抑制差减杂交法克隆牙鲆变态早期差异表达的基因

为了克隆变态早期牙鲆头部差异表达的基因,采用抑制差减杂交法,以变态前的仔鱼头部表达的RNA作为驱动RNA,建立了牙鲆变态早期的差减cDNA文库,并利用相对定量RT-PCR对其进行了筛选。差减库的平均插入片段558bp左右,阳性率为81．8％。随机测定的45个克隆,在剔除假阳性克隆后,共得到22个不同的基因,其中13个为已知cDNA的同源基因,而另外9个为已知蛋白的同源基因,分别为prolactin receptor-like,COL1A1,M3-muscarinic receptor,Sfrs3,tropomyosin,ribosomal protein L27,ribosomal [rpteom S12,GAPDH,COL1A3。在所有22个基因中,COL1A1基因在差减库中的分布频率最高,为22．2％。RT-PCR检测结果表明,在所检测的11个基因中,所有基因在右眼移动前后的牙鲆头部均有表达,只是体现在表达水平上的不同。     

牙鲆SRF基因的克隆及真核表达载体的构建

采用RACE-PCR技术,从牙鲆(Paralichthys olivaceus)组织中克隆了血清应答因子(SRF)基因全长序列,该序列全长2 477 bp,开放阅读框1 503 bp,编码500个氨基酸。通过氨基酸同源序列比对,牙鲆SRF与其它物种的同源性较高,在氨基酸序列的N端具有NLS结构域和高度保守的MADS结构域。用PCR方法扩增SRF基因的编码区片段,克隆到p EGFP-N1载体中,构建真核表达载体p EGFP-N1-SRF,将重组质粒转染牙鲆胚胎细胞,在荧光显微镜下观察转染细胞有绿色荧光蛋白表达。荧光定量PCR和Western blot实验进一步证实,SRF在转染细胞中高表达。说明真核表达载体p EGFP-N1-SRF构建成功,为进一步研究SRF在牙鲆变态发育中的作用奠定了实验基础。     

牙鲆dazl基因的克隆与表达分析

dazl(deleted in azoospermia-like)基因是多种物种精子发生的重要调控因子,为探讨该基因在牙鲆(Paralichthys olivaceus)性腺发育分化中的作用,本研究采用同源克隆和RACE技术克隆了牙鲆dazl基因的cDNA序列,利用生物信息学方法分析了其序列结构,并利用实时荧光定量PCR技术检测了该基因在牙鲆成体组织和早期发育阶段的表达情况。结果发现:牙鲆dazl cDNA序列全长2 031 bp,包括105 bp的5'端非翻译区,1 275 bp的3'端非翻译区和编码217个氨基酸残基的651 bp开放阅读框;氨基酸同源序列比对显示该序列存在一个高度保守的RRM(RNA recognition motif)结构域,且该结构域在鱼类中具有100%的序列一致性;荧光定量PCR结果显示dazl基因主要在牙鲆性腺中表达,且在精巢中的表达高于卵巢;在牙鲆早期发育阶段,dazl基因在未受精卵、受精卵及囊胚期均有较高的转录本,而在原肠胚期表达开始降低,至孵化后3 d一直保持较低的水平,这些丰富表达的母源性dazl mRNA可能参与了胚胎发育中原始生殖细胞的形成。本研究为进一步阐明dazl基因在牙鲆生殖发育中的功能奠定了基础。     

不同壳色皱纹盘鲍杂交家系J1RhF1全长cDNA文库的构建

采用日本岩手县的野生皱纹盘鲍(J_1,♀)和中国的人工选育红壳色皱纹盘鲍突变体(Rh,(?))的配子,经人工授精建立了皱纹盘鲍杂交家系(J_1Rh)。取J_1Rh家系6月龄F_1个体的软体部组织为材料,以SMART技术构建了全长cDNA文库,命名为HD-J_1Rh文库。HD-J_1Rh未扩增文库的滴度为6.4×10~5pfu·mL~(-1)、重组率为93.75％,插入片段均大于400bp,81.25％克隆的插入片段分布在1000～1500bp之间;扩增后的文库滴度为3.07×10~9pfu·mL~(-1)。表明HD-J_1Rh文库是一个高质量的cDNA文库,可满足进行大规模EST序列分析和特定发育阶段相关基因的筛选等研究的需求。     

败血症鲢肝与肾cDNA文库构建及MHC classⅠ的克隆与分析

采用CloneMinerTM cDNA文库构建试剂盒构建了患败血症的鲢(Hypophthalmichthys molitrix)肝和肾的cDNA文库.经检验,文库的滴度为1.34×107 cfu/mL,总库容为2.68×107 cfu,阳性克隆率为97.5％,平均插入片段大于1.2 kb.对80个随机挑选的克隆进行两端测序,结果显示有74个测序成功.经在GenBank上BLAST比对,其中57个为已知功能基因,属于45个不同基因,另外17个没有明显的同源序列.在已知功能的57个克隆中,含有全长编码区序列的克隆共有49个,全长cDNA比率为61.25％.采用PCR法对文库进行筛选,获得一个含MHC classⅠ完整编码区的序列,该序列具有典型的脊椎动物MHC class Ⅰ的序列特征.本研究完成鲢肝和肾较高质量的cDNA文库的构建,旨在为今后开展鲢功能基因研究奠定基础.     

中国大鲵脑cDNA文库构建及促甲状腺激素β亚基基因cDNA的克隆和序列分析

以大鲵脑组织为材料,提取总RNA,应用CloneminerTM文库构建技术构建了cDNA文库.经检测,文库初始滴度为5.0×105 cfu·mL-1,重组率为91.70%,插入片断大小在0.35～3.9 kb,平均插入片段大小为0.791 kb,文库扩增后滴度为4.0×109 cfu·mL-1.随机挑选200个阳性克隆测序,经生物信息学分析,发现20个片段与已报道的基因有较高同源性,包括促甲状腺激素基因、生长激素基因及催乳素基因等,其中三个克隆为促甲状腺激素β亚基(TSHβ)基因.序列分析表明,TSHβ cDNA全长序列为705 bp,包含417 bp开放读码框,编码138个氨基酸序列,其中前19个氨基酸为大鲵TSHβ亚基信号肽部分,后接119个氨基酸组成的TSHβ亚基成熟肽.同源性分析显示,大鲵TSHβ亚基与两栖类牛蛙、蟾蜍及爪蟾同一蛋白的同源性分别为53.6%、52.2%和60.3%.采用邻接法和最大简约法对部分脊椎动物TSHβ氨基酸序列构建分子系统树,结果显示有尾目大鲵为两栖动物中较早分化的一支,表明其进化地位较原始.RT-PCR组织分布分析发现,TSHβ基因除垂体有表达外,性腺也有少量表达.     

牙鲆酵母双杂交cDNA文库的构建及文库质量鉴定

为了研究牙鲆(Paralichthys olivaceus)免疫及抗病相关蛋白和大分子物质的功能及相互作用机制,构建了牙鲆酵母双杂交cDNA文库.原始文库滴度为1.6×106 CFU/mL,随机选取单克隆菌落进行PCR扩增,根据PCR扩增结果表明插入片段大部分大于500 bp,平均长度约为1.5 kb,随机调取了115个EST进行了序列测定.扩增后放大文库库容约为1.8×1012CFU.转化酵母后,文库转化效率为3.6×105CFU/μg,文库库容为5.4×106CFU.牙鲆酵母双杂交文库的构建成功为鲆蝶类免疫机理的研究,尤其是信号分子通路研究提供有效的工具.     

缘管浒苔rbcL全长cDNA克隆与序列分析

对缘管浒苔光合作用第一关键酶Rubisco大亚基基因(rbcL)全长cDNA序列进行了克隆分离。首先应用RT-PCR方法获得了rbcL大片段cDNA序列,序列长度为1101bp,并进行了测序分析。然后分别应用5′RACE方法和3′RACE方法获得2个克隆序列,其序列长度分别为371bp和579bp,并进行了测序分析。在此基础上,将3个片段序列进行拼接,获得了Rubisco大亚基全长cDNA序列(1472bp),其中包括1425bp的编码区序列及47bp的前导序列(NCBI登录号:DQ813496),并推断出蛋白质序列(474个氨基酸)。对序列进行了相关生物信息分析和同源性比对,结果显示与已克隆出全长rbcL基因的7种绿藻比较具有较高同源性,核苷酸序列和蛋白质序列同源性分别达到了82.07%～85.78%和88.00%～94.11%,其中与蛋白核小球藻蛋白质序列同源性最高,为94.11%。在此基础上,使用生物信息学软件对缘管浒苔rbcL氨基酸序列与其它植物或藻类进行了多序列比对,并且进一步应用在线软件程序进行了蛋白质的二级结构分析和三级结构预测。     

水硬度对七彩神仙鱼幼鱼发育的影响

采用不同硬度的水对七彩神仙鱼幼鱼进行饲养。6周龄幼鱼在硬度为7.94°dH±0.30°dH时饲养84d后,比在硬度为14.71°dH±0.23°dH水中的幼鱼个体大,生长速度快。表明较高硬度的水有利于七彩神仙鱼幼鱼的生长发育。     

斑节对虾虾苗活力检测方法

该研究通过肉眼观察、镜检,进行干露、饥饿、盐度突降、福尔马林等抗性试验,并采用病毒检测等方法,以期建立评估斑节对虾（Penaeus monodon）虾苗活力和质量标准。结果表明,斑节对虾健康虾苗具有趋光性、集群性,体表光洁,肌肉透亮,肠胃食物充盈等特性。测试虾苗干露时间以15min为宜,健康虾苗干露后能立即恢复活力,而病弱虾苗多出现死亡、昏迷现象;虾苗的成活率随饥饿时间的延长而降低,随福尔马林浓度升高和时间延长而降低,随盐度突降幅度增加而降低。健康虾苗能忍受100～200μL·L^-1福尔马林溶液30min,成活率近100％;在盐度20～30下虾苗的成活情况较好,而其在淡水中仅能存活1h。对虾苗进行病毒检测,可以避免养殖中因虾苗携带病毒而可能导致的病毒性疾病的暴发。     

合浦珠母贝选育家系的遗传多样性分析

该研究选取具有多态性的6对微卫星引物对构建的2批合浦珠母贝(Pinctada fucata)完全双列杂交家系的遗传多样性进行了分析。6个微卫星标记在9个家系360个个体中共检测到32个等位基因,有效等位基因(Ne)为1.758 7~3.586 5,观测杂合度(Ho)为0.144 4~0.488 9,期望杂合度(He)为0.432 0~0.722 2,Shannon指数(I)为0.691 9~1.507 4。9个家系都有单态位点,平均Ho为0.129 2~0.466 7,平均He为0.155 0~0.439 6,平均I为0.248 5~0.712 2。有19个位点(占35.19%)极显著地偏离Hardy-Weinberg平衡。各家系之间的遗传距离为0.109 0~1.137 2,遗传相似性系数为0.320 7~0.896 8。家系L4B46与L4B48的遗传距离最大,与D3D313的遗传距离最小。UPGMA法聚类分析显示,9个家系分为3支,L4B48单独成一支,B4D426、B4D427与D4B445聚成一支,其余家系聚成一支。该研究结果为合浦珠母贝家系选择育种的亲本选择与交配设计提供了科学依据。     

头足类耳石微化学研究进展

耳石是位于平衡囊内起平衡作用的一对钙化组织,它是头足类的加速度感应器,记录其生命周期内的生物和生态信息。随着鱼类耳石微化学研究及应用的日趋成熟与完善,头足类耳石的相应研究也逐渐兴起。目前头足类耳石微化学的研究内容主要包括无机和有机大分子、微量元素、同位素、微化学标记等方面,其中微量元素是应用研究的重点,在头足类种群识别、生活史分析及栖息环境重建等方面发挥了重要作用。分析认为,头足类微量元素在与栖息环境尤其水温关系的研究中取得了很好的结果,被认为是测定头足类生活水温的温度计。然而,涉及种群识别、生活史分析以及与盐度和食物关系的研究还不够充分,且多集中于Sr/Ca的研究。因此,建议在今后的研究中要综合多种研究方法按时间和空间序列从日轮水平分析多种微量元素的含量与变化。     

虎斑乌贼受精卵卵黄营养成分分析

本实验对虎斑乌贼受精卵卵黄的营养成分进行分析,旨在探讨其幼体的营养需求量,为其幼体配合饲料研制提供参考数据。随机选取大约800个虎斑乌贼受精卵的卵黄,采用国家标准方法测定其水分、灰分、粗蛋白质、粗脂肪、氨基酸、脂肪酸和矿物元素含量。结果表明:1)虎斑乌贼受精卵卵黄中粗蛋白质含量为76.33%(干重基础);总氨基酸(TAA)和必需氨基酸(EAA)含量分别为71.22%和32.38%(干重基础),EAA/TAA为45.46%,氨基酸中以谷氨酸(Glu)含量最高(9.97%),必需氨基酸中亮氨酸(Leu)含量最高(7.58%)。2)其粗脂肪含量12.71%(干重基础);共检出17种脂肪酸,包括8种饱和脂肪酸(SFA)、5种单不饱和脂肪酸(MUFA)和4种多不饱和脂肪酸(PUFA),SFA、MUFA和PUFA分别占脂肪酸总量的43.47%、7.54%和49.25%,其中以DHA含量最高,达32.80%,EPA含量为7.70%,DHA/EPA为4.26。3)检测出Na、K、Ca、Mg、Sr、Mn、Fe、Cu、Zn、Al和As 矿物元素,微量元素中富含Zn、Al和Fe,含量分别为 0.77、0.71和0.43 mg/kg(鲜重基础)。由此可见,卵黄具有高蛋白、低脂肪,富含n-3PUFA的特点;虎斑乌贼幼体饲料中蛋白质需求量参考值为76.33%;氨基酸需求量参考值,如赖氨酸(Lys)为5.49%,蛋氨酸(Met)为2.63%;脂肪的需求量参考值为12.71%,DHA为4.17%,EPA为0.98%;微量元素需求量参考值,如Zn为2.77 mg/kg,Cu为0.19 mg/kg(干重基础)。     

A History of the Development of Sensory Methods for the Evaluation of Freshness of Fish

It is well-established in fish technology that freshness should be measured primarily by sensory procedures, though considerable effort has been expended in looking for nonsensory alternatives. A variety of methods for sensory evaluation of freshness has been described and this historical review traces developments of these methods. Much of the source material derives from the research literature such as research journals and reports of research, and the use of sensory methods in commercial quality control has scarcely been documented. There is a brief discussion of possible future developments in sensory evaluation of freshness.     

母猪胎衣不下的病因与防治要点

猪的胎盘属于弥散型胎盘,这种胎盘的结构特点和饲养管理的不当,常常导致母猪胎衣不下发生,给生猪的生产繁殖带来极大损失。本文针对母猪胎衣不下发生病因、综合防治进行详细阐述,旨在对预防和治疗胎衣不下能有所帮助。     

Histopathology of respiratory organs of certain air-breathing fishes of India

Air-breathing fishes have evolved bimodal respiratory mechanisms for exploitation of water (through gills and highly vascularized skin) as well as atmospheric air (through aerial respiratory organs, ABO). Mucous cells in these respiratory organs of variously stressed fishes exhibit periodic fluctuations in their density and staining properties. The main types of damage in the gills include congestion of blood capillaries (BLCs), periodic lifting and sloughing of respiratory epithelia of the secondary lamellae causing haemorrhage, extensive fusion of secondary lamellae and hyperplasia of the respiratory epithelia due to uncontrolled regeneration leading to asphyxiation, altered excretion, and death of the fish. Haemolysis has also been observed following lead exposure. The damage in the ABO of Heteropneustes fossilis includes sloughing of the epithelial cells, leading to haemorrhage causing decreased red blood corpuscles density and degeneration of the secondary gill lamellae with reduced respiratory area. Subsequent hyperplasia of the respiratory epithelia and fusion of gill lamellae increase the respiratory barrier distance. The BLCs often bulge out and protrude into the lumen, bringing blood nearer to air. The ladder-like pillar cell (PLC)-BLC components of the gill lamellae frequently collapse. Damage to the ABO of Channa striata is less severe. Often haemorrhaging due to bursting of extensively stretched BLCs causes aerial respiratory failure. Chloride cells of the ABOs also show hyperplasia. While the highly mucogenic epidermis of C. striata shows less damage, the epidermis of Clarias batrachus and H. fossilis shows severe wear and tear, sloughing, and haemorrhage. Side-by-side regeneration continues, causing altered histomorphology of the epidermis. The different gland cells also show periodic fluctuations in their density and staining. The dermis also shows severe damage with loosening of their connective tissue fibres. These fibres give stronger reactions for sulfated mucin that not only retain additional water molecules for continuance of skin breathing, but also bind the toxic ambient pollutants.     

不同品系盐生杜氏藻培养技术的研究

4种不同品系盐生杜氏藻培养结果表明：常温下,A33是最适宜培养的藻种,经4天培养,藻细胞密度可达到114×104cell／ml,细胞生长率达到0．369;其次是A23、A140、A5藻种,细胞生长率分别为0．317、0．314、0．234。控温条件下,4种品系杜氏藻细胞生长速度明显增高,是常温条件下的1．2倍。     

壳聚糖投喂方式对草鱼抗饥饿胁迫能力的影响

在基础饲料中添加0.5%的壳聚糖,采用3种不同的投喂方式(方式A:连续投喂基础饲料,对照组;方式B:连续投喂添加0.5%壳聚糖的饲料,连续组;方式C:先投喂0.5%壳聚糖饲料再投喂基础饲料且每15天间隔投喂,不连续组)饲喂初始体重(19.46±0.04)g的草鱼60d后,对草鱼进行饥饿胁迫处理[各投喂方式分为投喂组(feeding,F)和饥饿组(starvation,S)],以生长、一氧化氮(nitrogenoxide,NO)含量和溶菌酶(lysozyme,LSZ)活性为指标考察壳聚糖不同投喂方式对草鱼抗饥饿胁迫处理的能力。结果显示,(1)连续组和不连续组60d时草鱼增长率和增重率显著高于对照组(P<0.05),15d饥饿处理后也呈现投喂组和饥饿组的增长率和增重率高于对照组的趋势(P>0.05);(2)对照组头肾、肝胰脏NO含量和血清、头肾溶菌酶活性饥饿组显著高于投喂组(P<0.05),连续组除头肾外NO含量和各组织溶菌酶活性饥饿组显著低于投喂组(P<0.05)或与投喂组无显著差异(P>0.05),不连续组除脾脏外NO含量和除肝胰脏外的溶菌酶活性饥饿组显著低于投喂组(P<0.05)或与投喂组无显著差异(P>0...