青枯菌Ⅱ型分泌系统编码基因的克隆

植物青枯菌Ⅱ型分泌系统与致病蛋白的分泌密切相关.编码青枯菌(Ralstonia solanacearum)Ⅱ型分泌系统的gsp基因簇由12个基因组成,通过设计适合高GC%含量基因扩增的PCR反应体系,成功克隆了编码青枯菌Ⅱ型分泌系统的全部12个gsp基因.分别将gsp基因连接到酵母双杂交系统的诱饵及捕获载体上,构建了gsp基因诱饵库和捕获库.经序列测定证明12个gsp基因读框正确,保障了其在酵母系统中的表达.     

II型分泌系统与植物病原细菌致病性的关系

植物病原细菌通过不同的分泌途径将毒素及酶类分泌到胞外，每种途径均具有自身的特点及局限性，主要有4种类型的分泌系统。本文着重介绍II型分泌系统与植物病原细菌致病性的关系。     

导入外源基因扩大青枯假单胞菌的寄主范围

应用广谱寄主载体pLAFR1,在大肠杆菌中建立了青枯假单胞菌Pseu-domonas solanacearum两个不同生理小种T2003(在马铃薯上高发病,在花生上不致病)和T2005(在花生上高发病)的基因文库。把菌株T2005基因文库的克隆转移至T2003受体中,结果得到两个能引起花生枯死的结合子,这表明通过导入菌株T2005文库中的两个克隆,使原来在花生上不致病的菌株T2003的寄主范围扩大到在花生上能致病。     

应用抑制性差减杂交法筛选植物青枯菌致病相关基因

植物青枯菌(Ralstonia solanacearum)致病力分化菌株 Po82 兼具 2 号小种和 NPB(非香蕉致病)菌株的致病特征。为了研究该菌株致病力分化机理,本实验以 Po82 为待测菌株,构建了抑制性差减杂交文库。建库质量分析结果表明,具有较高的接头连接以及文库构建效率,插入片段平均长度为 300 bp,文库构建质量较好。对文库中随机挑取阳性克隆进行测序,共筛选出 44 个 Po82 菌株差异基因。生物信息学分析结果表明,所得差异基因主要涉及新陈代谢、转座酶、膜结构、分泌蛋白、毒力、转录因子以及未知功能等。利用基因敲除技术对其中的 c00283 基因功能进行了研究,结果表明,该基因在 Po82 菌株致病过程中起重要作用。半定量 RT-PCR 结果表明,c00283 基因在 hrp 诱导培养基中的表达情况与 hrpB 基因一致,初步确定其为Ⅲ型分泌系统效应子。基础生物学实验结果表明,该基因对 Po82 菌株的生长、生物膜形成及运动性没有影响。青枯菌 Po82 菌株抑制性差减杂交文库的构建及致病相关基因的功能分析,为后续致病力分化的分子机理研究提供基础材料。     

梅花鹿GAL-1基因编码区克隆及表达检测

鹿茸干细胞中半乳糖凝集素1(galectin-1,GAL-1)基因被发现高表达,推测其是鹿茸再生中的一个重要调控因子。为研究GAL-1在鹿茸干细胞中的表达及可能的生物学功能,本研究以东北梅花鹿(Cervus nippon)鹿茸的干细胞组织,即生茸区骨膜和角柄骨膜(致敏角柄骨膜与休眠角柄骨膜)以及对照组织面部骨膜为材料,克隆了梅花鹿的GAL-1基因CDS区序列,并对该序列进行生物信息学分析;利用Western-blot及qRT-PCR技术检测了GAL-1在鹿茸干细胞中的相对表达量。结果显示:梅花鹿GAL-1 ORF全长为408 bp(Gen Bank No.MG882483),编码134个氨基酸;相对分子质量为14.69 kD,氨基酸序列与牛(Bos taurus)、羊(Ovis aries)高度接近;主要定位于细胞外,无跨膜区,无糖基化位点,有两个磷酸化位点,二级结构主要为β-折叠与无规卷曲;三级结构与牛的三级结构相似;GAL-1在面部骨膜中表达量更高。本研究预测了梅花鹿GAL-1蛋白的结构特点,检测了GAL-1蛋白在鹿茸干细胞中的表达情况,为进一步研究鹿茸再生提供数据支持。     

青枯雷尔氏菌噬菌体研究进展

烟草等茄科植物青枯病的防治是世界性难题,传统的化学方法、轮作及种植抗病品种等都不能有效控制该病害。探索一种新型、有效的生物防治方法——噬菌体疗法成为近年来研究的热点。噬菌体应用于细菌性疾病或病害的防治可以追溯到上世纪初,然而伴随着抗生素的发现和广泛应用,噬菌体疗法在相当长的时间里被忽略。近年来,随着耐药性细菌和超级细菌的出现,利用噬菌体防控细菌性疾病和病害的研究越来越受到人们的重视。本文简单阐述了噬菌体的早期研究与复苏的历史,青枯雷尔氏菌噬菌体的获得方法、分类及潜在应用,指出了噬菌体应用研究中存在的问题,并对其以后的发展进行了展望。     

青枯菌侵染番茄幼根的扫描电镜观察

将番茄种子萌发３ｄ后的幼根浸入青枯菌悬浮液中培养,于接种后不同时间取样,利用扫描电镜观察,研究青枯菌在番茄幼根表面的吸附,繁殖及侵入。结果表明：幼根的根冠及根毛区是青枯菌吸附、繁殖的两个优先位点;新发现青枯菌侵入幼根的途径有：通过幼根表面相邻细胞间的病态间隙侵入;通过青枯菌分解破坏幼根表面细胞的细胞壁产生孔洞而直接侵入。     

甘蓝非编码RNA基因BoNR1的克隆与表达分析

非编码RNA是近年来新发现的一类在生物体内广泛存在、能够在生命活动中行使重要功能的特殊基因。根据普通白菜花粉特异的非编码RNA基因BcMF11的全长序列设计引物,通过PCR直接扩增的方法从甘蓝中克隆出BcMF11的同源基因BoNR1,该基因全长798bp,缺乏明显的开放阅读框,而且在序列中多处出现终止密码子。生物信息学...     

病原青枯菌土壤存活的影响因素研究进展

土传青枯病是一种毁灭性的细菌性病害,广泛分布于热带、亚热带和温带地区,严重威胁世界粮食安全。病原青枯菌主要从土壤中侵染作物根系,其在土壤中存活能力强,因此防治极为困难。明确病原青枯菌土壤存活的关键影响因素有助于创建高效阻控土传青枯病的技术。国内外学者在青枯菌土壤存活方面开展了大量研究,但由于影响青枯菌土壤存活的因素复杂,而相关研究多围绕单一因素展开,缺乏针对青枯菌土壤存活规律和影响因素的系统性认识。本文系统梳理了青枯菌的自身特性(基因、行为和代谢产物)及土壤生物、非生物因素对其在土壤中存活的影响,阐明了青枯菌在寄主存在时土体存活、向寄主根表方向运动迁移时根际存活以及入侵寄主根系时根表存活的主要影响因子,以期为土传青枯病的高效阻控提供参考。     

植物青枯菌aac基因突变株的构建及其致病性的测定

根据青枯菌(Ralstonia solanacearum)与群体猝灭相关aac基因序列设计PCR引物,扩增获得了aac基因,并将基因克隆到pGEM-T- easy载体中。将庆大霉素基因插入aac基因内部,使其突变,将含有庆大霉素基因的aac突变基因亚克隆进入自杀质粒pDS132中,构建成aac基因重组自杀质粒pDS-aac’-Gm。将自杀质粒电转化至青枯菌GMI 1000菌株中,通过体内同源重组,置换其野生型的aac基因。通过三步筛选法和PCR扩增鉴定,筛选获得了具有庆大霉素抗性的青枯菌aac基因突变株(GMI 1000-m)。接种番茄结果显示,青枯菌aac突变株的致病性较野生型GMI 1000明显下降。证明aac基因在青枯菌致病过程中具有重要作用。     

辣椒内生菌拮抗细菌的筛选

从广西一些县市采集辣椒茎标本，经分离得到41个细菌菌株，分属为土壤杆菌(Agrobacterium spp．)、分枝杆菌(Mycobacterium spp．)、微杆菌(Microbacterium spp．)、欧文氏菌(Eruinia spp．)和芽孢杆菌(Bacillus spp．)，其中芽孢杆菌(Bacillus spp．)为优势种群。用抑菌圈法测定对茄青枯病菌有拮抗作用的有3个菌株，用浸种法和注射法测定具内生性的有17个菌株，具内生性同时又具拮抗作用的有2个菌株。     

抗青枯病转群体感应猝灭基因烟草的培育

利用具有猝灭青枯菌群体感应信号分子功能的aac基因构建高效植物表达载体,通过农杆菌介导的方法转化烟草,获得了卡那霉素抗性植株57株。经PCR及RT-PCR检测,筛选得到30株阳性转基因再生苗,并证实了目的基因已经整合到烟草基因组中,且在转录水平上得到表达。转基因植株苗期抗青枯病试验表明,16天后转基因烟草较对照植株病情指数降低了51,相对病情指数为56.5％。     

Suppression of Ralstonia solanacearum in soil following colonization by other strains of R. solanacearum

The effect of prior colonization of a sterile loam soil and a sterile clay loam soil by individual soil bacteria on the subsequent growth of a bacterial wilt pathogen Ralstonia solanacearum YU1Rif43 (tRNA type III: Seal et al. 1992: Appl. Environ. Microbiol., 58, 3759–3761) was investigated. Various strains, belonging to the same type, the same species, the same genus, Gram-negative, Grampositive, or fungi, were used. The degree of suppression of the growth of R. solanacearum YU1Rif43 was markedly different depending on the species that had previously colonized the soil, hereafter referred to as priorcolonists. All the strains belonging to R. solanacearum type III suppressed the growth of R. solanacearum YU1Rif43 markedly, while strains of R. solanacearum type I and type II showed a moderate suppressive effect on R. solanacearum YU1Rif43. The suppressive effect of the strains belonging to species other than R. solanacearum, including fungal strains, was relatively limited, or some strains did not show any suppressive effect. The production of bacteriocin did not appear to be related to the strong suppressive effect of the R. solanacearum type III strains. Possible mechanisms for the suppressive effect of priorcolonists on R. solanacearum YU1Rif43 are discussed in relation to nutrients and physical sites in soil available for growth.     

酿酒葡萄分支酸合成酶基因（VvCS）的克隆与表达分析

本研究以酿酒葡萄（Vitis vinifera）品种赤霞珠（Cabernet Sauvignon）及霞多丽（Chardonnay）为试材,采用in silico克隆和分子克隆相结合的策略,从果实中克隆到分支酸合成酶基因,命名为VvCS。该基因的cDNA编码区全长1312bp,编码436个氨基酸残基,预测其编码蛋白质分子量为46.9kD,等电点为7.8;生物信息学分析显示VvCS的DNA全长7117bp,包含13个外显子和12个内含子,定位于葡萄的第13号染色体上。VvCS编码的蛋白与其它植物来源的分支酸合成酶在氨基酸水平上的同源性为75%左右;实时荧光定量PCR分析表明VvCS在葡萄果实、茎、叶和叶柄组织中均有表达,且在果皮、果肉和种子中的表达变化趋势相似,与盛花后5周的果实相比,盛花后11周果实各部位中VvCS表达丰度均有不同程度增加。     

基于BOX-PCR和REP-PCR技术青枯雷尔氏菌遗传多样性分析

青枯雷尔氏菌(Ralstonias olanace arum)能够对许多重要作物引起致命性萎蔫病害,广泛分布在热带、亚热带以及温带地区.研究青枯雷尔氏菌的遗传多样性对于了解青枯病的发生和流行具有十分重要的意义.本研究利用青枯雷尔氏菌特异性引物鉴定84株来自福建地区不同寄主的青枯雷尔氏菌,结果表明,这些菌株均在504 bp位置出现特异性条带.同时采用BOX插入因子PCR(BOX-PCR)和重复基因外回文序列PCR(REP-PCR)对这些菌株进行基因多样性研究,基于它们所扩增出的基因指纹图谱表明,BOX-PCR扩增出19条特异性条带,REP-PCR扩增出20条特异性条带.系统聚类结果表明,青枯雷尔氏菌的遗传分化与寄主作物和地理来源都存在相关性,其中,寄主植物是在遗传差异中起主导作用.进一步分析可知,地域性的差异主要由BOX-PCR提供,寄主间的差异主要由REP-PCR提供.不同地理来源的青枯雷尔氏菌在BOX-PCR中可扩增出各自特异性条带,在REP-PCR中同样具有与各个寄主相对应的特异性条带,利用这些特异性条带可以很容易区分不同寄主以及来源的青枯雷尔氏菌.BOX-PCR和REP-PCR多态性分析技术可为我国青枯雷尔氏菌基因多样性的研究提供另一条途径.     

小桐子过氧化物酶73基因的克隆及表达分析

过氧化物酶73属于植物特异Ⅲ型过氧化物酶家族成员,通过消除活性氧、酚类及胺类等毒害作用参与植物多种抗逆性形成过程。为探索小桐子POD73基因对低温环境的响应机制,本研究基于小桐子低温锻炼转录组数据,以茎为材料,采用RT-PCR技术克隆到小桐子过氧化物酶73基因(Jc POD73)的全长c DNA序列。结果表明,该c DNA全长1 516 bp,含有完整的开放阅读框(987 bp),编码328个氨基酸,分子量为35.8 k Da,理论等电点为9.16。其推导的氨基酸序列及空间结构,包含该家族典型的2个Ca2+结合基序以及血红素活性中心。半定量RT-PCR表达分析显示,Jc POD73在小桐子各组织中都有表达,但表达水平具有组织特异性,其中在根与茎中表达量较高,且受低温诱导表达显著,而在叶中表达量相对较低。本研究为进一步阐明小桐子POD73基因的功能及其在小桐子遗传改良中的应用奠定了基础。     

大肠杆菌天冬氨酸激酶lysC基因的克隆及定点突变

以大肠杆菌Ｋ１２菌标总ＤＮＡ为模声,利用技术扩增了编码天冬氨酸激酶的ｌｙｓＣ基因,序列分析结果表明,目的含有１３５０个核苷酸（包括起始密码和终止密码）,与文献报道相比,核苷酸序列同源率为９９．６％,推测的氨基酸序列与报道的相比,同源率为９９．３％,利用定点突变方法,将核苷酸序列的第１０５５位的Ｃ变成Ｔ,从而引起第２３５２位的苏氨酸变为异亮氨酸,以改变天冬氨酸激酶对赖氨酸的馈抑制的敏感性。     

基于ITS序列和RAMS标记分析青枯雷尔氏菌的遗传多样性*

应用ITS序列和RAMS技术对福建省不同地域,不同寄主作物的青枯雷尔氏菌进行遗传多样性研究。结果表明,供试的21株青枯雷尔氏菌的ITS区序列有3种类型,这3种类型菌株的ITS序列只有1-2个碱基的差异,与参比菌株GMI1000的ITS区序列或者相同或者有1-2个碱基的差异。在此基础上,利用RAMS技术进一步分析表明,供试的青枯雷尔氏菌及参比菌株GMI1000的基因组DNA间存在丰富的多态性。聚类结果显示,供试菌株可聚为3个类群,同一寄主作物的菌株聚在同一类群中,同一地理来源的菌株聚在同一亚类群中,说明青枯雷尔氏菌的遗传分化与寄主作物和地理来源都存在相关性,与寄主作物的关系更密切。     

插入序列ISRso21在青枯雷尔氏菌中的分布以及插入位点多态性分析

插入序列(insertion sequence,IS)元件可以插入到基因或DNA序列,其可能在生物体进化中起着重要的作用。ISRso21是在青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)FJAT-1458菌株中发现的一个新的插入序列。根据序列分析可知,该插入序列是属于ISL3家族中的一个成员。本研究发现,福建闽北地区菌株ISRso21的阳性率高于其他地区的趋势,不同地区的青枯雷尔氏菌ISRso21的分布有显著性差异,ISRso21的分布可能与菌株分离个体的地理来源有关。不仅如此,由于ISRso21在青枯雷尔氏菌插入位点的不同,从而导致青枯雷尔氏菌致病性的差异。研究表明,由于ISRso21的插入导致表现型转换系统转录调控因子A(phc A)的重排可能在青枯雷尔氏菌的致病性起着极其重要的作用。在所有菌株中,ISRso21在phc A基因上游中插入的检出率达到4.71%,其中无致病力菌株和强致病力菌株中的检出率分别为28.57%和0.00%。而ISRso21在二氨基庚二酸脱羧酶基因中的插入可能是为了更好地适应环境。ISRso21在不同致病性青枯雷尔氏菌中的插入位点的研究,可能为揭示青枯雷尔氏菌致病性机制提供新的研究途径。