PCR检测炭疽杆菌的研究

以无毒炭疽芽孢苗(steme菌株)、Ⅱ号炭疽芽孢苗(pasteurⅡ菌株)、A16R菌苗(steme菌株)为试验茵，建立了检测炭疽芽孢杆菌质粒DNA的PCR方法。该方法特异性强，敏感性可达1131个菌／ml(无毒炭疽芽孢菌菌株)和1720个菌／ml(Ⅱ号炭疽芽孢菌菌株)。同时建立了可区分炭疽杆菌强、弱毒的多重PCR方法。     

贵州省一起皮肤炭疽疫情的病原学分析

为了对贵州省一起疑似皮肤炭疽疫情进行病原学检测和分析,以期为疫情的处置和防控提供科学依据,对患者皮肤渗出液、病死马肌肉及其刨剐地土壤样本进行炭疽芽孢杆菌分离培养,对疑似菌落采用革兰染色镜检、噬菌体裂解试验和青霉素抑制试验进行鉴定,进一步采用普通PCR和实时荧光定量PCR法(Real-time PCR)检测炭疽芽孢杆菌疑似菌株PagA、Cap及rpoB基因。结果共检出7株炭疽芽孢杆菌疑似菌株,其中从患者皮肤渗出液分离出1株菌,从土壤标本分离出6株菌。传统方法将7株疑似菌株鉴定为炭疽芽孢杆菌,普通PCR和Real-time PCR检测结果均显示7株菌株rpoB、PagA和Cap基因阳性。说明从患者皮肤渗出液和土壤标本均检出具有致病基因的炭疽芽孢杆菌,提示该起疫情为一起由炭疽芽孢杆菌所致的皮肤炭疽疫情。     

炭疽芽孢杆菌PCR鉴定方法的建立

根据炭疽芽孢杆菌3种特异性毒力基因的序列,包括保护性抗原基因(pag)、荚膜基因(cap)和S-层蛋白基因(sap),建立多重PCR鉴定方法。该方法检测11株炭疽芽孢杆菌均为阳性,检测29株非炭疽的其他需氧芽孢杆菌属菌株均为阴性。该方法检测模拟血液样品的灵敏度是2×10~6 CFU/mL(每1mL血液样品最低含有2×10~6细菌),而样品增菌后的检测灵敏度是2×10~2 CFU/mL。制备加入炭疽疫苗菌株芽孢的模拟土壤样品,经增菌培养后,PCR检测灵敏度为3×10~4芽孢/g。另外,还设计了炭疽芽孢外壁结构蛋白基因BclA的鉴定引物,利用该引物的PCR扩增片段长度以及测序结果,能够有效区分Ⅱ号炭疽疫苗菌株和临床分离菌株,本研究能够为炭疽临床诊断和环境监测工作提供技术支持。     

吉林省1起炭疽突发事件的病原菌分离和鉴定

从采集的羊肉和土壤样品中分离、鉴定炭疽芽孢杆菌,样品制备悬液,热处理杀死非芽孢的细菌,然后涂布PLET琼脂平板进行选择性增菌培养。疑似菌落首先使用炭疽特异性的引物进行PCR鉴定,然后进行噬菌体裂解和青霉素抑制试验的鉴定;鉴定非炭疽的菌落进行16SrDNA的测序分析。从可疑羊肉样品中成功分离、鉴定出炭疽芽孢杆菌,确定了本次突发事件的传染源。从屠宰地点采集的土壤样品中未检出炭疽芽孢杆菌,土壤中分离的疑似炭疽样菌落经16SrDNA测序和比对鉴定为蜡样芽孢杆菌等其他需氧芽孢杆菌属的细菌。     

Taqman-MGB探针法检测炭疽杆菌

根据GenBank中炭疽杆菌的主基因组上gyrA基因,毒力因子px01上pagA基因和侵袭因子px02上的CapA基因分别设计引物和对应Taqman-MGB探针,建立了检测炭疽杆菌的实时定量PCR方法。该方法具有良好特异性,仅对炭疽杆菌检测结果为阳性,而与蜡样芽孢杆菌、苏云金杆菌、巨大芽孢杆菌、沙门菌、大肠杆菌、链球菌、铜绿假单孢杆菌无交叉反应,检测灵敏度最低可达100copies/μL。对24份皮毛盲样和120份送检样品检测结果表明建立的定量PCR方法与商业化定量PCR试剂盒的符合率为100%。Taqman-MGB探针方法灵敏、特异、重复性好,可应用于炭疽杆菌的快速诊断与监测。     

快速检测炭疽杆菌的实时荧光定量PCR方法的建立及评价

为建立一种能快速鉴定炭疽杆菌的检测技术,本研究根据炭疽杆菌染色体上的TJHP和BA5345 2个靶点,分别设计4对引物和2个探针,对10份已知浓度的炭疽杆菌DNA和阴性对照菌株DNA进行检测,将浓度最大的炭疽杆菌DNA进行10倍倍比稀释,用于检测4对引物及其探针的灵敏度,并选出2个针对TJHP和BA5345靶点的特异性强及灵敏度高的引物和探针进行重复性实验。结果显示,4对引物及其探针特异性较强,FP2/RP2和FP4/RP4 2对引物的灵敏度为4.513×10^-5 ng/μL;该荧光定量PCR方法重复性好(t=1.178,P=0.332)。FP2/RP2和FP4/RP4 2对引物及其探针可用于炭疽杆菌感染初期的快速筛查以及临床辅助诊断。     

读者信箱

美国人受炭疽的攻击　　　　　这是什么回事 ?　　　　　　 问　自“9.1 1”事件以后 ,恐怖分　　　　　　　　　子用炭疽杆菌攻击美国 ,请问这种用于生物战的炭疽杆菌和我们兽医中动物的炭疽杆菌是不是一回事 ?(马先行　　梧州市 )答　用炭疽杆菌攻击美国的最早报道是 2 0 0 1年 1 0月1 5日 ,美国国会参议院多数党领袖ＴｏｍＤａｓｃｈｌｅ的办公室收到装有炭疽杆菌芽孢的邮件。事实上 ,在此之前 ,已有多起袭击事件。以后引起数人死亡。炭疽是人畜共患的传染病 ,以牛、羊、马等动物最敏感 ,其他动物也可感染。人主要通过宰杀死亡病畜 ,经消…     

动物炭疽病的诊断及防控措施

1 病原学 炭疽杆菌是需氧或兼性厌氧无鞭毛的粗大杆菌,长4～8微米,宽1。15微米。菌体两端平削呈竹节状长链排列,革兰氏染色阳性。在人体内有荚膜形成并具较强致病性,无毒菌株不产生荚膜。炭疽杆菌生活力强,在一般培养基上生长良好。炭疽杆菌繁殖体于56℃2小时、75℃1分钟即可被杀灭。本菌在未解剖的尸体内于夏季经1—4天即可完全死亡,也易被一般消毒药物杀死。此病菌煮沸需15～25分钟才能杀死芽孢。消毒药物中以碘溶液、过氧乙酸、高锰酸钾及漂白粉对芽孢的杀死力较强,所以临床上常用20％漂白粉、0．1％碘溶液、0．5％过氧乙酸作为消毒剂。     

炭疽芽孢杆菌携带前噬菌体的预测及耐药性与毒力分析

【目的】预测并分析炭疽芽孢杆菌携带前噬菌体的比例、前噬菌体携带抗生素耐药基因与毒力基因的情况,了解并分析炭疽芽孢杆菌前噬菌体对菌株耐药性与毒力的影响,为后续研究与应用炭疽芽孢杆菌前噬菌体提供借鉴。【方法】利用PHASTER在线分析软件预测炭疽芽孢杆菌携带的前噬菌体,采用抗生素耐药基因数据库(comprehensive antibiotic research database, CARD)和毒力因子数据库(virulence factors database, VFDB)预测前噬菌体携带的抗生素耐药基因和毒力因子。【结果】预测到1 421条炭疽芽孢杆菌前噬菌体,其中完整型前噬菌体267条,疑似型前噬菌体321条,不完整型前噬菌体833条。每株炭疽芽孢杆菌所携带的全部前噬菌体基因组占其基因组比例为3%～4%。771条前噬菌体携带1 075个耐药基因。耐药表型共有29种,分别来自28种不同的耐药家族,涵盖6种抗生素耐药的作用机制。394条前噬菌体编码688个毒力因子,归类为71种毒力基因和52种毒力因子。分析毒力因子可能的宿主菌株来源构成发现,除炭疽芽孢杆菌外,嗜肺军团菌亚种、蜡样芽孢杆菌、...     

炭疽芽孢杆菌PA-LF1融合蛋白的原核表达及其反应原性研究

【目的】构建炭疽芽孢杆菌弱毒株C40-202PA-LF1融合基因表达载体并对其进行原核表达和反应原性检测,为炭疽亚单位疫苗制备、炭疽诊断和疫苗免疫效果检测提供依据。【方法】根据GenBank中登录的炭疽芽孢杆菌PA和LF基因序列设计2对引物,利用PCR方法从炭疽芽孢杆菌弱毒株C40-202中分别扩增出PA和LF1基因片段,经XhoⅠ限制性内切酶消化后,通过黏性末端进行连接,获得PA-LF1融合基因片段,利用SWISS-MODEL分析软件分别对PA、LF1和PA-LF1融合蛋白进行三级结构预测;将融合基因片段克隆至pET32a(＋)质粒中,构建重组质粒pET32a-PA-LF1,并将重组质粒pET32a-PA-LF1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,SDS-PAGE分析重组蛋白表达,Western blotting鉴定融合蛋白并分析其反应原性。【结果】从炭疽芽孢杆菌弱毒C40-202株成功扩增出PA、LF1和PA-LF1融合基因;成功构建了炭疽芽孢杆菌PA-LF1融合基因表达质粒pET32a-PA-LF1,融合蛋白三级结构预测可折叠为正确的空间构象;构建的重组质粒经诱导表达、纯化和SDS-PAGE,获得分子质量为96 ku的融合蛋白,以包涵体形式表达;经Western blotting验证,纯化后的重组蛋白与经Ⅱ号炭疽芽孢苗免疫后的绵羊血清发生特异性结合,表明其具有良好的反应原性。【结论】PA-LF1融合蛋白具有良好的反应原性,可为炭疽诊断和疫苗免疫效果检测提供理论依据,同时也可作为一种炭疽亚单位疫苗的候选组分。     

芽孢杆菌制剂对肉鸡生产性能的影响

在实践中芽孢杆菌制剂被广泛关注,本试验通过肉鸡大群生产性试验判定芽孢杆菌制剂的实际效能。试验采用随机区组设计,将2560羽AA＋肉鸡均分至4个饲粮处理组中,对照组使用基础饲粮,试验Ⅰ组在基础日粮中添加100g／t的益畜宝,试验Ⅱ组添加200g／t的益畜宝,试验Ⅲ组添加700g／t的益菌健;饲养期52d。结果表明,饲粮中添加200g／t的益畜宝可提高出栏体重0．1kg（P〈0．05）;其他处理之间差异不显著（P〉0．05）。单从数值上看,使用700g／t的益菌健可以提高存活率2．5个百分点;使用200g／t的益畜宝可以降低料重比0．06。结论：肉鸡日粮中添加芽孢杆菌制剂对提高出栏体重、降低料重比和死亡率都有一定的积极作用。     

人兽共患病的现状与防制（十一）——炭疽

炭疽是由炭疽芽孢杆菌引起的人家畜和野生动物共患的种急性热性、败血性传染病。因可引起皮肤等组织发生黑炭状坏死，故称为炭疽。炭疽是一种古老的疾病，在我国的《黄帝内经》中就有过该病的记载，1849年德国著名学者考克首先发现了炭疽芽孢杆菌．其后炭疽曾在世界各处多次散发或暴发。据统计．全世界目前每年感染炭疽的病人可达2万-10万人．我国近5年来每年炭疽发病数波动在400～1000人．主要集中在贵州、新疆、甘肃、四川广西、云南等西部地区．而家畜思此病所造成的经济损失就更为严重。     

西班牙和埃及联合建立一种实时PCR法用于直接、定量检测超高温灭菌乳中耐热芽孢杆菌

正西班牙与埃及研究人员合作建立一种灵敏、特异的实时PCR-Taq Man探针法用于直接检测超高温灭菌乳中耐热芽孢杆菌。基于Gen Bank中11个耐热芽孢杆菌菌株16S r RNA基因序列,选择了目标区域。采用标准菌株耐热芽孢杆菌DSM 10599建立标准曲线,确定了超高温灭菌乳中耐热芽孢杆菌的检测限为10 CFU/m L。利用建立的方法直接测定来自不同超市的110个超高温灭菌乳样品中耐热芽孢杆菌,所得结果与微生     

猪传染性胸膜肺炎PCR诊断方法的建立

根据已发表的猪胸膜肺炎放线杆菌APXIV毒素的基因序列，自行设计和合成了二对可扩增448bp和365bp目的片段的引物，成功的建立了检测APP的套式PCR方法。通过对猪肺疫巴氏杆菌、猪链球菌、大肠杆菌、猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体和猪丹毒杆菌的DNA进行了PCR检测，结果均为阴性；对猪胸膜肺炎放线杆菌的1、2、5、6、7、9国际标准血清型均扩增出448bp和365bp的特异性条带；检测的敏感度一步PCR可达到5OO个细菌，最低检出DNA浓度可达到0．585ng／mL；套式PCR可达到50个细菌，最低检出DNA浓度可达到58．5pg／mL。另外，对5株从病猪体内分离的猪胸膜肺炎放线杆菌进行了检测，5株均成阳性反应；对10只屠宰猪的肺脏分离物进行了检测，结果1份为阳性。结果表明此法特异性和敏感性均很高，可做为猪传染性胸膜肺炎的快速诊断和流行病学调查的手段。     

两株类炭疽菌株的鉴定

检验炭疽沉淀素血清特异性的两株类炭疽菌Ｃ４１－１和Ｃ４１－３，经培养特性和生化特性的鉴定与蜡状芽孢杆菌基本一致。这两个菌株应归为蜡状芽孢杆菌。     

地衣芽孢杆菌的分离鉴定及其抑菌活性分析

为了研究不同来源的地衣芽孢杆菌对常见致病菌的抑菌效果等生物学特性，试验采用细菌形态学、生理生化、16S rRNA基因测序、系统发育树分析、牛津杯抑菌试验等检测技术，对5株不同来源(鸡粪、羊粪、牛瘤胃内容物、猪肠内容物及土壤)的地衣芽孢杆菌进行了分离鉴定及体外抑菌活性检测。结果表明：5株分离株B₁₇(鸡粪)、B₃₀(羊粪)、B₃₂(牛瘤胃内容物)、B₃₅(猪肠内容物)和B₃₈(土壤)均可在LB固体培养基上生长，其中有3株不同来源的分离株B₃₀、B₃₅和B₃₈菌落形态相同；镜检可见分离株均为革兰氏阳性杆菌、均有近中生的孢子，符合芽孢杆菌的菌体特征；生理生化特性与芽孢杆菌相符；PCR扩增均得到约为1 500 bp的目的片段;所有分离株与GenBank中的地衣芽孢杆菌在同一簇，均鉴定为地衣芽孢杆菌；在5株地衣芽孢杆菌中，除猪源地衣芽孢杆菌B₃₅外，其余4株均有抑菌作用，羊源及牛源地衣芽孢杆菌B     

肉鸭日粮中合生元部分替代抗生素的应用研究

选取1日龄樱桃谷肉鸭750羽,随机分成5组,每组5个重复,每重复30羽。进行为期5周的养殖试验,检测生产性能、免疫器官指数和血液生化指标。试验中对照组饲喂基础日粮,抗生素组在基础日粮中添加4 mg/kg黄霉素,复合芽孢组在基础日粮中添加2 mg/kg黄霉素和1.0×106cfu/g复合芽孢杆菌,合生元Ⅰ组在基础日粮中添加2 mg/kg黄霉素和由0.7×106cfu/g复合芽孢杆菌+0.5 g/kg酵母细胞壁组成的合生元,合生元Ⅱ组则在基础日粮中添加2 mg/kg黄霉素和由0.5×106cfu/g复合芽孢杆菌+0.3 g/kg酵母细胞壁+0.15 g/kg核苷酸组成的合生元。试验结果表明:复合芽孢杆菌或合生元替代2 mg/kg黄霉素,肉鸭生产性能未受明显影响,且合生元Ⅱ组生产性能最佳。复合芽孢杆菌或合生元替代2 mg/kg黄霉素后,体现出提高肉鸭免疫机能的作用,且对血液生化指标略有正向改善作用。因此,在本试验条件下,合生元Ⅱ可较好地替代肉鸭日粮中2 mg/kg黄霉素。     

炭疽芽孢杆菌的研究进展

炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)简称炭疽杆菌,可引起人畜共患传染病炭疽(Anthrax),该菌主要感染牛、羊等家畜,感染人的概率较低。近年来,我国许多地区均有炭疽病的发生,给我国养殖业带来了巨大的经济损失。文章主要就炭疽芽孢杆菌的生物学特性、毒力因子、致病机理、检测方法等进行综述,以期为该病的深入研究提供参考。     

动物炭疽实验室诊断技术的研究进展

正炭疽是由炭疽杆菌(Bacillus anthracis)引发的一种急性、热性、败血性的人畜共患传染病,炭疽芽孢杆菌为革兰氏阳性菌。炭疽的研究者多从以下三个方面对炭疽疾病进行研究,即炭疽杆菌的基因组、炭疽杆菌的荚膜及炭疽杆菌的毒素。炭疽杆菌的基因组由染色体及两个大质粒(p XO1和p XO2)组成,这两个大质粒含有炭疽芽孢杆菌的两大毒力因子,即炭疽毒素、抗吞噬荚膜多肽的编码基因,美国基因组研究     

猪炭疽病检疫和鉴别

炭疽是由炭疽杆菌引起的急性、败血型人畜共患传染病，由于炭疽杆菌具有荚膜，在体外能形成芽孢（存活期长，不易杀灭）的特性，故必须重视该病。多种动物及人对该病都具有不同程度的感受性．其中以草食动物的易感性较高。近些年来，该病在南阳市仍有零星发生。猪炭疽主要表现为局部、散发型，败血型很少见，究其原因主要是在健康猪的肠道中有炭疽杆菌噬菌体存在。因此，当炭疽杆菌侵入后，噬菌体从肠道中经血液到入侵部位．使病程的发展受到限制和缓和；另外，猪的血清中含有抗炭疽的天然抗体；所以猪的局部炭疽较为常见。