梅花鹿LHβ基因的克隆及序列分析

【目的】克隆梅花鹿LHβ基因CDS区并进行序列分析。【方法】采用PCR克隆测序的方法获得梅花鹿LHβ基因CDS区全序列,采用ProtParam tool等分子生物学工具对梅花鹿LHβ蛋白的分子量、等电点、二级结构、蛋白功能等进行预测,并采用MEGA 6.0软件构建进化树以确定其系统发育地位。【结果】梅花鹿LHβ基因CDS区全长462bp(GenBank序列号为KT199365),包含了ATG起始密码子和TAA终止密码子,共编码141个氨基酸,蛋白质分子量为15.17kDa,等电点为8.00。梅花鹿LHβ蛋白均位于膜外,无跨膜结构,平均疏水性(GRAVY)为0.391,蛋白功能预测显示,该蛋白最有可能为激素,这与本研究的目的基因相符。进化树分析结果表明,梅花鹿LHβ基因与山羊、绵羊和牛等反刍动物较近,其中与绵羊最近。【结论】梅花鹿LHβ基因CDS区序列与绵羊LHβ基因最近。     

梅花鹿鹿茸软骨细胞的培养及X型胶原的克隆和序列分析

型胶原是肥大软骨细胞的标志物,据GenBank中收录的人、鼠、牛、猪型胶原基因的序列,进行同源性分析,在同源性高的相对保守区域设计了1对特异性引物。建立梅花鹿鹿茸软骨细胞的分离培养方法,培养鹿茸软骨细胞。提取细胞的总RNA,以总RNA为模板,用RT-PCR方法克隆了梅花鹿的型胶原基因序列为877的片段,此片段全部位于编码区,与已报道的牛的型胶原基因的序列比较,同源性达到96%。共有35个碱基发生变异。DNAStar软件分析表明,二者推导的氨基酸序列同源性为95.5%。     

梅花鹿TGF-β1基因的克隆及序列分析

从梅花鹿的鹿茸血中提取总DNA,经PCR扩增后,对梅花鹿的TGF-61基因部分片段进行了克隆测序,序列长度为839 bp,现已将该序列提交到Gene Bank上.Gene Bank中的Blast分析表明,梅花鹿TGF-β1基因与牛同源性为92%,与羊同源性为94%.     

梅花鹿Ghrelin全长cDNA克隆及其序列分析

为获得梅花鹿Ghrelin cDNA全序列,以梅花鹿皱胃黏膜上皮组织提取的总RNA为模板,通过RT-PCR和RACE法克隆了梅花鹿皱胃中Ghrelin基因cDNA的全序列。结果表明梅花鹿Ghrelin cDNA序列全长为539bp,其中5’非翻译区(5’UTR)为46bp,3’UTR为128bp,开放阅读框(ORF)为351bp,该ORF编码116个氨基酸残基。将梅花鹿Ghrelin基因的cDNA与人和其他动物的Ghrelin相比,发现:梅花鹿Ghrelin与驯鹿、山羊、绵羊和牛的同源性达90.4%~99.1%;与恒河猴、人、猪、犬的同源性达76.6%~66.9%;与鸡和野鸽的同源性分别为36.4%和35.4%。研究表明Ghrelin的结构具有明显的种属特异性,因此Ghrelin在反刍动物体内可能有着重要的生理功能。     

桃PGIP基因及cDNA的克隆及序列分析

通过PCR扩增了桃的PGIP基因及eDNA序列,并进行了序列之间的比对及分析。结果表明,桃的PGIP基因全长1092bp,而其cDNA序列只有1045bp,PGIP基因中含有一段长147bp的内含子,且内含子符合GT-AG规律。这与其他核果类植物的PGIP基因构成基本相同。其基因序列与GenBank中已登录的3个桃以及其他核果的序列比对,其同源性达92％～99％;与苹果、梨和大桉的同源性分别为85％、84％和8．4％。     

梅花鹿TLR10基因克隆与序列分析

为系统了解梅花鹿免疫系统,用Trizo法提取梅花鹿肝脏总RNA,采用兼并引物RT-PCR方法克隆了梅花鹿TLR10基因并进行了系统的生物信息学分析.RT-PCR结果显示,dTLR10基因完整ORF区长2439 bp,编码812个氨基酸(GenBank序列号为:HQ260630).同源分析显示,dTLR10基因序列与其他物种TLR10基因高度同源,与同属于偶蹄目反刍类的牛和羊同源性高达95％以上.蛋白功能结构域分析显示,不同物种间TLR10蛋白结构域数量及分布上高度相似,蛋白三维结构预测比较显示,dTLR10蛋白胞外区结构与人类TLR10结构相似,两者均表现为经典的马蹄形结构.     

猪Mx1基因cDNA的克隆及序列分析

 为获得云南本地猪Mx1基因cDNA序列,根据GenBank中猪Mx1基因的参考序列,设计合成3对引物。以云南本地猪外周淋巴细胞为样本,采用RT-PCR方法进行分段扩增,对扩增片段进行克隆,测序分析及序列拼接。结果表明,扩增的云南本地猪Mx1基因cDNA全长2546bp,开放阅读框1992bp,编码663个氨基酸,与GenBank中他猪种Mx1基因序列对比,核苷酸序列的同源性为99.4%～99.8%,氨基酸序列的同源性为98.8%～99.5%。成功获得云南本地猪Mx1基因的cDNA序列,为研究云南本地猪Mx1蛋白的抗病毒活性及作用机制奠定了基础。     

梅花鹿鹿茸组织Anxa-1基因cDNA克隆及表达

从梅花鹿(Cervus nippon)鹿茸间充质中成功克隆出包括膜联蛋白A1(Anxa-1)基因全部编码区的c DNA序列,并结合生物学信息方法及实时荧光定量技术对该基因的氨基酸序列及不同生长时期的表达情况进行了分析。结果表明:Anxa-1基因编码346个氨基酸。经生物学信息分析,该基因编码蛋白为稳定蛋白,不具备信号肽,相对分子质量为38 830.4,理论等电点为6.17,一级结构中亮氨酸占最大比例(10.4%)。同源序列比对及系统进化树分析表明,梅花鹿Anxa-1氨基酸序列与藏羚羊(Pantholops hodgsonii)、绵羊(Ovis aries)、山羊(Capra hircus)和水牛(Bubalus bubalis)相似性较高。实时荧光定量RT-PCR分析表明,Anxa-1基因在不同生长时期鹿茸顶端间充质表达存在差异,生长前期的表达量高于中期与后期。     

梅花鹿IGF1全长cDNA克隆及在鹿茸组织的表达

为了检测梅花鹿鹿茸组织IGF1基因的mRNA表达水平,利用TRIzol试剂法分别提取鹿茸真皮、间充质、前软骨和软骨组织总RNA,逆转录合成cDNA.根据GenBank已发表的相关序列设计梅花鹿IGFI基因特异引物并克隆IGFI基因,将IGF1基因DNA序列递交GenBank,并利用相对荧光定量Real-time PCR...     

大青杨纤维素合成酶PuCesA6基因cDNA的克隆及序列分析

以大青杨总RNA为模板,通过反转录PCR获得纤维素合成酶PuCesA6基因的全长cDNA序列。序列分析结果表明：其cDNA序列全长3778bp,开放读码框序列3264bp,共编码1087个氨基酸。PuCesA6基因编码的氨基酸序列具备被子植物纤维素合酶基因的特征：锌指结构域、高变区I（HVR—I）、高变区II（HVR—II）与β-糖苷转移酶有关的保守结构域以及8个跨膜区。通过多氨基酸序列比对发现,与光皮桦B1CesA5相似度最高,为89％;其次是玉米ZmCesA8,相似度为80％,且8类CesA的锌指结构与c末端氨基酸序列高度保守。34种CesA蛋白序列的分子进化分析表明,大青杨PuCesA6蛋白与欧洲颤杨PtrCesA6蛋白亲缘关系最近,相似度达99％;和光皮桦BICe．sA5、大桉EgCesA6蛋白同聚为一类。     

猪Ob-Rb基因的克隆与分析

[目的]采用RT-PCR法克隆与分析瘦素受体06-Rb cDNA序列。[方法]从160日龄初情期的苏姜猪的下丘脑中提取组织总RNA．根据GenBank中猪06．RbmRNA全序列设计引物,用反转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）进行cDNA扩增,获得1条343bp的片段,将PCR产物克隆于pGEM—Teasy载体后进行测序分析。[结果]用紫外分光光度计检测所提取的RNA质量,0D260／OD280=1.9,证明所提RNA的质量较好,无降解和蛋白质污染;用1％的琼脂糖检测所提RNA,有3条清晰的条带,分别是28S、18S、5S,28S与18S浓度比约为2：1．说明所提的RNA的完整性较好。所获D6-RbcDNA序列用Blast程序与在GenBank中发表的猪06-Rb cDNA序列（AF092422）比较表明,其同源性为100％,说明所扩增的序列是正确的。[结论]该研究为进一步探索Ob-Rb基因组织表达和作用机理奠定了理论基础。     

“冷俊”槭查尔酮异构酶基因(CHI)片段克隆及序列分析

以槭树品种"冷俊"为试材,利用RT-PCR技术,根据GenBank中登录的相关物种查尔酮异构酶基因(CHI)的保守序列设计简并引物,提取其秋季变色期叶片中的总RNA并扩增出CHI基因的cDNA片段。测序结果表明,该片段长553 bp,编码183个氨基酸。序列分析表明,该片段与龙眼、橄榄、山茶、沙梨等的同源性在81%～90%以上,证明已成功克隆到槭树变色期叶片CHI基因的cDNA片段,在GenBank中登录号为KC121346。     

羊草ClassⅡ几丁质酶基因的克隆及序列分析

1材料与方法 1．1植物材料采摘自然生长于黑龙江省安达市（119°28’E,44°1’N）盐碱地的羊草叶片,-70℃冰箱保存。1．2总RNA的分离与eDNA文库的构建用液氮研磨叶片后,用TRIZOL Reagent（GIBCO BRL）提取总RNA,使用PolyATtract mRNA Isolation Systems（Promega）提取mRNA。然后采用Stratagene提供的cDNA合成体系合成cDNA,体外包装和扩增,构建羊草叶片的cDNA文库。     

猪伪狂犬病毒YZ株gE全基因的克隆与序列分析

为了解猪伪狂犬病毒(PRV)g E基因的遗传变异特性,根据Gen Bank已发表的PRV g E全基因序列,设计并合成1对特异性引物,对PRV YZ株进行了g E全基因的扩增、克隆及测序,并与其他参考毒株g E基因进行比较序列分析。测序结果表明,YZ株g E全基因序列由1 862bp组成,与Gen Bank已发表的13株PRV g E参考株序列同源性介于97.9%~99.9%。进化树分析表明,YZ株与目前国内流行的毒株在同一进化分支内,与国外分离株有一定差异。     

猪MAPK12基因cDNA的克隆及序列分析

目的克隆新的猪MAPK12基因全长ORF,分析其生物特性,为进一步研究该酶的功能提供信息资料。方法:以已报道的人及小鼠MAPK12基因cDNA序列为依据,利用电脑克隆策略获得的ESTs设计引物,RT-PCR技术扩增新的猪MAPK12基因ORF序列,将PCR产物直接进行序列测定。分析此蛋白的特性并预测其结构。结果分离的ORF全长1101bp,编码367个氨基酸,与人鼠氨基酸序列92%同源;利用生物信息学软件分析出此蛋白的理化特性并预测了其一级、二级和高级结构。结论研究分离的基因片段可命名为猪ERK6,通过分析,获取了该酶的基本信息特征,并与现有的报道结果进行对比分析,为进一步开展猪MAPK12基因的结构功能、表达调控的相关研究奠定了基础。     

地衣芽孢杆菌BL03脂肪酶基因LIP的克隆及序列分析

[目的]克隆地衣芽孢杆菌BL03的脂肪酶基因LIP并对其序列进行分析。[方法]以地衣芽孢杆菌BL03基因组核酸为模板,PCR扩增得到地衣芽孢杆菌脂肪酶基因,用pMD19-T载体克隆后进行PCR鉴定及序列测定和生物信息学分析。[结果]测序结果表明该片段完整开放阅读框大小为615 bp,与已发表的地衣芽孢杆菌LTP基因(GeneID:3098655)相比,核酸序列相似为99.67%;推导编码氨基酸序列相似性为99.02%。[结论]该基因的获得为其异源表达及相关研究奠定了基础。     

牦牛心脏脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因的克隆及序列分析

【目的】对牦牛H-FABP基因进行克隆和序列分析，以期为进一步开展牦牛该基因与其肉质性状的相关分析，进行分子标记辅助选择以及基因定位、表达等研究提供理论基础。【方法】用特定引物对牦牛H-FABP基因进行PCR扩增并进行T-A克隆和测序，在此基础上使用RepeatMasker、DNAMAN4.0、BioEdit4.8.10、Clustal W1.81等生物信息学软件进行序列分析。【结果】牦牛H-FABP基因(已在NCBI上登录，登录号为DQ026674)由4个外显子和3个内含子组成，CDS序列全长为402 bp，前体氨基酸数为133个。4个外显子大小分别为73 bp、173 bp、102 bp和54 bp；3个内含子大小分别为3 460 bp、1 892 bp和1 495 bp；外显子与内含子的连接区序列遵循通常的基因组成规律。外显子和内含子个数与普通牛、绵羊、山羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡、斑马鱼各物种相同。牦牛H-FABP基因序列中，重复序列所占比率为13.07%。内含子Ⅰ含有5个重复元件，包括1个SINE/Artiodactyls元件、1个SINE/MIR3元件、1个SINE/Bov-tA1元件和2个SINE/MIR元件；内含子Ⅱ无重复元件；内含子Ⅲ有3个重复元件，其中SINE/MIR元件、LINE/L2元件、SINE/Artiodactyls元件各1个。SINEs短重复序列所占比率为11.85%，哺乳动物分散性重复序列MIRs比率为6.44%。LINEs所占比率为1.22%，小于SINEs元件。其中，LINE1、BovB/Art2、L3/CR1重复元件以及LTR类反转录元件和DNA转座子元件在牦牛该基因区域中不存在。不同物种间在该基因编码区核苷酸序列和氨基酸序列上有较高的保守性。牦牛与普通牛、绵羊、山羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡、斑马鱼各物种在H-FABP基因编码区核苷酸序列上同源性大小分别为99.8%、97.8%、97.0%、92.8%、88.8%、83.3%、83.1%、76.4%、68.7%；相应的氨基酸序列间同源性大小为100%、96.9%、96.9%、92.4%、88.7%、85.7%、85.7%、77.4%、69.9%。【结论】牦牛H-FABP基因由4个外显子和3个内含子组成，其中外显子I、外显子Ⅱ、 外显子Ⅲ 和外显子Ⅳ大小分别为73 bp、173 bp、102 bp和54 bp，内含子I、内含子Ⅱ和内含子Ⅲ大小分别为3 460 bp、1 892 bp和1 495 bp。牦牛该基因区域含有较为丰富的重复序列元件且外显子与内含子的连接区序列遵循通常的基因组成规律。牦牛与普通牛、绵羊、山羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡、斑马鱼9个物种在H-FABP基因编码区核苷酸及氨基酸序列上具有较高的保守性。     

羊草Class Ⅱ几丁质酶基因的克隆及序列分析

[目的]克隆自然生长于黑龙江省盐碱地的羊草ClassⅡ几丁质酶基因并进行序列分析,为进一步研究几丁质酶基因的生物功能和应用奠定了基础。[方法]构建羊草叶片的cDNA文库,对其进行DNA序列测定和分析,并与GenBank中收录的植物几丁质酶基因序列及编码的氨基酸序列进行同源性比较。[结果]在羊草叶片eDNA文库中克隆出1条全长eDNA片段,片段长996bp,其中,可读框768bp,编码255个氨基酸。编码产物在结构上缺乏CBD和C-端延伸区,具有ClassⅡ几丁质酶的结构特征,其氨基酸序列与黑麦和小麦ClassⅡ几丁质酶具有很高的同源性;构建的pQE—LcChi2重组载体经诱导后表达出一个约27KD的蛋白,与推测的pQE-LcChi2基因编码产物大小一致。[结论]LcHi2基因在大肠杆菌中能够表达,是一个具有表达功能的基因。