奶牛附红细胞体16S rRNA基因的克隆、测序及系统发育进化树的建立

为了从分子水平上证实奶牛附红细胞体的存在及研究其分类学地位,利用原核生物16S rRNA基因通用引物对分离纯化的疑似奶牛附红细胞体进行16S rRNA基因的PCR扩增及克隆测序。结果扩增出长约1.5 kb的目的片段,测序结果表明:目的片段长度为1 439 bp,其核苷酸序列与国外已发表的牛温氏附红细胞体(E.wenyoni)的16SrRNA基因片段同源性高达97.1%,暂称为中国广西株(E.wenyoniCGX)。系统发育进化树显示:E.wenyoni和其他血营养菌在系统进化关系上组成了一个大的进化分支,与支原体科、支原体属的病原最接近(75%),而与立克次体科的病原较远(55%)。分析结果支持了Nei mark等和Messick等提出的将这类血营养菌划归支原体科、支原体属的建议。     

温氏附红细胞体16S rRNA基因的序列测定和分析

从自然感染附红细胞体的湖北黄牛无菌采集血液,分离附红细胞体并提取病原基因组,用血营养菌的16SrRNA基因的通用引物进行PCR扩增,得到长约1.5kb的扩增片段,将其克隆到pMD18-T载体后进行测序和分析.结果表明该片段全长为1 471 bp（GenBank收录号为AY946266）,同源性分析表明该序列与Neimark公布的温氏附红细胞体（AF016546）的16S rRNA基因序列同源性达到98.7%,证实该病原为温氏附红细胞体,从分子生物学水平证实了温氏附红细胞体在湖北省的存在.将该序列与5种支原体、14种血营养菌及边缘无浆体等的相应序列进行比较,建立系统发育树,结果表明温氏附红细胞体同边缘无浆体的关系较远,而与肺炎支原体组的亲缘关系较近.     

温氏附红细胞体部分16S rRNA基因的序列测定和分析

从确诊为附红细胞体感染的黄牛无菌采集血样，抽提附红细胞体基因组DNA，用实验设计的能扩增多种动物血营养菌部分16SrRNA基因的通用引物进行PCR扩增，结果扩增出大小约为370bp的DNA片段。PCR产物序列测定和系统进化分析显示，实验获得的核苷酸序列为温氏附红细胞体的16SrRNA基因，与国外报道的温氏附红细胞体的同源性为97％。反映出不同地理株的温氏附红细胞体存在一定的遗传差异，为牛附红细胞体病的诊断和分子流行病学研究提供科学依据。     

奶牛附红细胞体的分类鉴定及诊断方法的建立

为了从分子水平上确定奶牛附红细胞体（E．wenyoni）的分类学地位及建立奶牛附红细胞体感染诊断方法。本研究通过利用原核生物16S rRNA基因通用引物，对分离得到的奶牛附红细胞体（广西株，E．wenyoni-GX）进行16SrRNA基因的克隆及测序。并建立系统发育进化树；同时根据测序结果设计诊断引物，建立奶牛附红细胞体感染的PCR诊断方法。结果扩增出长约1．5kbp的奶牛附红细胞体的16SrRNA基因片段；特异性试验和敏感性试验表明。所建立的PCR方法与常见支原体、细菌及原虫元交叉反应，能检测奶牛附红细胞体最低DNA量为0．145fg。通过试验结果分析，建议将奶牛附红细胞体这类血营养菌划归入支原体科、支原体属；同时，所建立的PCR诊断方法是特异、敏感、快速的，可应用于临床检测。     

牛附红细胞体16SrRNA基因的克隆测序及分析

无菌采集自然感染附红细胞体的牛血液,提取全血基因组,用血营养菌16S rRNA基因的通用引物进行PCR扩增,得到长约1 500 bp的扩增片段,将其克隆到pMD18-T载体后进行测序和分析.结果,所克隆的牛附红细胞体基因片段大小为1 454 bp,GenBank登录号为FJ375309(丰都株).序列比对结果显示,牛附红细胞体丰都株与武汉株(AY946266)最高,达99.7%,与支原体科代表种同源性为60.7%～76.2%,而与立克次氏体科的立克次氏体和无形体科的无形体同源性仅为51.4%～56.4%,表明牛附红细胞体应归为支原体科,附红细胞体属,而不应属于立克次氏体目,无浆体科.对国内外牛温氏附红细胞体的亲缘关系分析表明,牛温氏附红细胞体无明显的地域性差别趋势.     

产丁二酮的嗜热链球菌的筛选和鉴定

从酸马奶中分离出五株链球菌，其中KM18的丁二酮的产量为20mg／mL。利用PCR扩增该菌的16SrRNA基因，将测序结果同该属内菌株的16SrRNA基因序列作多序列比较，并建立链球菌属的系统发育树。结果表明，KM18的16SrRNA基因序列同S．thermophilus的同源性百分比为98．2％。综合系统发育树的结果，将KM18鉴定为S．thermophilus。菌株KM18的16SrRNA基因序列已经在GENBANK申请国际序列注册号，为D0176426。     

重庆地区牛附红细胞体16S rRNA基因部分序列的测定和分析

目的对牛附红细胞体的16SrRNA基因序列进行测定和系统进化分析。方法无菌采取感染附红细胞体的黄牛、奶牛、水牛血液,提取附红细胞体的基因组DNA,根据GenBank公布的奶牛附红细胞体16SrRNA序列设计的特异性引物进行PCR扩增,并对PCR产物进行序列测定和系统进化分析。结果PCR扩增出的DNA片段均为415bp左右。序列测定和系统进化分析显示,三者间的相似度分别为（黄牛：水牛=99．52％;黄牛：奶牛：99．28％;奶牛：水牛=99．76％）。与GenBank上公布的Mycoplasma wenyonii（武汉株）序列比较存在有4个突变位点,相似度均〉98％。结论表明本次在重庆地区从牛体分离的附红细胞体为温氏附红细胞体。     

猪肺炎支原体PCR诊断方法的建立

建立了一个PCR检测猪肺炎支原体(Mhp)的方法。根据国外发表Mhp 16sr RNA基因设计了一对特异性引物，扩增出一个大小为653bp的特异性片段。将PCR产物克隆并测序表明，与GenBank的Mhp的序列的同源性为89．2％。而对于常见的猪呼吸道疾病有关的病原胸膜肺炎放线杆菌、支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌以及牛支原体、羊支原体不能扩增出特异性片段；PCR的敏感性实验显示这对引物能够检测到1ng的DNA，结果表明此方法特异、敏感。     

牛源环孢子虫的发现与分子鉴定

根据GenBank上已发表的环孢子虫序列设计并合成2对引物，利用巢式PCR技术对首次在牛体内发现的形态学特征与人环孢子虫极为相似的牛源环孢子虫的18SrRNA基因进行了扩增，并以KpnⅠ酶对PCR产物进行RFLP分析；扩增出的片段纯化后克隆至pGEM-T Easy载体，对阳性克隆进行序列测定并对测序结果进行了同源性及系统发育分析。结果显示，扩增的18SrRNA基因片段大小为501bp，不含KpnⅠ酶切位点，与对照的艾美尔球虫的酶切图谱明显不同。序列同源性及系统发育分析显示该牛源环孢子虫与环孢子虫同源性最高，系统树中位于同一分支，可以确定其为一种环孢子虫。     

番鸭呼肠孤病毒ZJ99株σC蛋白基因的克隆与序列分析

参考已发表的番鸭呼肠孤病毒(mDRV)的S4序列设计了S4对扩增σC蛋白基N的引物，对mDRV ZJ99株的RNA抽提物进行RT—PCR扩增，获得了特异性的扩增片段。将PCR产物克隆测序，序列经同源性比较，发现mDRV ZJ99株σC蛋白基N序列与福建MW9710株对应基N的同源性为99．5％，与法国89026株对应基因的同源性为94．2％，与法国89330株对应基因的同源性为95．0％；相应的氨基酸序列同源性分别为98．9％、94．1％、93．7％。基于σC基因及其推导氨基酸序列的蛋白质结构及物理化学性质预测结果，与国外学者对mDRV σC蛋白的报道相似。     

Study on some molecular characterization of Babesia orientalis

The study on buffalo babesiosis indicated that its pathogen was different from other Babesia on many aspects such as morphology, transmission and pathogenicity. Therefore, it was named as a new species—Babesia orientalis. In order to prove the validity of this taxon, molecular taxonomic study on the pathogen was done in this experiment. The complete 18S rRNA gene sequence of B. orientalis was determined by PCR. It was sequenced and blasted. The results indicated that the classification of the parasite belonged to the genus Babesia. The 1700 bp complete sequence was compared with 15 other Babesia sp. available in GenBank. The data were analyzed and a phylogenetic tree was established. The results indicated that the hereditary distance of the parasite was close to that of Babesia sp. from South Africa and Babesia ovis, and the hereditary distance was far from Babesia bigemina and B. bovis.     

牛附红细胞体单管套式PCR检测方法的建立

为快速、准确地检测出牛附红细胞体,根据GenBank上发表的牛温氏附红细胞体(Mycoplasma wenyonii)l6S rRNA基因序列(登录号AF016546)设计合成内外2对引物,建立了牛附红细胞体单管套式PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性及应用试验。结果:建立的牛附红细胞体单管套式PCR检测方法扩增的片段大小为361 bp,与GenBank中相应序列同源性为98%,该方法扩增不出牛瑟氏泰勒虫、新孢子虫、布氏杆菌及牛无乳链球菌等基因片段,检测出标准模板DNA的最小量为1.22 fgμ/L。通过对吉林省延边地区66份血液样本的临床检测显示,单管套式PCR检出率28.8%,高于常规PCR的21.2%和鲜血压片镜检的12.1%,具有准确、特异、敏感等优点,是检测牛附红细胞体的一种新型、可靠的诊断技术。     

Molecular investigation of transplacental and vector-borne transmission of bovine haemoplasmas

The present study was carried out in a herd with concurrent infections of Mycoplasma wenyonii and 'Candidatus M. haemobos', to investigate if transplacental and/or vector-borne transmission is possible for one or both bovine haemoplasma species. For this purpose blood samples were collected from 38 mother animals and their newborn calves; as well as from 17 uninseminated cows twice three months apart. In addition, 311 mosquitoes and blood-sucking flies (Diptera: Culicidae, Tabanidae, Muscidae) were cought near the animals. DNA was extracted from all samples, followed by real-time PCR analysis. In 10.5% of neonate calves, that were born to cows harbouring both haemoplasmas, M. wenyonii and/or 'Candidatus M. haemobos' positivity was detected. Copy numbers in positive samples from cows and their calves indicated that - in comparison with M. wenyonii - 'Candidatus M. haemobos'-bacteraemia had usually lower levels. In samples of uninseminated cows the rate of infection with the latter species decreased. These findings may explain why M. wenyonii was significantly more frequently detected in blood-sucking flies, than 'Candidatus M. haemobos'. In conclusion, molecular evidence is provided for the first time on the transplacental transmission of bovine haemoplasmas. Regarding their spread by blood-sucking arthropods, new potential vectors were identified, i.e. the horn fly (Haematobia irritans), the stable fly (Stomoxys calcitrans) and two species of horse flies (Tabanus bovinus, T. bromius).     

The detection of Mycoplasma (formerly Eperythrozoon) wenyonii by 16S rDNA PCR and denaturing gradient gel electrophoresis

Although the role of Mycoplasma wenyonii in disease is still subject to some debate, infections have been reported to result in parasitaemia, anaemia, scrotal and hind limb oedema, tachycardia, pyrexia, infertility, swollen teats, prefemoral lymphadenopathy and decreased milk production. Previously, diagnosis of M. wenyonii has been based on blood smears but is not specific for M. wenyonii and can be difficult to interpret. We have previously described the use of PCR and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) for the detection and differentiation of Mycoplasma species. DGGE enables the rapid and specific identification of Mycoplasma species and is ideally suited to detecting both mixed infections and new and unusual species. In this study, we have used DGGE with universal primers to detect M. wenyonii DNA from blood samples. DGGE can be used on blood samples as a rapid and specific test for M. wenyonii and can also be used as a screening test for other blood borne pathogens.     

猪δ冠状病毒西安株M基因序列的信息分析

为研究猪δ冠状病毒(PDCoV)西安株M基因的遗传特征,以分离并鉴定的PDCoV西安株(CHN-XA18-35株)为材料,根据GenBank中已发表的PDCoV M基因保守序列设计引物,经RT-PCR扩增PDCoV西安株M全基因序列并测序,应用生物信息学方法对M基因进行分析。结果显示,CHN-XA18-35株M基因序列与其他地区PDCoV参考株的核苷酸同源性为98.47%~99.54%,推导的氨基酸序列同源性为97.24%~99.08%;CHN-XA18-35株与其他地区PDCoV参考株相比,M蛋白第189位氨基酸由异亮氨酸(IIe)突变为精氨酸(Arg);CHN-XA18-35株M蛋白的10-27、34-56、66-87位氨基酸属于跨膜区;跨膜区氨基酸多为疏水性氨基酸,且存在α-螺旋;潜在的B细胞抗原表位位于M蛋白的102-107 aa(LSPESR)、149-158 aa(NGISVRNPPQ)、200-209 aa(LHTITTSKAG)。结果表明,CHN-XA18-35株M蛋白第189位氨基酸发生了突变,其B细胞抗原表位与其他PDCoV株相比未发生改变。     

鹅副粘病毒NA-1分离株HN蛋白基因的克隆与序列分析

鹅副粘病毒分离株NA-1经11日龄鸡胚增殖后纯化.提取病毒的基因组RNA,采用RT-PCR扩增出与预期设计的1.7kb大小相符合的特异条带.将扩增产物提纯后克隆入pMD 18-T载体,经纯化、筛选及酶切鉴定后,初步获得了含鹅副粘病毒HN基因的阳性克隆,并对阳性克隆进行测序.测序后拼接得出HN基因的全序列长度为1 740bp,该基因的ORF总长为1 716 bp,编码571个氨基酸.与GenBank下载的15株参考毒株比较HN基因编码区全核苷酸序列,发现所测NA-1毒株与参考毒株YG97核苷酸序列同源性为97.3%,与F48E9同源性为84.5%,与La Sota为82.2%.同源性分析表明NA-1相对于NDV在HN基因上发生了较大的变异.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SCMS株MN蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank中登录的美洲株ATCC VR-2332的MN蛋白基因序列,利用Oligo6.0设计一对特异性引物,以抽提的PRRSV-SCMS病毒感染细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增出长约1.0 kb的基因片段,将其克隆入pMD 18-T载体,测序结果显示SCMS MN基因全长886 bp,包含完整的MN基因的开放阅读框,共编码297个氨基酸。PRRSV-SCMS MN基因序列与VR2332和LV株进行同源性分析结果显示,PRRSV-SCMS与VR2332和LV株之间的核苷酸序列同源性分别为99.7%和61.6%,根据M基因推导的氨基酸序列同源性分别为98.9%和78.7%,根据N基因推导的氨基酸序列同源性分别为100%和52.8%。结果表明,SCMS地方分离株与VR2332株在基因型上具有更近的亲缘关系,推测本次分离的PRRSV属于美洲型。     

重庆地区牛附红细胞体分子流行病学调查

根据重庆地区不同的地理条件以及不同的养殖模式,采用16S rRNA-PCR检测方法对重庆市进行了牛附红细胞体的分子流行病学调查。结果显示:重庆地区存在牛附红细胞体感染,平均感染率为11%。其中规模化养殖平均感染率(6%)低于散养(16.7%),丘陵地区平均感染率(2%)低于高山地区(25.6%)。