二步发酵法在西番莲果皮酵素加工中的应用

以西番莲果皮为对象,研究酿酒酵母菌、乳酸菌二步发酵工艺,制备乳酸菌和酿酒酵母菌活菌数高、多酚保留好、风味醇和的果皮浆。通过单因素和正交优化实验,以酿酒酵母菌和乳酸菌活菌数、总酚、乙醇生成量为指标,分别优选了单一乳酸菌和酿酒酵母菌发酵的工艺参数,在此基础上,通过测定总酸含量、活菌数、总酚含量等指标的变化,确定二步法发酵西番莲果皮浆的工艺参数为：发酵总时间40 h,酿酒酵母菌初始接种量1.5%,在29 ℃下发酵16 h后,再接入2.0%复合乳杆菌（干酪乳杆菌∶植物乳杆菌=1∶1）,在37 ℃下继续发酵24 h至终点。制备的西番莲果皮发酵液中,复合乳杆菌活菌数为8.93 lg CFU/mL,酿酒酵母菌活菌数为7.78 lg CFU/mL,总酚含量为24.00 μg/mL,总酸含量为4.40 mg/mL。二步发酵法发挥了酿酒酵母菌产香、产乙醇抑制杂菌,以及乳酸菌提高酸度、保留多酚物质的优点。     

防治棉花黄萎病的最优菌/药组合筛选

为了获得对棉花黄萎病有较好防效的菌/药合剂,采用单因素试验对6种杀菌剂、3种植物诱抗剂和3株生防菌发酵液进行了筛选;并利用筛选获得的最佳药剂和菌株及其质量浓度进行复配,筛选出最佳菌药合剂配方。结果表明:单因素中46%咪鲜·几丁糖EW 4000倍液、68%噁霉灵·福美双WP 1000倍液和80%乙蒜素EC 800的防效分别为61.17%、45.66%和76.36%;壳寡糖50μg·mL~(-1)、茉莉酸甲酯10μg·mL~(-1)和水杨酸50μg·mL~(-1)的防效分别为36.61%、32.51%、31.51%;S37 3.3×10~5mL~(-1)、S713.3×10~5mL~(-1)、S44 1.65×10~5mL~(-1)的防效为27.05%、52.34%、59.15%。复配后46%咪鲜·几丁糖EW 4000倍液+壳寡糖50μg·mL~(-1)+S71 3.3×10~5mL~(-1)防效达到70.45%;46%咪鲜·丁糖EW 4000倍液+茉莉酸甲酯10μg·mL~(-1)+S37 3.3×10~5mL~(-1)防效达到73.86%。所筛选出的菌/药合剂最优组合可为棉花黄萎病的防治提供参考。     

水稻细菌性谷枯病菌的实时荧光PCR检测技术研究

 水稻细菌性谷枯病菌Burkholderia glumae于2007年被列为我国进境植物检疫性有害生物,国内急需建立针对该菌切实可行的检测技术, 以有效控制它在我国的传播。采用实时荧光PCR（real time fluorescence PCR）和经典PCR技术进行水稻细菌性谷枯病菌检测。研究结果表明,供试所有谷枯病菌都能产生139 bp左右的特异性片段,非谷枯菌株均无特异性片段产生。两种检测方法的灵敏度比较发现,常规PCR技术在病菌浓度为104CFU/mL时即可检测到,实时荧光PCR技术在病菌浓度为102CFU/mL时即可检测到,后者比前者的灵敏度高100倍。将模拟带菌种子与灭菌种子按1∶100混合,实时荧光PCR技术可以检测到该菌的存在。     

荧光定量PCR技术在植物病原检测方面的应用

就实时荧光定量PCR的原理、应用和不足及前景等方面进行了论述。实时荧光定量PCR技术以其快速、灵敏、准确和高通量等特点受到了人们越来越多的重视,被广泛的应用于生物学研究的各个领域。近年来在植物病原检测方面,已建立了一大批植物病原的实时荧光定量PCR方法,这为植物病害的准确诊断与防控提供了强有力的工具。     

一种基因编辑位点特异性PCR方法的开发和应用

为了对基因组编辑产品进行精准定性和定量检测，以水稻SP1 基因的编辑植株为材料，在编辑位点上下 游设计通用引物，在编辑位点处设计基因编辑位点特异性TaqMan探针，建立了编辑位点特异性PCR方法。利用该 方法可准确鉴定特异基因组编辑产品，检测灵敏度达到5~10拷贝，可在实时荧光PCR（qPCR）和微滴数字PCR （ddPCR）平台上对基因组编辑产品进行定量检测。由于数字PCR的微反应单元可消除野生型DNA对通用引物的 竞争性消耗，与qPCR的定量结果相比，ddPCR定量结果具有更高的定量准确性。     

柑橘黄龙病可视化LAMP检测技术的建立及应用

建立柑橘黄龙病(HLB)可视化环介导等温扩增(LAMP)检测方法,为HLB的快速检测提供有力的技术支持。根据LAMP技术原理,针对柑橘黄龙病菌16S rDNA靶序列的6个位点设计4条特异性引物,通过对反应体系和反应条件的优化,并在反应前的体系中加入1∶10的钙黄绿素(calcein)和氯化锰(MnCl2)混合液作为荧光显色剂,建立可视化LAMP检测技术,同时对该技术的特异性、灵敏度和样品检测进行了测试。该检测方法具有很高的特异性,反应体系中除了HLB具有特异性的扩增,产生黄绿色荧光扩增产物,其他供试菌株均无特异扩增。对柑橘黄龙病菌总DNA的检测限为1.51×10-3 ng/μL,而对含有目的基因的CG-pMD18-T质粒DNA的检测限为2.12×10-6 ng/μL,与定量PCR灵敏度相当,而比常规PCR灵敏度高1 000倍。利用可视化LAMP技术和定量PCR对来自漳州、南平、福州等地的样品进行检测,结果 2种技术的检出率均为76.7%,符合率达到100%。     

芭蕉植株上乳酸菌的分离鉴定及抑菌菌株的初步筛选

为分析芭蕉植株(Musa basjoo Siebold)上附着的微生物菌群,并从中分离选育乳酸菌菌株,扩大植物源乳酸菌菌种库,为今后的青贮饲料发酵业和食品发酵工业等提供植物源乳酸菌,运用菌落计数法对样品中的乳酸菌、好氧细菌、霉菌、酵母、芽孢杆菌等进行菌落计数;分离纯化疑似乳酸菌的菌株,对疑似乳酸菌菌株进行生理生化试验、生长速率测定试验和产酸速率测定试验,以此来鉴定其生理生化特性以及属的分类;利用其发酵产物对大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)和沙门氏菌(salmonella)和单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)进行抑菌试验。结果显示:样品中均含有好氧细菌(6.5~8.0 log cfu/g FM)、霉菌(6.0~7.7 log cfu/g FM)、酵母(2.0~3.3 log cfu/g FM)、芽孢杆菌(2.0~4.4 log cfu/g FM)及乳酸菌(6.5~7.5 log cfu/g FM);在芭蕉植株上共筛选出34株疑似乳酸菌菌株,对其进行生理生化鉴定,试验菌株均符合乳酸菌的生理生化特性,其中有4株菌株抑菌效果较好,经鉴定均为植物乳杆菌。     

实时荧光定量PCR检测转基因玉米MON863的测量不确定度分析

应用四川省农业科学院分析测试中心实验室建立的转基因玉米MON863品系特异实时定量PCR方法,测定含量为1%的转基因玉米MON863样品(CRM)中旁侧片段(品系特异片段)的含量,并从扩增反应、数据处理以及微量移液器等不确定度来源评定测量的不确定度。结果表明,uA=1.9×10-2,uB=9.3×10-4,uC=1.9×10-2,U95=0.04,测量结果为1.108%±0.04。MON863品系特异实时定量PCR方法检测结果的主要不确定度来自检验过程中的随机效应。     

应用多重SYBR Green-I实时荧光定量PCR检测甘蔗黄叶病毒和高粱花叶病毒

基于已报道的甘蔗黄叶病毒(Sugarcane Yellow Leaf Virus,ScYLV)cp基因和高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)NSP基因序列设计特异性引物,建立了针对这两种病毒的实时荧光定量 PCR(real time-quantitative,RT-qPCR）检测方法。在此基础上,利用扩增产物Tm值的不同,建立了可区分ScYLV与SrMV的多重 SYBR Green-I实时荧光定量PCR方法,两种病毒扩增产物的Tm值分别为80.8～82.8℃和84.6～86.     

应用实时荧光定量PCR研究BBTV DNA1在香蕉不同组织中的含量

为准确定量香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)DNA1组分在香蕉组织中的分布和含量,建立以SYBR Green-I荧光染料为标记的实时荧光定量PCR(Real Time Fluorescence Quantitative PCR)方法。利用B1-F/B1-R引物扩增海南BBTV DNA1组分并构建到pMD18T sample载体,再以B2-F/B2-R引物测定该质粒的标准曲线,其线性方程为Y=-3.247×LOG(X)+8.01,相关系数r2=0.997,扩增效率为103.2%,标准质粒检测灵敏度约为214 copies/μL。分别选取染病香蕉的嫩叶、叶鞘、假茎和球茎各100 mg,提取DNA并进行实时荧光定量PCR检测。结果表明:病株各部位均含BBTV病毒,但含量有明显差异,其中嫩叶(3.08×108 copies/mg)叶鞘(2.50×108 copies/mg)假茎(1.29×108 copies/mg)球茎(1.67×107 copies/mg),呈依次递减。     

β-伴大豆球蛋白α'亚基和β亚基基因双价RNAi表达载体抑制大豆抗原蛋白的表达

为幼龄动物提供优质的大豆饲料,同时有效抑制α'亚基和β亚基基因表达量,根据dsRNAi原理,以α'亚基基因RNAi重组植物表达载体p CAMBIA3301-PFNZ-BADH为基础,构建以BADH安全标记为筛选标记的α'亚基和β亚基基因双价RNAi植物表达载体。用根癌农杆菌介导法转化大豆子叶节,并对再生植株进行分子生物学检测。结果表明:成功构建β-伴大豆球蛋白α'亚基和β亚基基因双价RNAi表达载体,并获得大豆转基因植株。T1转基因大豆植株经PCR检测得到11株阳性转化株,经Southern杂交检测证明构建的双价植物表达载体已经以1~2个拷贝整合到大豆基因组中,实时荧光定量PCR检测表明β-伴大豆球蛋白α'亚基和β亚基基因的表达被明显抑制。     

转基因大豆中外源基因g10evo-epsps的qPCR检测方法的建立和验证

耐除草剂基因g10evo-epsps在我国转基因农作物研发中常常被用作目标性状基因或筛选标记基因,因此可作为转基因成分检测的重要筛查基因,但目前缺少相应的检测方法.本研究旨在建立g10evo-epsps基因特异性的实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,从而为转基因大豆的监测提供一种稳定可靠的方法体系.本研究基于转基因...     

土壤磷素高效利用转基因大豆特异性PCR检测方法

华南农业大学根系生物学研究中心采用拟南芥的紫色酸性磷酸酶基因AtPAP15转化大豆品系粤春03－3（YC03-3）,获得了酸性磷酸酶活性明显提高、可高效利用土壤磷素的转基因大豆新品系AP15-1。以AP15-1为研究对象,应用TAIL－PCR技术,根据载体序列设计特异引物,获得了转化载体左侧插入的旁邻序列。设计事件特异性检测引物,进行PCR扩增,只能在AP15-1的样品中扩增出特异性条带,进一步用实时荧光定量PCR作分析,结果显示,该引物对重复性好,融解曲线显示只有一个特异峰值。本实验应用该引物对建立的检测方法,检测的灵敏度可以达到0.01%,实时荧光定量PCR检测的极限值可以达到9个基因组的拷贝数,能够满足对转基因大豆新品系AP15-1及其衍生品种检测的需要。     

TaqMan-MGB荧光定量IC/TC-RT-PCR检测菜豆荚斑驳病毒

菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)是我国重要的检疫性有害生物,BPMV传入的风险随大豆进境数量增多而加大。本文针对菜豆荚斑驳病毒,以大豆种子提取液为材料,分别建立了TaqMan-MGB荧光定量IC-RTPCR和TaqMan-MGB荧光定量TC-RT-PCR快速检测方法。根据GenBank公布的BPMV外壳蛋白基因序列,选择其保守区域,设计1对特异性引物和1条TaqMan-MGB探针,测定了TaqMan-MGB荧光定量IC-RT-PCR和TaqMan-MGB荧光定量TC-RT-PCR方法的特异性和灵敏度,并将TaqMan-MGB荧光定量IC-RT-PCR、TaqMan-MGB荧光定量TC-RTPCR、IC-RT-PCR和TC-RT-PCR 4种检测方法的灵敏度进行比较。结果表明:所建立的两种检测方法特异性良好;TCRT-PCR的灵敏度为10-1倍病毒提取液原液;IC-RT-PCR和TaqMan-MGB荧光定量TC-RT-PCR灵敏度相当,为10-3倍病毒提取液原液;TaqMan-MGB荧光定量IC-RT-PCR灵敏度最高,为10-5倍病毒提取液原液,是IC-RT-PCR和TaqMan-MGB荧光定量TC-RT-PCR检测方法的102倍,是TC-RT-PCR检测方法的104倍;两种检测方法均能较好应用于实际大豆样品的检测。本文所建立的TaqMan-MGB荧光定量IC/TC-RT-PCR检测方法利用抗原特异性或试管非特异性捕捉病毒粒子,无需提取RNA,为进境大豆种子上BPMV的检测提供了稳定、快速、简便的技术依据,其较高的灵敏度和特异性具有较好的应用价值。     

转基因植物及其产品PCR检测引物的筛选研究

建立了一种转基因植物及其产品PCR检测引物筛选方法。以转基因大豆Roundup Ready为材料,设计了5对引物,通过荧光定量PCR方法对其扩增产物的Ct值、引物与模板的结合效率、PCR产物的溶解曲线方面进行分析,证明RRS2引物对是转基因大豆Roundup Ready最佳品系特异性检测引物。     

甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测体系研究

甘蔗黄叶综合症(yellow leaf syndrome,YLS后称甘蔗黄叶病)是由甘蔗黄叶病毒(sugarcane yellow leaf virus,ScYLV)引起的一种重要的甘蔗病害,为更快、更准确地检测ScYLV,合成了一对特异性引物s-pf和s-pr,建立了运用SYBR Green I荧光染料法检测ScYLV的实时荧光RT-PCR体系,并对该体系的特异性、灵敏性和适用性进行了测试。结果表明:该检测体系能特异地检出ScYLV,对测试的高粱花叶病毒不能检出,灵敏度比常规PCR高100倍,适用性广。实时荧光RT-PCR检测整个过程完全闭管,无需PCR后处理且SYBR Green I荧光染料成本较低,适用于检测甘蔗体内含量较低的ScYLV病毒。     

香蕉果酒接种发酵和自然发酵过程中乳酸菌菌落变化及有机酸代谢特征

香蕉营养丰富、活性物质含量高，可作为深加工产品的优质原料。香蕉果酒是香蕉精深加工产品中的重要一类。由于香蕉果浆碳水化合物含量较高、酸度低、糖分高，其酿造过程中适宜各种微生物的生长繁殖，特别是乳酸菌数量的变化与酸类物质的产生密切相关。乳酸菌群落的变化容易增加发酵过程的风险，造成香蕉酒挥发酸含量超标、品质低下等不良结果。因此明确香蕉果酒发酵过程中自然存在的乳酸菌的生长繁殖规律及其对有机酸代谢的影响，可为精准调控发酵过程、提高产品质量提供理论依据。试验设置商业酵母Lalvin K1^TM接种发酵过程（K1）与香蕉果汁自然发酵过程（SF）2组对比，采用实时定量PCR方法和高效液相色谱法对香蕉汁接种发酵（K1）与自然发酵过程（SF）中酵母菌、乳酸菌的生长规律以及有机酸的含量变化进行监测。结果表明：2种发酵处理下，酵母菌和乳酸菌的生长规律有差异；K1酵母菌主导的发酵过程中，乳酸菌的生长受到显著抑制，最大生长量仅为4.0×10⁶ CFU/mL，而酵母菌生物量为1.2×10⁷ CFU/mL；在自然发酵过程中，乳酸菌与酵母菌的生长周期完全错开，但对乳酸菌的生物量无显著影响，乳酸菌与酵母菌的生长量分别达到1.0×10⁷ CFU/mL和1.6×10⁷ CFU/mL。2种发酵过程均表明，酵母菌和乳酸菌的生长存在竞争与抑制关系；有机酸代谢主要与乳酸菌菌落数量相关，不同有机酸的总体变化趋势一致；在发酵过程中，乳酸含量逐渐增加，乙酸含量呈先增后降的趋势，二者在自然发酵样品中的累积量均高于接种发酵；柠檬酸、苹果酸、酒石酸含量整体呈下降趋势。     

进口大豆中菜豆晕疫病菌巢式PCR检测方法的建立

为实现对进口大豆样品中菜豆晕疫病菌的快速检测,本研究根据菜豆晕疫病菌的argK特异性序列设计引物52B/8F和24B/24F,建立了巢式PCR检测方法,并进行特异性和灵敏度验证。试验结果表明,利用此检测方法对多种参试菌株进行检测时,只有菜豆晕疫病菌呈阳性反应,而其他病菌不产生扩增反应;巢式PCR检测方法对菜豆晕疫病菌基因组DNA和菌悬液检测时,其灵敏度分别达到0.916×10-4ng/μL和2.4×103CFU/m L,比常规PCR灵敏度高1 000倍。在对100份进口大豆样品检测时,3份样品扩增到了特异性条带,测序分析结果证明3份大豆样品中携带的病菌确实为菜豆晕疫病菌。本研究所建立的巢式PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、检测时间短并且检测准确率高等特点,可用于口岸菜豆晕疫病菌的检测。     

大豆GmGolS基因高温胁迫应答及启动子活性分析

肌醇半乳糖苷合成酶(GolS)是棉子糖系列寡糖(RFOs)生物合成途径中的关键酶。为探究大豆GmGolS基因的高温胁迫调控机制,通过实时荧光定量PCR检测GmGolS在高温胁迫下的表达量,通过PCR从大豆基因组DNA中扩增GmGolS基因启动子序列,将其连接到植物表达载体pCAMBIA1301上并转化烟草,通过GUS组织化学染色和实时荧光定量PCR检测GmGolS启动子的高温诱导启动活性。结果表明：高温胁迫可以强烈诱导GmGolS的表达。1 739 bp的GmGolS启动子序列中含1个生长素响应元件、1个干旱诱导的MYB转录因子结合位点、2个厌氧诱导元件、1个防御和胁迫响应元件、1个脱落酸响应元件、1个茉莉酸响应元件和1个缺氧诱导元件。成功获得3棵GmGolSP转基因烟草植株。GmGolS启动子的活性可以被高温胁迫诱导。     

柑橘溃疡病菌LAMP实时浊度检测方法的建立及应用

以柑橘溃疡病菌特异性高的假定蛋白基因（登录号：AE008923.1）为靶标，设计并筛选4条引物来特异性识别靶标序列中的6个独立区域，建立柑橘溃疡病菌LAMP实时浊度检测方法。该方法利用实时浊度仪检测反应过程中产生的焦磷酸镁白色沉淀，实现对LAMP整个反应过程的实时监控。从镁离子浓度、甜菜碱浓度、dNTPs浓度、引物浓度和反应温度5个变量参数对 LAMP检测体系进行优化，并对方法的特异性、灵敏度、稳定性及实际样品检测效果进行评价。结果显示，该体系经优化后稳定性良好，可在66 ℃ 恒温条件下，60 min内完成检测；DNA检测下限可达0.02 ng/μL，灵敏度与荧光定量PCR方法相同，比常规PCR方法高1个数量级；能快速、准确地对田间疑似样品进行检测，与荧光定量PCR方法的检出情况一致，没有漏检。结果说明柑橘溃疡病菌实时浊度LAMP检测方法操作简便、所需时间短，特异性与灵敏度高，为柑橘溃疡病菌的快速筛查提供较好的途径。