水稻单粒种子DNA提取及SSR-PCR反应体系的正交设计优化

以水稻单粒干种子为材料．进行了DNA提取方法和SSR-PCR反应体系的优化研究。结果表明：用CTAB法提取的水稻干种子DNA较为完整,降解量少。可获得理想的扩增效果。在试验设计范围内,确定的最佳反应体系为201．11．其中含模板DNA35ng,dNTPs浓度为0．15mm01／L,引物浓度0．41．1m01／L,M矿浓度为1．5mmol／L,Taq酶为1．6U。     

新疆贝母DNA提取及ISSR-PCR体系的建立与优化

目的:从新疆贝母干叶片中提取高质量的DNA,建立ISSR-PCR体系并进行优化。方法:通过改进的CTAB法提取基因组DNA;综合利用单因素实验和L9(34)正交实验2种方法,对镁离子、dNTP、模板DNA含量、TaqDNA聚合酶量、引物浓度等因素进行优化,并采用温度梯度筛选引物的退火温度。结果:新疆贝母20μL ISSR-PCR最适反应体系dNTP为0.3 mmol/L,Mg2+为2.0 mmol/L,模板浓度为40～100 ng/(20μL),引物为1.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶为1.0 U/20μL,引物UBC 859的最适退火温度为50.7℃。结论:此提取方法得到的DNA纯度高,ISSR-PCR扩增效果显著,为新疆贝母种质资源鉴定、遗传多样性分析奠定研究基础。     

淮山RAPD-PCR反应体系的建立

摘要：采用改良CTAB法提取淮山的叶片总DNA。通过单因子实验法分析DNA浓度、引物浓度、dNTP浓度、Taq聚合酶以及Mg2+浓度对RAPD-PCR扩增结果的影响,建立了适合于淮山RAPD-PCR反应体系,即20μL体系中包括：模板DNA为50 ng、Taq酶为0.2U、Mg2+浓度为3.0mmol/L、引物浓度为0.2μmol/L、dNTPs浓度为0.2mmol/L。     

鼠尾草属植物基因组DNA提取及RAPD反应条件优化

以鼠尾草属植物叶片为材料,提取基因组DNA,并对RAPD反应条件进行了系统优化.结果表明,采用核DNA法提取的DNA质量较高,适宜于RAPD分析;RAPD扩增最佳反应体系为20μl反应体系中,10×buffer 2.0μl,模板DNA 20 ng,Mg 浓度2.0 mmol/L,引物浓度0.6μmol/L,dNTPs浓度0.2mmol/L,Taq酶1.0U.扩增反应程序为94℃预变性5min,94℃变性1min,36℃退火1main,72℃延伸2main;40个循环;72℃后延伸10main,4℃保存.     

水稻TRAP-PCR反应体系优化与P-糖蛋白基因片段的分析

对影响TRAP-PCR反应体系的各参数,包括模板DNA、dNTP、Taq DNA聚合酶和引物浓度进行了优化,建立了适合水稻的稳定,可重复的TRAP-PCR反应体系.在20μL PCR反应体系中,含80 ng模板DNA,0.25 mmol/L dNTP,0.75 U Taq DNA聚合酶,5 ng/μL随机引物和7.5 ng/μL特异引物.本研究对P-糖蛋白基因片段进行了克隆并序列分析,为深一步研究奠定了基础.     

萝卜基因组DNA RAPD与ISSR-PCR反应体系优化

对影响PCR反应的主要因子———模板DNA、引物、dNTPs和Mg2 浓度进行优化,建立起适合于萝卜基因组DNA的RAPD和ISSR反应体系。RAPD反应体系(18μl)为随机引物0.4~0.6μmol/L,dNTPs0.15~0.2mmol/L,Mg2 2.0mmol/L,模板DNA10~40ng,TaqDNA聚合酶0.8U;ISSR反应体系(16μl)为引物0.5μmol/L,dNTPs0.16mmol/L,Mg2 2.5mmol/L,模板DNA10~40ng,TaqDNA聚合酶0.64U。对扩增程序中复性温度进行了梯度PCR试验,表明35~42℃(37℃)与52.4~58.3℃(55℃)分别适于萝卜基因组DNA的RAPD-PCR和ISSR-PCR反应;应用优化的RAPD和IS-SR反应体系对17个萝卜品种进行了鉴定分析。研究结果将为萝卜分子育种、品种鉴定与种子纯度检测提供重要的技术基础。     

辽东地区胡桃楸天然林ISSR分子标记体系的建立和优化

为建立胡桃楸天然林ISSR-PCR反应体系,本实验从DNA的提取到扩增进行了研究。通过对比CTAB和试剂盒两种方法,发现胡桃楸最佳DNA提取方法为试剂盒法。利用正交试验设计法确定了胡桃楸ISSR-PCR反应最佳体系,并对影响胡桃楸PCR反应的Taq酶浓度、Mg~(2+)浓度、dNTP浓度等因素进行了优化。最终获得胡桃揪ISSR-PCR反应的最优扩增程序为:95℃预变性3 min,95℃变性30 s,48.3℃复性30 s,72℃延伸1 min,28次循环,最后72℃终延伸5 min。优化胡桃楸ISSR-PCR的最佳反应体系为:Taq DNA聚合酶浓度为0.75 U/20μL、Mg~(2+)浓度为1.75 mmol/L、dNTP浓度为0.20 mmol/L、引物浓度为0.35μmol/L、DNA模板浓度为150 ng/20μL。该研究为以后利用ISSR分子标记技术研究胡桃楸的亲缘关系和遗传多样性提供高效的技术手段。     

利用PCR仪快速提取甜菜基因组DNA

为了寻找一种快速提取甜菜基因组DNA的方法,以甜菜干种子、幼苗、种仁以及甜菜叶片干粉为原料,利用PCR仪结合碱裂解法快速提取甜菜基因组DNA,利用微量分光光度计检测取DNA的浓度,并用甜菜SSR引物对提取的DNA进行扩增。结果表明,在4 种材料中均检测到了DNA,干种子、幼苗、种仁以及叶片干粉中提取的DNA平均浓度分别为432、197、158、448 ng/μL,无论是DNA原液还是稀释到20 ng/μL的工作液,均能在SSR-PCR反应中扩增出清晰的条带。该方法提取甜菜基因组DNA简单、快速,仅需要NaOH和HCl两种药品,提取的DNA完全可以用于SSR-PCR反应,为快速鉴定甜菜品种纯度和真实性提供了技术支持。     

亚洲百合DNA的提取及RAPD-PCR反应体系的优化

为了促进亚洲百合分子水平的研究,以亚洲百合幼嫩叶片为材料,采用改良CTAB法提取亚洲百合基因组DNA,得到的DNA质量较高,适合于RAPD -PCR分析。通过单因素优化得到在25μl反应体系中,亚洲百合RAPD 分析的最佳反应体系：160μmol/ L dNTPs,0.3μmol/L随机引物,Taq DNA聚合酶1.5U,Mg2＋浓度2.0mmol/L。     

丝瓜SRAP反应体系的优化

以丝瓜基因组DNA为模板,对SRAP反应中主要五个影响因素d NTP浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、DNA模板浓度、Mg~(2+)浓度进行优化,建立丝瓜SRAP-PCR反应的体系。根据实验确定的最佳反应体系为25μL SRAP体系。25μL SRAP体系为:75 ng DNA,0.2 mmol/L d NTP,1.25 U Taq酶,0.16μmol/L的单条引物,2.0 mmol/L Mg~(2+),2.5μL 10×Buffer。选用33个丝瓜品种对所确立扩增体系及扩增程序进行验证,检测结果表现为扩增产物条带清晰明亮、亮度高、重复性好,表明本试验所确定的反应体系及反应程序适用于丝瓜的SRAP分子标记。     

基于SRAP分析的盘龙参DNA提取

以盘龙参为材料,采用CTAB法提取基因组DNA,探讨SRAP-PCR反应体系中模板DNA浓度对扩增的影响。结果表明:该CTAB法提取基因组DNA的OD260/OD280为1.81,浓度为4.35μg/μL。该CTAB法提取的基因组DNA纯度好,片段完整,无降解;在20μL反应体系中,模板DNA浓度为3.0 ng/μL时,重复性和稳定性较好,适于SRAP-PCR技术。     

食用向日葵SSR-PCR反应体系的优化

为建立食用向日葵分子标记反应体系,以食用向日葵四叶期叶片为DNA模板提取材料,采用单因素试验和正交试验设计,对SSR-PCR反应体系中的6因素(10×PCR Buffer、Mg2+、d NTPs、引物、Taq DNA聚合酶和DNA模板)在5水平上进行正交优化试验,并比较了不同浓度Mg2+、Taq DNA聚合酶、模板DNA对扩增效果的影响,结果表明,各因素水平变化对反应体系的影响为Mg2+Taq DNA聚合酶(引物)DNA模板10×PCR Bufferd NTPs。最终建立食用向日葵SSR-PCR最佳反应体系为:在总体系为20μL的SSR-PCR反应体系中包括10×PCR Buffer 0.2mmol/L、Mg2+2.0 mmol/L、d NTPs 1.8 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.2 U、DNA 50 ng、引物1.5 mmol/L。     

薰衣草ISSR-PCR反应体系的正交优化

本研究以19份薰衣草品种为材料,采用正交设计对ISSR-PCR反应中的5个影响因素:DNA浓度、Taq DNA聚合酶用量、Mg2+浓度、引物浓度、d NTP浓度,进行5个水平的优化试验,并在48℃~59℃范围内摸索退火温度。研究结果建立了稳定的、可重复的薰衣草ISSR最佳反应体系和PCR扩增参数。在20μL的反应体系中,DNA模板浓度为2.50 ng/μL,Mg2+浓度为2.00 mmol/L,d NTP浓度为0.20 mmol/L,引物浓度为0.40μmol/L,Taq DNA聚合酶为0.75 U,退火温度为52℃。该体系可为开展薰衣草种质资源的遗传多样性分析评价奠定基础。     

甘薯DNA提取及ISSR反应体系的建立

以甘薯幼叶为试验材料,对甘薯基因组DNA的提取,并对其纯度、浓度进行检测,结果表明,DNA扩增效果良好,完全能满足进一步试验的需要.同时对甘薯ISSR-PCR反应体系中各个影响因素进行了优化,建立了适合甘薯ISSR分子标记的最佳反应体系,即在20μl的反应体系中,含稀释浓度为10倍的DNA模板,0.30 mmol/L dNTP,1.00μmol/L引物,1.00UTaq酶,0.5%去离子甲酰胺比较适合甘薯DNA的特异扩增.     

应用正交设计建立芍药的SRAP反应体系

为快速建立优化的芍药SRAP扩增反应体系,应用L25(56)正交表,研究了Taq、Mg2+、随机引物、dNTPs和DNA模板5种反应组分的浓度变化对SRAP扩增结果的影响,直观分析和稳定性检测结果表明:正交设计可高效建立优化稳定的芍药SRAP反应体系;用该法建立的芍药SRAP-PCR优化反应体系为:25μL反应体系中含10×PCR Buffer(100 mmol/L Tris-HCl pH 8.3,500 mmol/L KCl)2.5μL,MgCl22.5 mmol/L,dNTP各0.25 mmol/L,引物各0.3μmol/L,TaqDNA聚合酶1 U,DNA模板120 ng。     

黄瓜SSR反应体系的建立

为摸索适宜黄瓜的SSR反应体系,分析了PCR反应体系中的Mg^2 浓度、、dNTP浓度、DNA模板浓度、引物浓度、Taq聚合酶浓度对扩增结果的影响,并比较了琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶体系在检测扩增产物多态性方面的差异。结果表明：在25μLPCR反应体系中,Mg^2 的最适浓度为0．2mmol／L;dNTP最适浓度为0．2mmol／L;反应体系中Taq聚合酶宜加入1U,引物应加入30ng;DNA最适浓度为5ng/μL。     

柑桔SRAP和ISSR分子标记技术体系的建立与优化

通过对PCR反应程序、反应体系(DNA模板量、PCR反应体积、Mg2 浓度、dNTP浓度、Taq酶用量、引物量)、电泳检测方法的系统优化,建立了柑桔SRAP-PCR和ISSR-PCR体系;以此进行大规模引物筛选,从而建立了柑桔SRAP和ISSR分子标记技术体系.SRAP-PCR:25μL体系,模板DNA25ng,Tris-HCl10 mmol/L,KCl50 mmol/L,Mg2 1.2 mmol/L,dNTP 120 μmol/L,Taq酶1.5U,引物0.4μmol/L,反应程序为94℃预变性5min,35个循环(94℃ 30s,47℃ 1min,72℃ 1min),72℃延伸10min;ISSR-PCR:25μL体系,模板DNA25ng,Tris-HCl10mmol/L,KCl50mmol/L,Mg2 1.6 mmol/L,dNTP200μmol/L,Taq酶1 U,引物0.8μmol/L.筛选出稳定性好、多态性高的24对SRAP引物和13条ISSR引物.     

元宝枫SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

本研究采用改良的CTAB法提取元宝枫基因组DNA,并使用L_(16)(4~5)正交试验设计。通过5因素4水平实验,筛选Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物浓度、Mg~(2+)、模板DNA浓度及其用量,建立并优化元宝枫(Acer truncatum)的最佳SSR-PCR反应体系,即总体积20μL,Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物、Mg~(2+)和模板DNA浓度分别为1 U/20μL、0.2 mmol/L、0.6 mmol/L、1.25 mmol/L和75 ng/20μL。扩增实验结果表明,该反应体系稳定性较好,可重复性高,具有较好的分辨率。可从59对引物中筛选出14对适用于元宝枫并具有较明显的多态性的SSR引物,为进一步研究元宝枫的分子标记辅助育种、SSR遗传多样性分析和遗传图谱构建提供了良好的基础。     

月季SSR-PCR反应体系的建立和优化

采用L16(54)正交设计和二因素完全随机试验,分析了月季SSR-PCR反应体系的主要成分Taq DNA聚合酶、样本浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度以及引物浓度对扩增结果的影响,建立了适合月季的SSR反应体系.研究结果表明:在20μL反应体系中,Taq DNA聚合酶宜加入1.5U,样本最适宜浓度为30～40 ng,Mg2+的最适浓度为1～1.5 mmol/L,dNTP最适浓度为0.2 mmol/L,单引物的最适浓度均为1μmol/L.用建成的反应体系对19对引物筛选,对12个月季品种扩增,3%的琼脂糖凝胶电泳检测,品种间DNA谱带多态性丰富,证明该体系稳定可靠.     

西番莲科龙珠果ISSR-PCR体系的建立和优化

为了获得适于龙珠果ISSR-PCR的反应体系,本研究以龙珠果叶片为试验材料,提取基因组DNA,采用L16(45)正交设计试验,对影响龙珠果ISSR-PCR扩增结果的Mg²⁺浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶用量、引物浓度和模板DNA量进行优化,并筛选了最适退火温度。试验结果分析表明,各因素影响显著性为dNTPs浓度>Taq DNA聚合酶用量>Mg²⁺浓度>模板DNA量>引物浓度。在20μL反应体系中,dNTPs浓度0.2 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U、Mg²⁺浓度2.0 mmol/L、模板DNA 25 ng、引物浓度0.4μmol/L为最佳用量。实验从100条UBC引物中筛选得到22条多态性较好的引物。本研究为龙珠果ISSR标记开发、种质资源鉴定、遗传多样性分析和分子标记辅助选择育种等提供科学依据。