大豆GmMP基因的功能预测及表达分析

通过在大豆基因组数据库中检索拟南芥AtMP(ARF5)在大豆中的同源基因,获得了GmMP基因序列。对GmMP基因编码的氨基酸序列及启动子序列进行生物信息学分析,结果表明:GmMP基因CDS序列全长2 802 bp,编码933个氨基酸。GmMP编码的蛋白为疏水性蛋白。结构域分析表明:GmMP含有B3和AUXIN RESPONSE FACTOR结构域,同时该基因是ARF家族的成员。GmMP预测的启动子区域含有与激素、胁迫、光应答、生物钟调控和转录因子结合相关的顺式作用元件。系统进化分析表明MP在豆科植物进化过程中比较保守。组织特异性表达分析结果显示GmMP在叶片中表达量最低,在茎尖中表达量最高,推测其可能参与生长素的代谢途径。     

大豆RNA依赖的RNA聚合酶基因GmRDR1的克隆与表达特性分析

为了寻找大豆抗病新基因,培育大豆新型抗性品种,利用同源克隆的方法从大豆品种科丰1号中分离出1个新的GmRDR1基因,并对其进行序列分析,组织表达、抗逆境胁迫表达分析及该基因的亚细胞定位研究。结果表明:GmRDR1基因位于大豆基因组的第2号染色体,基因全长为3 956 bp,其中ORF为3 378 bp,编码1 125个氨基酸,相对分子量和等电点分别为279.72×103和4.63;GmRDR1含有RDRs家族的保守序列"DLDGD";该基因在所有被检测组织中均表达,并且在叶中的表达量最高;荧光定量结果发现:在大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)处理下,GmRDR1在抗病材料科丰1号中的表达量显著高于感病材料南农1138-2。盐及干旱胁迫下,48 h之内,该基因的表达量明显升高,SA诱导条件下该基因在6 h出现了早期响应,冷害处理下24 h表达量出现了突然的升高。GmRDR1基因的亚细胞定位结果表明:该基因所编码的蛋白定位在细胞核里。根据以上结果判定GmRDR1基因参与了大豆对SMV的抗性反应,并且能够强烈响应盐和干旱的胁迫,因此该基因在大豆抗逆分子育种中具有较好的应用价值。     

大豆耐胁迫相关蛋白编码基因GmSAMDC1的克隆及表达分析

S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosine methionine decarboxylase,SAMDC)是亚精胺和精胺合成的关键酶,更是多胺生物合成的限速酶之一,在植物耐胁迫反应中发挥重要调控作用。为研究大豆SAMDC编码基因的结构和表达特性,本研究从抗病大豆品种科丰1号中克隆了位于大豆基因组2号染色体上的GmSAMDC1(Glyma. 02G128000)基因,分析结果表明:其完整ORF长度为1 068 bp,编码一个由355个氨基酸组成的包含1个SAM_decarbox结构域的蛋白; GmSAMDC1基因所编码蛋白的理论等电点为4. 86,相对分子质量为38 987. 13 Da,为亲水性蛋白,不含跨膜区;大豆中共有8个GmSAMDC1的同源基因,GmSAMDC1与红车轴草(PNY09439. 1,82. 64%)和拟南芥(At SAMDC3,67. 22%)中的SAMDC蛋白编码基因亲缘关系最近; GmSAMDC1启动子序列包含防卫和胁迫响应元件、植物激素应答元件、光应答元件等许多顺式作用元件; GmSAMDC1在花中的表达量最高,与其大豆同源基因Glyma. 01G071300(序列相似性为94. 6%)、Glyma. 18G278800(66. 8%)和Glyma. 08G25580(66. 5%)的组织特异性表达模式比较相似; Glyma. 02G128000-GFP融合蛋白在细胞膜和细胞质上表达。本研究结果为进一步阐明大豆GmSAMDC1基因在大豆耐胁迫过程中的作用提供了理论依据。     

大豆Glyma.05G222700.2基因生物信息学与逆境表达分析

为研究Glyma.05G222700.2基因编码的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在抗非生物胁迫过程的功能和原理,促进大豆抗逆候选基因的开发利用,本研究通过生物信息学方法对大豆Glyma.05G222700.2基因进行同源序列、蛋白结构、进化树和转录组分析,通过qRT-PCR分析盐胁迫下大豆不同组织中该基因的表达情况。结果表明:该基因编码区长2 040 bp,编码697个氨基酸,预测分子量为656.54 kD,pI8.026。多序列比对发现Glyma.05G222700.2蛋白包含1个Pkinase结构域。进化树分析表明该蛋白与野大豆、刺毛黧豆、赤豆一致性较高。转录组数据表明Glyma.05G222700.2基因在大豆各组织中均有表达,其中在种子中表达量最高,在根中表达量最低。qRT-PCR结果发现Glyma.05G222700.2基因在毛状根、茎、叶中均有表达,在茎中表达量最高,在叶中表达量最低;在毛状根中盐胁迫12 h表达量达到极值,盐胁迫24 h表达量下降;在茎中表达量呈上升趋势,在24 h表达量达到极值;在叶中表达量不稳定,盐胁迫2 h该基因不表达,盐胁迫6 h该基因表达量达到极值并高于对照,盐胁迫12和24 h表达量低于对照。推断该基因可能在大豆抵抗盐胁迫过程中起到重要作用。     

大豆脂质转运蛋白基因GmLTP3的特征分析

将芝麻的SiLTP3序列与大豆的核苷酸序列进行blast比对,发现大豆含有与芝麻该基因同源性高达94%的序列,克隆该基因并命名为GmLTP3。通过GmLTP3的核苷酸序列推测出其氨基酸序列,利用软件进行多重序列比对和系统发育树构建,发现该氨基酸序列与已确定功能的大豆脂质转运蛋白同源性高达99%,与蒺藜苜蓿和巴旦杏的进化距离最近。采用实时荧光定量PCR法对GmLTP3基因进行定量检测,组织表达分析表明,GmLTP3属于组成性表达基因,在大豆的根、茎、叶、花、萌发的种子中均有表达,并且在花蕾、茎和萌发的种子中表达量较高,在根、叶中表达量较低。非生物胁迫诱导表达分析表明,GmLTP3基因能够对IAA、ABA、PEG、NaCl和冷害作出应答。胁迫处理2 h后,GmLTP3表达量均有下调趋势;胁迫处理12 h后,IAA、ABA、PEG、NaCl诱导GmLTP3的表达量均有不同程度的上调,冷害处理则继续下调表达量。     

大豆Usp1基因的克隆和表达分析

在对大豆根系盐胁迫抑制差减杂交文库EST序列分析的基础上,利用RT-PCR技术克隆得到了一个大豆Us-pA基因,命名为GmUsp1,其编码一个包含164个氨基酸残基的多肽链。多序列比对和编码蛋白结构分析表明,GmUsp1属于泛应激蛋白(Universal Stress Protein)家族成员之一。其氨基酸序列与蚕豆Vf_enod18序列相似度最高,属于MJ-0577类中含有ATP结合位点的UspA亚族,与MJ-0577有相似的蛋白二级结构。分别采用250 mmol.L-1NaCl、100μmol.L-1ABA和30%PEG 6000进行胁迫处理,耐盐品种文丰7号和盐敏感品种Union的GmUsp1均被诱导表达,二者对胁迫诱导响应时间和表达量存在差异,说明GmUsp1可能参与大豆对非生物逆境胁迫的应答调控。     

8个大豆Dof转录因子的生物信息学分析及干旱诱导表达

为探究大豆Dof转录因子的功能,本研究对大豆中8个Dof转录因子的基因序列进行生物信息学分析,通过实时荧光定量PCR检测编码基因在干旱胁迫下的表达,并分析主要应答基因的启动子序列中的顺式作用元件。研究结果显示:8个Dof转录因子编码基因分别位于大豆5、8、11、13、15和16号染色体上,编码蛋白序列的氨基酸残基为213～403个,等电点为6.61～9.36,主要定位于细胞核中。GmDof2与番茄SlDof5.4具有较近的亲缘关系,GmDof1、GmDof8、GmDof3和GmDof5之间具有较近的亲缘关系,GmDof7与黄瓜CsDof1.4具有较近的亲缘关系,而GmDof4和GmDof6具有较近的亲缘关系。GmDof1和GmDof3的表达量在干旱胁迫下上升幅度最明显,启动子序列中均含有多种逆境相关的顺式作用元件。研究结果证明大豆Dof转录因子具有在植物抗旱基因工程中的应用前景。     

大豆GmPHD3基因的克隆及逆境表达分析

为探讨大豆PHD-finger转录因子家族编码基因GmPHD3在抵抗中国南方高温高湿非生物胁迫造成种子劣变过程中的调控作用,分离全长GmPHD3基因并进行生物信息学分析、亚细胞定位和转录激活活性分析,以种子劣变抗性品种湘豆3号和不抗品种宁镇1号叶片及不同组织cDNA为材料,通过RT-PCR,进行组织表达模式分析和高温高湿胁迫下的表达模式分析。生物信息学分析结果表明基因CDS序列长度为738 bp,编码246个氨基酸,包含Alfin和PHD-finger 2个结构域。进化树结果表明该基因与木豆ALFIN-Like 3-like(XM_020363358.1)的遗传距离较近。亚细胞定位结果显示该蛋白在细胞核内表达。转录激活试验结果表明基因全长有转录激活活性,激活域为N端Alfin结构域,C端PHD-finger结构域无转录激活活性。组织表达模式分析发现该基因主要在成熟期高表达,且2个品种间存在差异。胁迫下的表达模式分析发现随着胁迫时间的延长,基因的表达量逐渐升高。研究结果为进一步阐明高温高湿胁迫下的调控机制研究奠定一定理论基础。     

大豆GmPR10基因启动子的克隆及序列分析

GmPR10基因是病程相关蛋白PR10(pathogenesis-related proteins 10)在大豆中的同源基因。为探明大豆GmPR10基因的表达调控规律,应用PCR技术从大豆抗疫霉根腐病品种绥农10号中克隆了GmPR10基因上游2 235 bp的启动子序列pGmPR10,定向替换pBI121载体的CaMV35S组成型启动子,构建植物表达载体pBI121/pGmPR10/GUS,并转化农杆菌侵染烟草叶盘。GUS染色结果表明,pGmPR10受聚乙二醇(PEG)、低温(4℃)、水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)和脱落酸(ABA)诱导表达,因此推测GmPR10基因可能参与植物激素调节植物生长发育的过程,以及生物胁迫和非生物胁迫条件下植物对环境响应的过程。此外,利用PLACE和Plant CARE在线启动子预测工具分析pGmPR10,结果表明:pGmPR10含有启动子的一般结构TATA-box和CAAT-box,光应答元件,生长素和细胞分裂素响应元件,热激元件,低温应答元件,干旱应答元件以及ABA、SA、JA应答元件等。     

巴西橡胶树中2个NADP-苹果酸酶基因的克隆和表达特性分析

从橡胶树中克隆2个NADP-ME(苹果酸酶)基因的全长cDNA,分别命名为HbNADP-ME1和HbNADP-ME2。HbNADP-ME1和HbNADP-ME2 cDNA全长分别为2 428、2 139 bp,分别编码643、593个氨基酸组成的蛋白,二者的氨基酸序列一致性高达87.25%,且分别与蓖麻和杨树的一个NADP-ME序列具有较高的序列一致性。2个HbNADP-ME蛋白都含有典型的植物NADP-ME蛋白的保守结构域,均富含亮氨酸(Leu),同属于非分泌型稳定蛋白。2个HbNADP-ME基因在橡胶树不同组织中的表达存在明显差异,在根中的表达量最高,种子和花中的表达量次之;另外,HbNADP-ME1基因在胶乳中受机械伤害有下调表达趋势,HbNADP-ME2基因在胶乳中受割胶处理也表现出下调表达趋势,而低温胁迫则显著诱导2个基因在叶片和根中的表达。结果说明,HbNADP-ME基因可能参与橡胶树的抗逆应答及代谢调控(包括胶乳代谢调控)。此结果为深入揭示橡胶树中NADP-ME基因的功能奠定了基础。     

大豆GmABCG40基因的功能预测及表达分析

通过在大豆基因组数据库中检索拟南芥At ABCG40在大豆中的同源基因,获得了Gm ABCG40基因序列。通过对Gm ABCG40基因编码的氨基酸序列及启动子序列进行生物信息学分析,结果表明:Gm ABCG40基因CDS序列全长4 284 bp,编码1 427个氨基酸。Gm ABCG40编码的蛋白为疏水性蛋白,具有多个N-糖基化位点、激酶磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点、2个ATP/GTP结合位点基序A和1个速激肽家族信号。结构域分析表明Gm ABCG40含有2个核苷酸结合域与2个跨膜结构域,形成NBD1-TMD1-NBD2-TMD2结构,属于ABCG亚家族的成员。Gm ABCG40预测的启动子区域含有与激素、胁迫、光应答、胚乳表达和转录因子结合相关的顺式作用元件。系统进化分析表明Gm ABCG40与菜豆、红豆、木豆、百脉根等豆科植物亲缘关系较近。组织特异性表达分析结果显示Gm DABCG40在叶片中表达量最低,在根中表达量最高,推测其可能参与根中ABA的转运过程。     

大豆GmAYI基因的克隆及初步功能预测

根据拟南芥At1G74730基因的保守序列设计引物,利用RT-PCR技术在大豆中克隆得到GmAYI基因。对GmAYI基因的结构域和启动子元件进行分析,结果表明:大豆GmAYI基因位于4号染色体上,含跨膜结构域,属于膜蛋白。该基因启动子区域含有激素相关应答元件和胚乳表达所必须的顺式作用元件。推测该基因可能参与调控大豆生长发育及外界环境胁迫应答等过程。进而对14个大豆品种中GmAYI基因的转录水平进行了定量分析,对GmAYI基因在14个大豆品种中的转录水平与单株粒数、单株粒重、百粒重、株高等产量相关性状进行相关性分析,结果表明:GmAYI基因的表达量与百粒重呈显著负相关,推测GmAYI可能是参与大豆产量相关性状调控的基因。     

甘蔗二氨基庚二酸异构酶基因的克隆与表达分析

以水稻ABA99594序列为探针, 使用电子克隆技术, 获得甘蔗二氨基庚二酸异构酶基因（Diaminopimelate epimerase, DAPE）的1条cDNA全长序列,命名为ScDAPE。经RT-PCR扩增和序列分析验证后, 该基因序列与电子克隆结果一致, 基因全长1 168 bp, 包含1个816 bp的开放阅读框, 编码271个氨基酸残基, 生物信息学分析预测该基因编码蛋白定位于内质网膜, 为可溶性酸性蛋白, 无信号肽, 二级结构元件多为无规卷曲, 含有2个保守功能域, 主要功能为氨基酸合成。电子表达分析结果显示, 该基因在甘蔗侧芽、 花序、 叶片和顶端分生组织中均有表达, 花序中的表达量最高, 且该基因的表达受温度调控。荧光定量PCR分析结果表明,该基因在甘蔗根、 蔗髓、 蔗皮、 侧芽、 叶片、 叶鞘中均有表达, 且在根中的表达量最高。此外, 该基因的表达受水杨酸（salicylic acid, SA）、 脱落酸（abscisic acid, ABA）、 茉莉酸甲酯（methyl jasmonate, MeJA）、 模拟干旱（PEG）、 高盐（NaCl）和氯化镉（cadmium chloride, CdCl2）的胁迫诱导, 其中受水杨酸胁迫后表达量最高, 约为对照组的12.4倍, 其次为聚乙二醇, 约为对照组的2.72倍, 推测该基因的表达与甘蔗抗病性和抗渗透胁迫有关。研究结果为甘蔗中不同DAPE基因的克隆和功能验证以及甘蔗ScDAPE基因在甘蔗基因工程中的应用奠定了一定的基础。     

茶树△12-脂肪酸去饱和酶基因FAD2和FAD6的克隆与表达分析

本研究在茶树转录组测序的基础上,以铁观音茶树的芽叶为材料,采用RT-PCR技术,克隆了茶树不饱和脂肪酸合成途径中的关键限速酶—△12-FAD(12-脂肪酸去饱和酶)基因的包含完整ORF的cDNA序列(CsFAD2和CsFAD6)。生物信息学分析结果表明,CsFAD2的全长为1 184 bp,其开放阅读框(ORF)长度1 149 bp,编码382个氨基酸,定位于内质网上,其氨基酸序列与油茶FAD2的同源性最高达97%;CsFAD6的全长为1 425 bp,其ORF长度为1 311 bp,编码436个氨基酸,定位于叶绿体上,其氨基酸序列与葡萄FAD6同源性达81%。荧光定量PCR结果表明,铁观音茶树幼苗在4℃低温胁迫处理72 h过程中,这两个基因的表达均受低温的诱导,其表达量随着处理时间的延长而升高,在处理48 h时,表达量水平最高;在100 g·L-1的PEG胁迫处理12 h过程中,这两个基因的表达均受PEG胁迫处理的诱导;在ABA(100μmol·L-1)胁迫处理72 h过程中,在处理6~24 h期间,CsFAD2的表达量显著升高,而CsFAD6的表达不受ABA处理的影响,CsFAD6的表达量在处理72 h时显著降低;在Na Cl(250 mmol·L-1)胁迫72 h过程中,CsFAD2的表达量全程降低,而CsFAD6在处理24~72 h期间表达量显著升高。     

青稞法尼基转移酶β亚基编码基因HbERA1的克隆及表达分析

ERA1(Enhanced response to ABA)基因编码法尼基转移酶(Farnesyl transferase)β亚基,该酶在干旱胁迫下对ABA信号负向调控因子的修饰起着关键作用。本研究以青稞(Hordeum vulgare subsp.vulgare)抗旱品种喜马拉雅10号为材料,利用RT-PCR技术克隆获得了ERA1基因全长cDNA序列,命名为HbERA1(登录号:KJ699392)。生物信息学分析表明,该基因全长1 401bp,可编码466个氨基酸序列,蛋白分子量为51.14kD,等电点为5.00。Prosite Scan分析结果表明,HbERA1含有多个干旱胁迫响应蛋白的作用位点,如酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点及N-豆蔻酰化位点。利用实时定量PCR方法研究了HbERA1在干旱胁迫条件下及复水后不同时间点的表达情况,发现在水分过剩处理下(土壤绝对含水量15.5%),HbERA1在土壤绝对含水量为33.4%时表达量最高,并随着土壤绝对含水量的下降而下调表达;进行干旱胁迫后(15.5%)基因表达量也明显下调表达;复水后表达逐渐恢复,复水8h时超过正常表达水平,表明HbERA1基因可能参与调控水涝和干旱胁迫双重信号传导。     

大豆GmGLP10基因的克隆及生物信息学分析

通过PCR的方法从大豆抗菌核病品种Maple Arrow中克隆得到Gm GLP10基因,生物信息学分析结果显示Gm GLP10蛋白由213个氨基酸组成,具有一个糖基化位点和多个磷酸化位点,为胞外分泌蛋白。通过对Gm GLP10基因起始密码子上游1 500 bp序列进行顺式作用元件分析,预测Gm GLP10启动子上具有多个与激素和防御胁迫应答相关的顺式作用元件。进化树分析结果表明,Gm GLP10与多个生长素结合蛋白进化距离较近,推断其可能具有相似的功能。Gm GLP10基因在菌核病菌胁迫下的转录本丰度的变化结果表明在菌核胁迫处理后Gm GLP10基因表达量上调明显。Gm GLP10可能作为生长素结合蛋白参与调控大豆的生长发育与抗病防御应答反应。     

青稞HvnWRKY26基因的克隆及表达分析

WRKY家族转录因子广泛参与植物的生物和非生物胁迫过程。为探索WRKY家族转录因子在青稞抗条纹病过程中的作用,本课题组前期利用条纹病菌分别侵染抗病青稞品种昆仑14号和感病品种Z1141,并进行转录组测序,发现一个在侵染时期差异表达的WRKY基因家族成员。序列分析发现,该基因的开放阅读框为765 bp,可编码255个氨基酸,具有典型的WRKY结构域,属于WRKY基因家族。Uniprot注释结果表明,该蛋白为HvnWRKY26。启动子区域预测表明,该区域含有脱落酸和茉莉酸响应元件以及与干旱、低温、盐胁迫和防御应激等逆境胁迫相关的顺式作用元件。序列比对分析显示,HvnWRKY26蛋白与其他物种中同源蛋白的氨基酸序列一致性均不高,但该蛋白与大麦HvWRKY26蛋白的WRKY结构域序列完全相同。系统进化分析表明,青稞HvnWRKY26与大麦WRKY26的亲缘关系最近;进一步对HvnWRKY26及与其亲缘关系较近的大麦、玉米、水稻WRKY蛋白进行进化分析,发现这些WRKY蛋白被分为A、B和C三大类,其中HvnWRKY26蛋白属于A类。RNA-seq和qRT-PCR分析结果表明,青稞在遭受条纹病菌侵染时,HvnWRKY26基因的相对表达量在抗病品种昆仑14号和感病品种Z1141中均显著上调表达,且抗病品种的表达量显著高于感病品种,推测HvnWRKY26基因在青稞抗条纹病过程中发挥重要作用。     

菜心 BclUBE2 基因的克隆与表达分析

采用同源克隆法从菜心中获得 cDNA 全长 459 bp 的 E2 基因,命名为 BclUBE2。该基因编码 153 个氨基酸,分子量为 17.24 ku,理论等电点为 5.37,为亲水性非分泌蛋白。结构分析显示,该蛋白含有一个泛素结合酶E2 活性位点、一个 WD 重复序列和一个高度保守的半胱氨酸。进化分析发现,菜心 BclUBE2 蛋白与芸薹属芜菁和油菜的亲缘关系较近。qRT-PCR 分析表明,菜心 BclUBE2 基因在根、茎、叶、叶柄中均有表达,且表达丰度和变化趋势不同。在低温胁迫下,根中的表达量呈现先降低后升高的变化趋势,且在处理 1 h 时表达量最低;在茎、叶、叶柄中均呈现先升高后降低的表达趋势,茎和叶柄处理 6 h 时的表达量最高,叶片处理 1 h 时的表达量最高。说明菜心 BclUBE2 基因在响应低温胁迫中发挥作用。     

大豆RING/U-box蛋白Glyma.13G115900的克隆及其对非生物胁迫的应答

课题组前期对干旱胁迫下大豆转录组的数据分析发现大豆Glyma.13G115900基因编码一个RING/U-box蛋白,其表达水平受干旱胁迫影响显著。本研究以垦丰16大豆为试验材料,克隆Glyma.13G115900基因。氨基酸多重序列比对表明其编码的蛋白与其它物种都具有高度保守的RING/U-box结构域。构建原核表达载体pET-29b-Glyma.13G115900转化到大肠杆菌中,Glyma.13G115900蛋白在大肠杆菌中能够表达。荧光定量PCR分析表明Glyma.13G115900基因的表达量受PEG、NaCl和ABA的影响显著,但基本不受冷胁迫的诱导。经PEG和NaCl处理后,该基因表达量与CK相比呈现出显著下降的趋势,PEG处理的表达量变化比NaCl下调的更明显;在ABA诱导下与CK相比该基因的mRNA丰度呈现出先上升后下降的趋势,在4 h表达量出现峰值,推测该基因可能通过依赖于ABA途径参与非生物胁迫应答。以上结果为进一步深入研究该基因的调控途径奠定基础。     

玉米抗病相关基因ZmEDS1的克隆及表达分析

从玉米中克隆ZmEDS1基因的cDNA序列,全长2 164 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)长1 860 bp,编码619个氨基酸。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白等电点为6.05,分子量为68.74 kDa,内部无信号肽结构,N端有一个酯酶结构域。系统进化树分析表明,玉米ZmEDS1蛋白和高粱EDS1L蛋白的亲缘关系最近,同源性高达94%。采用实时荧光定量PCR分析病毒侵染下该基因在感性材料郑58和抗性材料D863F中的表达模式,在两种材料中,ZmEDS1基因均在病毒侵染48 h的表达量最高,分别达到0 h对照组感、抗材料的1.56、3.47倍,在抗病材料D863F中的表达水平高于感病材料郑58。初步判断,ZmEDS1基因应答病毒的侵染过程,且在感病材料和抗病材料中的响应模式存在差异。