单独处理后当天菌量为1.68×106 CFU/g,随之菌量也逐渐下降;处理30 d后,为2.50×10~3CFU/g;在水培番茄根际中,X5-GFP单独处理后当天的菌量为2.70×10~5CFU/g,随之菌量逐渐下降;处理30 d后,为1.00×10~3 CFU/g;而BQA2-GFP单独处理后当天菌量为3.60×10~5CFU/g,随之菌量同样逐渐下降;处理30 d后,为1.50×10~3 CFU/g。这表明解淀粉芽胞杆菌X5、BQA2均在番茄根际有较强的定殖能力。     

不同微生物菌剂对辣椒疫病防控效果及土壤细菌群落结构的影响

明确不同微生物菌剂对辣椒疫病的防效及其对根际土壤细菌群落结构的影响，为辣椒疫病的绿色防治技术的研发提供依据。采用盆栽试验方法，以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)、淡紫褐链霉菌(Streptomyces enissocaesllis)等6种微生物菌剂为研究对象，通过高通量测序研究这些微生物菌剂对辣椒疫病的防控效果及其对根际土壤细菌群落结构的影响。结果表明，A₁(1×10⁸CFU/g枯草芽孢杆菌微囊粒剂)、A₂(1×10⁸ CFU/g哈茨木霉菌水分散粒剂)处理的防效最好，防治效果分别为85.58%和81.97%;A₃(5×10⁸ CFU/g荧光假单胞杆菌颗粒剂)、A₄(4×10⁹ CFU/g淡紫褐链霉菌NBF715粉剂)、A₅(1×10¹⁰     

TSA诱导橡胶树次生乳管分化过程qRT-PCR内参基因的筛选

橡胶树乳管分化过程中差异表达基因的鉴定对于进一步认识乳管分化的分子机理具有重要的作用。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）是进行基因表达分析的常用技术手段,合适内参基因的选择是准确进行基因表达定量的前提。以组蛋白去乙酰化抑制剂曲古抑菌素A（trichostatin A, TSA）诱导橡胶树次生乳管分化的实验系统,采用qRT-PCR技术分析TSA处理橡胶树萌条及对照内层树皮中22个候选内参基因的表达情况。结果显示：TSA诱导橡胶树萌条次生乳管分化的过程中,稳定性最高的3个基因分别为UBC3、UBC4和eIF1Aa,而稳定性最差的3个基因分别为ROC3、PTP、CYP2。以UBC3、Actin和ROC3基因为内参,分析组蛋白去乙酰化酶基因HDA1和HDA2在TSA处理下树皮中表达量相对于对照的变化,结果初步证实TSA诱导橡胶树萌条次生乳管分化的过程中,UBC3是最佳的内参基因,ROC3不适合作为内参基因。     

茶树NUDIX基因家族的鉴定及表达分析

NUDIX水解酶属于焦磷酸酶，在信息传递、植物生长协调和响应逆境胁迫等方面起着重要作用。基于茶树(Camellia sinensis)基因组鉴定出43个NUDIX家族基因，并运用生物信息学和实时荧光定量PCR等方法对其分析。结果表明，43个CsNUDXs蛋白质分子量介于11.8～89.2 kDa，氨基酸长度为102～342个，理论等电点为4.49～9.26,18.6%的蛋白为稳定性蛋白；根据进化关系将CsNUDXs分为6个亚家族；启动子顺式作用元件分析发现CsNUDXs具有许多与激素响应、逆境胁迫和生长发育等调控相关的作用元件；对CsNUDXs家族基因在不同器官表达模式进行分析，发现CsNUDX3、CsNUDX7在果实中表达量较高，而CsNUDX22、CsNUDX25在果实中表达量极低，CsNUDX30在老叶中表达量极低；不同处理组的实时荧光定量PCR结果表明，1 mmol·L^-1茉莉酸甲酯(MeJA)处理下CsNUDX1、CsNUDX2和CsNUDX33等表达量呈现先升后降再升的趋势，而1 mmol·L^-1水杨酸(SA)处理下CsNUDX4...     

应用实时荧光定量PCR研究BBTV DNA1在香蕉不同组织中的含量

为准确定量香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)DNA1组分在香蕉组织中的分布和含量,建立以SYBR Green-I荧光染料为标记的实时荧光定量PCR(Real Time Fluorescence Quantitative PCR)方法。利用B1-F/B1-R引物扩增海南BBTV DNA1组分并构建到pMD18T sample载体,再以B2-F/B2-R引物测定该质粒的标准曲线,其线性方程为Y=-3.247×LOG(X)+8.01,相关系数r2=0.997,扩增效率为103.2%,标准质粒检测灵敏度约为214 copies/μL。分别选取染病香蕉的嫩叶、叶鞘、假茎和球茎各100 mg,提取DNA并进行实时荧光定量PCR检测。结果表明:病株各部位均含BBTV病毒,但含量有明显差异,其中嫩叶(3.08×108 copies/mg)叶鞘(2.50×108 copies/mg)假茎(1.29×108 copies/mg)球茎(1.67×107 copies/mg),呈依次递减。     

枯草芽孢杆菌Czk1与化学杀菌剂协同防治橡胶树根病

为探究枯草芽孢杆菌与化学杀菌剂协同防治橡胶树根病的可行性,为橡胶树根病的可持续防治提供依据。采用抑菌圈法和平板菌落计数法分别测定7种杀菌剂和枯草芽孢杆菌Czk1菌株对橡胶树红根病菌、褐根病菌的毒力以及杀菌剂与Czk1菌的生物相容性,并用Horsfall法确定复配方案。结果表明："根康"对橡胶树红根病菌和褐根病菌的EC₅₀分别为0.6253、0.0522 μg/mL,EC₅₀均最低且与Czk1菌有很好的生物相容性。"根康"（EC₅₀=0.6253 μg/mL）与Czk1(EC₅₀=6.46×10 ⁷ CFU/mL)混配,体积比V(Czk1)∶V("根康")=7∶3时,对红根病菌的增效比率值I_R值为1.60;"根康"（EC₅₀=0.0522 μg/mL）与生防菌Czk1（EC₅₀=2.33×10 ⁸ CFU/mL）混配,体积比V(Czk1)∶V("根康")=7∶3时,对褐根病菌I_R值为1.51。研究表明,"根康"可与Czk1联用协同防治橡胶树根病,菌药复配剂的防效明显优于单剂"根康"和单剂生防菌Czk1的防效,且混配剂中"根康"使用量只有单剂的1/3,大幅降低了化学药剂的使用量。     

茶尺蠖核型多角体病毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据茶尺蠖核型多角体病毒（Ectropis oblique nucleopolyhedrovirus, EoNPV）基因序列设计一对引物,并从感染该病毒的虫体中提取EoNPV基因组DNA,进行PCR扩增,将该基因片段与载体pMD18-T连接,转化入大肠杆菌TG1中,经单克隆菌落筛选及测序鉴定后得到重组质粒,以该质粒为荧光定量PCR标准品模板稀释后建立标准曲线。构建的标准曲线线性关系良好,相关系数为0.989,检测范围为10³~10⁸拷贝/µL,特异性和重复性较好。该方法可以准确地判断出病毒拷贝数,为茶尺蠖核型多角体病毒在虫体内增殖动态的研究和病毒制剂的质量检测提供了方法依据。     

柑橘黄龙病可视化LAMP检测技术的建立及应用

建立柑橘黄龙病(HLB)可视化环介导等温扩增(LAMP)检测方法,为HLB的快速检测提供有力的技术支持。根据LAMP技术原理,针对柑橘黄龙病菌16S rDNA靶序列的6个位点设计4条特异性引物,通过对反应体系和反应条件的优化,并在反应前的体系中加入1∶10的钙黄绿素(calcein)和氯化锰(MnCl2)混合液作为荧光显色剂,建立可视化LAMP检测技术,同时对该技术的特异性、灵敏度和样品检测进行了测试。该检测方法具有很高的特异性,反应体系中除了HLB具有特异性的扩增,产生黄绿色荧光扩增产物,其他供试菌株均无特异扩增。对柑橘黄龙病菌总DNA的检测限为1.51×10-3 ng/μL,而对含有目的基因的CG-pMD18-T质粒DNA的检测限为2.12×10-6 ng/μL,与定量PCR灵敏度相当,而比常规PCR灵敏度高1 000倍。利用可视化LAMP技术和定量PCR对来自漳州、南平、福州等地的样品进行检测,结果 2种技术的检出率均为76.7%,符合率达到100%。     

清热化痰合剂质量标准研究

目的建立清热化痰合剂质量标准。方法采用薄层鉴别法定性鉴别该制剂中黄芩和桑白皮，采用高效液相色谱法测定麻黄中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱含量。色谱柱：Hypersil BDS C₁₈(4.6 mm×200 mm,5μm)；流动相：乙腈-0.3%三乙胺0.02 mol·L^-1磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节至pH=3.0)(4∶96)；流速：0.8 mL·min^-1；柱温：25℃；检测波长：210 nm。结果黄芩和桑白皮的薄层图斑点清晰，分离度好且阴性对照无干扰。盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱分别在0.4706～2.353μg·mL^-1和0.1519～0.7595μg·mL^-1范围内，线性关系良好，精密度、重复性及48h稳定性RSD均小于2.0%，平均加样回收率分别为102.87%、100.25%,RSD分别为1.09%和1.35%。结论所建立的薄层鉴别法及高效色谱法稳定可靠、操作简单、结果准确，可以应用于该制剂的质量控制。     

一种基因编辑位点特异性PCR方法的开发和应用

为了对基因组编辑产品进行精准定性和定量检测，以水稻SP1 基因的编辑植株为材料，在编辑位点上下 游设计通用引物，在编辑位点处设计基因编辑位点特异性TaqMan探针，建立了编辑位点特异性PCR方法。利用该 方法可准确鉴定特异基因组编辑产品，检测灵敏度达到5~10拷贝，可在实时荧光PCR（qPCR）和微滴数字PCR （ddPCR）平台上对基因组编辑产品进行定量检测。由于数字PCR的微反应单元可消除野生型DNA对通用引物的 竞争性消耗，与qPCR的定量结果相比，ddPCR定量结果具有更高的定量准确性。     

剑麻酵母双杂交cDNA表达文库的构建及与AhKNOX2相互作用蛋白的筛选

植物KNOX（Knotted1-like homeobox）可通过蛋白质相互作用参与调控落果、纤维细胞发育、次生细胞壁发育、开花等事件。为筛选剑麻叶中与AhKNOX2相互作用的蛋白,采用SMART同源重组技术构建剑麻叶片酵母双杂交表达文库,利用AhKNOX2为诱饵筛选与之相互作用的蛋白。结果表明：文库总容量为3.9×10⁶ CFU,转化效率为9.15×10⁵ CFU/μg pGADT7-Rec,插入片段大小主要分布于0.5~3.0 kb之间,重组率为92%,保存的文库细胞密度为1.35×10⁸/mL,文库滴度为2.22×10⁷CFU/mL。构建的pGBKT7-AhKNOX2诱饵载体存在自激活性,5 mmol/L的3-氨基- 1,2,4-三唑（3-Amino-1,2,4-triazole,3-AT）能抑制诱饵载体的自激活,通过筛选获得了16个与AhKNOX2相互作用的蛋白。本研究成功构建剑麻叶片酵母表达文库,并筛选获得与AhKNOX2相互作用的蛋白,该结果为进一步研究AhKNOX2在剑麻中的功能奠定前期基础,为培育高纤维产量的剑麻新品种提供基因资源和理论基础。     

一种黑茶不同提取物中氟生物有效性研究

以Caco-2细胞为模型,对比分析了一种黑茶不同提取物中氟的吸收转运及生物有效性。结果表明,黑茶不同提取物组分中氟含量差异明显,粗茶多糖组分（RTP）氟含量最高,是水提取物（TE）氟含量的2.17倍,RTP经水透析后得到的透析多糖（DTP）氟含量则显著降低,仅为RTP氟含量的1/22,TE氟含量的1/10。来自3种茶提取物中的氟以及氟化钠（NaF）中的氟在Caco-2细胞模型中的正向和逆向转运都有时间和浓度剂量效应,随着时间的延长、浓度升高而显著增加;处理1 h后,NaF处理组细胞对氟正向和逆向转运量最高,DTP中氟的正向和逆向转运量最低,与其他各处理达到显著水平,TE和RTP处理间差异不明显。表观渗透系数（P_app）随处理时间延长呈下降趋势,其中,NaF中的氟的P_app在4 h各阶段都大于1×10^-5 cm·s^-1,说明其生物有效性良好,易于吸收;TE和RTP氟处理2 h后,P_app下降至小于1×10^-5 cm·s^-1,说明其生物有效性中等;DTP氟处理各阶段P_app都最小,在处理1 h后下降至小于1×10^-5 cm·s^-1,提示其吸收性最弱,生物有效性最差。NaF、TE以及DTP中的氟在所试浓度范围内,是以被动扩散为主,而RTP氟在较高浓度存在主动转运形式。由此可见,在小肠吸收模型中,黑茶提取物中的氟较NaF中的氟生物利用度低,而茶叶中氟的结合形式影响其生物有效性。