来源于桃和苹果的苹果褪绿叶斑病毒的部分分子生物学特性和cp基因的原核表达

 从桃和苹果上分离得到苹果褪绿叶斑病毒ACLSV-HBP和ACLSV-C2个分离物,采用RT-PCR法进行扩增,所获扩增片段经序列测定,其全长分别为1768nt(ACLSV-HBP)和1751nt(ACLSV-C)。这2个分离物扩增片段全长的同源性为83%,mp基因片段核苷酸和推导编码氨基酸序列同源性分别为82.6%和87.1%;cp基因均由582nt组成,其核苷酸和推导编码氨基酸序列同源性分别为87.8%和95.9%。将2个分离物的cp基因与已报道ACLSV分离物进行序列同源性比较,结果显示ACLSV-HBP与SX/2的cp基因核苷酸序列及推导编码氨基酸序列同源性最高,分别为94.0%和96.4%。将ACLSV-HBP分离物的cp基因克隆到原核表达载体pGEX-KG,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,SDS-PAGE分析表明,融合蛋白大小约为46kDa。Western-blot分析表明,该基因在大肠杆菌内得到高效表达,融合蛋白具有抗原性。     

禾谷镰孢菌γ-微管蛋白基因克隆及其与多菌灵抗药性关系分析

 根据禾谷镰孢菌参考菌株NRRL31084(PH-1)的γ-微管蛋白基因核苷酸序列设计5对引物,采用PCR方法从禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)对多菌灵(MBC)的敏感菌株、室内诱导及田间多菌灵抗药性菌株中分段扩增测序,获得了γ-微管蛋白基因全序列。该基因全长1 868bp,含有5个内元,编码一含493aa的多肽;与PH 1的γ-微管蛋白基因核苷酸序列同源性99%,存在10个差异核苷酸,与所编码的氨基酸序列同源性100%;与其它7种真菌的γ-微管蛋白基因所编码的氨基酸序列同源性为31%~72%。中国的2个敏感菌株和4个抗药菌株的γ-微管蛋白基因序列完全相同,认为多菌灵抗药性与该微管蛋白变异无关。     

禾谷镰孢菌γ-微管蛋白基因克隆及其与多菌灵抗药性关系分析

根据禾谷镰孢菌参考菌株NRRL31084(PH-1)的γ-微管蛋白基因核苷酸序列设计5对引物,采用PCR方法从禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)对多菌灵(MBC)的敏感菌株、室内诱导及田间多菌灵抗药性菌株中分段扩增测序,获得了γ-微管蛋白基因全序列.该基因全长1 868 bp,含有5个内元,编码一含493aa的多肽;与PH-1的γ-微管蛋白基因核苷酸序列同源性99%,存在10个差异核苷酸,与所编码的氨基酸序列同源性100%;与其它7种真菌的γ-微管蛋白基因所编码的氨基酸序列同源性为31%～72%.中国的2个敏感菌株和4个抗药菌株的γ-微管蛋白基因序列完全相同,认为多菌灵抗药性与该微管蛋白变异无关.     

植物内生蜡样芽孢杆菌M22 Mn-SOD基因的克隆及在大肠杆菌中表达

 通过PCR和反向PCR,从蜡样芽孢杆菌M22中扩增到2条长度为1 322 bp和1 395 bp的基因片段(GenBank登录号为AY540749和AY468485),分别含657 bp和627 bp的开放阅读框,各自编码218个和208个氨基酸残基的功能蛋白。2个蛋白氨基酸序列同源性为46%,均不含信号肽。与其它锰超氧化物歧化酶序列同源性高,保守氨基酸残基类型及位置与其它Mn-SOD相同,可确定2个基因均为蜡样芽孢杆菌Mn-SOD基因。分别将2个基因的开放阅读框插入载体pET-22b (+)构建表达质粒pET-sodA,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达。SDS-PAGE显示融合蛋白相对分子质量分别为28 kD和27 kD。转入pET-sodA的SOD缺陷型大肠杆菌QC779转化子恢复在10μmol/L paraquat的LB平板上生长的能力。活性电泳显示,M22的Mn-SOD在QC779中成功表达。     

松材线虫Hsp70基因的克隆与原核表达

 热激蛋白70(Hsp70)是已知热休克蛋白家族中最重要的-种, 它在细胞内的大量表达可以明显改善细胞的生存能力, 提高对环境胁迫或伤害的耐受性。采用RACE-PCR技术, 从松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)中克隆了Hsp70基因的全长cDNA序列(共2 061 bp)(GenBank登录号为:DQ785812)。其编码-个分子量为70 kD的642个氨基酸的蛋白序列, 含有3段Hsp70家族的签名序列。同源性分析表明, 氨基酸序列与其它真核生物的Hsp70序列具有很高的相似性, 并与秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)热激蛋白70家族中的hsp-1基因编码的氨基酸序列更为相似。因此, 将克隆的松材线虫Hsp70基因命名为Bx-hsp-1。构建了-个原核表达载体Bx70pEASY-E1, 当IPTG终浓度为0.4~0.8 mmol/L时, 能诱导表达融合蛋白。Bx-hsp-1基因的克隆和表达, 将为松材线虫的生态适应性机理研究奠定基础。     

Harpin蛋白基因的克隆及序列分析

 以梨火疫病细菌基因组DNA为模板,通过合成5'-端及3'-端一对特异引物,利用多聚酶链式反应(PCR)扩增获得harpin蛋白基因。将其克隆到E.coli质粒上进行序列分析。结果表明:基因由1155个核苷酸组成,编码385个氨基酸残基组成的多肽。与发表序列相比较,核苷酸序列及推导出的氨基酸序列的同源性分别为99.31%和98.96%。     

大麦黄矮病毒PAV中国分离物外壳蛋白基因的克隆及同源性分析

 大麦黄矮病毒PAV株系由麦长管蚜和禾谷缢管蚜传毒。本研究通过RT-PCR、克隆和序列测定后,确认所得到的我国小麦PAV分离物的外壳蛋白基因片段由600个核苷酸组成,编码199个氨基酸。序列同源性比较结果显示,与BYDV的其它株系典型分离物的外壳蛋白基因同源性最高为74.5%,而与国外发表的PAV 8个分离物的CP基因核苷酸同源性为81%左右,且同源性比较的分值也较其它株系高。氨基酸序列的比较中,仅在46到60位氨基酸差别较大。     

甘薯褪绿斑病毒外壳蛋白的分子变异及其特异抗血清制备

 甘薯褪绿斑病毒(Sweet potato chlorotic fleck virus,SPCFV)是侵染甘薯的主要病毒之一。本研究利用RT-PCR方法克隆了SPCFV中国4个分离物的外壳蛋白(CP)基因。序列分析表明,cp基因全长900 bp,编码299个氨基酸残基。4个分离物cp基因的核苷酸序列一致性为78.3%～89.9%,推导的氨基酸序列一致性为91.3%～95.7%,存在较大的分子变异。不同分离物CP氨基酸序列N末端的第3-32位氨基酸为多变区。将四川分离物的cp基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,cp基因在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了高效表达。以表达的蛋白为抗原免疫家兔,制备了SPCFV CP的特异性抗血清。ACP-ELISA检测结果表明,制备的抗血清效价达1∶128 000,可用于田间甘薯样品的检测。     

小麦黄色花叶病毒不同分离物外壳蛋白(CP)基因序列的比较分析

 核苷酸序列分析结果表明,小麦黄色花叶病毒(W YMV)不同分离物的外壳蛋白基因存在一定的差异。邓州分离物CP基因在其31~33nt处均缺失了3个核苷酸,其余分离物与潢川分离物及日本分离物长度一致,均为882nt。不同分离物CP基因核苷酸序列同源性为97.3%~98.9%,由此推导的氨基酸序列同源性为97.6%~99.3%,外壳蛋白N末端的110个氨基酸和C末端的55个氨基酸在各个分离物间是高度保守的。潢川分离物有5个氨基酸与其它5个分离物明显不同。WYMV不同分离物外壳蛋白序列分析结果进一步确认了WYMV与WSSMV为Bymovirus属的2种不同病毒。     

Q型烟粉虱芳香基硫酸酯酶B基因的克隆及表达分析

为明确烟粉虱Bemisia tabaci取食感染番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)的番茄植株后,其体内的芳香基硫酸酯酶B基因(arylsulfatase B,ARSB)是否能够做出应答反应,基于Q型烟粉虱基因组数据克隆得到ARSB基因cDNA全长,采用生物信息学方法分析其序列特征,并通过实时荧光定量PCR技术测定ARSB基因在Q型烟粉虱不同发育阶段、不同组织及携带TYLCV前后的表达量变化情况。结果显示:Q型烟粉虱ARSB基因的cDNA全长为1 731 bp,编码576个氨基酸,分子量为64.89 kD,具有ARSB的保守结构域。ARSB基因在Q型烟粉虱不同发育阶段均有表达,在卵期表达量最高,成虫期表达量最低;该基因在Q型烟粉虱头胸部的表达量显著高于腹部;Q型烟粉虱获取TYLCV 72 h后其体内ARSB基因表达量显著提高。表明ARSB基因在Q型烟粉虱不同龄期、不同组织内存在差异表达,并可能参与Q型烟粉虱对TYLCV的响应和传毒过程。     

玉米矮花叶病毒北京分离物复制酶基因的克隆及序列分析

 以MDMV北京分离物RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增了含复制酶(NIb)基因的DNA片段,将其克隆到p UC18载体上并进行序列分析。结果表明:NIb基因由1563个碱基组成,编码521个氨基酸并含有高度保守基序GDD。NIa/NIb和NIb/CP交界处的蛋白酶切割位点分别为Q/C和Q/S-NIb基因(北京分离物)在碱基数目上与保加利亚分离物完全一致,二者的核苷酸及氨基酸序列同源性分别为70.6%和76.6%,而与SCMV-SC的核苷酸及氨基酸序列同源性则高达81.3%和92.1%。     

多花黑麦草斑驳病毒基因组克隆与序列分析

 多花黑麦草斑驳病毒(Ryegrass mottle virus,RGMoV)属南方菜豆花叶病毒属,是牧草病毒病的重要病原。利用反转录技术合成和扩增了RGMoV RNA的cDNA。将cDNA克隆在载体pUC18上,对RGMoV的基因组RNA作序列分析。RGMoV RNA是一个正义单链RNA分子,全长4 210个核苷酸,包含4个开放阅读框架5'非翻译区包含99个核苷酸,3'非翻译区有198个核苷酸。RGMoV ORF的结构和南方菜豆花叶病毒以及水稻黄斑病毒的结构一样。ORF₁编码1个14.6 kD的蛋白质,这个蛋白质的功能还不清楚;ORF₂的产物由947个氨基酸组成,分子量为103.6 kD;ORF₃编码1个19.8 kD的蛋白质;ORF4编码1个25.6 kD的蛋白质,通过N末端氨基酸分析,确认ORF4为病毒外壳蛋白。RGMoV RNA的全序列以及染色体结构已被GenBank登录,登录号分别为AB040446和NC_003747。     

辣椒轻斑驳病毒湖南分离物的全基因序列测定及结构分析

采自湖南地区的辣椒轻斑驳病毒Pepper mild mottle virus(PMMoV)样品经单斑分离后,根据已经报道的PMMoV序列基因保守区设计6对简并引物,采用片段重叠法和RACE方法扩增、克隆获得一个全长为6 356bp的湖南分离物(PMMoV-HN1,登录号:KP345899)全基因组序列,编码4个蛋白,分别为126kD蛋白(70~3 423nt)、183kD蛋白(70~4 908nt)、28kD蛋白(4 909~5 682nt)和17.5kD蛋白(5 685~6 158nt),5′-非编码区(5′-UTR)和3′-非编码区(3′-UTR)分别含有69和198个碱基,其中5′-UTR存在一个序列为m7G5′pppG的甲基化核苷酸帽子结构。一致性分析发现PMMoV-HN1与PMMoV其他分离物的核酸一致性为94%~99%,编码的氨基酸一致性为94%~99%。全基因组序列系统进化分析表明PMMoV-HN1分离物与中国首次报道的PMMoV-CN分离物亲缘关系最近。本研究是国内报道的第二例PMMoV全基因组序列。     

枯草芽孢杆菌XF-1中脱乙酰几丁质酶在大肠杆菌中的表达及其抑茵活性

根据脱乙酰几丁质酶同源基因序列设计引物,扩增、克隆和测序了枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis菌株XF-1的脱乙酰几丁质酶基因（CSrlo该基因编码区为834bp,编码由277个氨基酸组成的约30kD的蛋白质,其基因序列与枯草芽孢杆菌菌株B168的脱乙酰几丁质酶基因的相似性达到99％,氨基酸序列相似性为98％,在第19、47、60、256和257位的氨基酸发生了变化,分别由异亮氨酸代替了菌株B168脱乙酰几丁质酶中的甲硫氨酸、缬氨酸代替了谷氨酸、苏氨酸代替了异亮氨酸、天冬氨酸代替了谷氨酸、赖氨酸代替了天冬酰胺。菌株xF一1对稻瘟病菌Magnaportheoryzae和芸薹根肿菌Plasmodiophorabrassicae有抑制作用,而菌株B168没有。菌株xF－1和B168的CSFI基因在大肠杆菌Escherichiacoli中的表达产物均具有脱乙酰几丁质酶活性,但前者的表达产物对稻瘟病菌及芸薹根肿菌具有抑制作用,而后者没有。表明脱乙酰几丁质酶是xF－1抑制根肿病作用机制之一,且上述5个氨基酸替代可能与抑菌机制有关。     

引起玉米粗缩病的水稻黑条矮缩病毒河南分离物的分子特征

<正>目前已报道的造成玉米粗缩病的病原有3种,分别是玉米粗缩病毒(Maize rough dwarf virus,M RDV),水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)[1]。我国于1954年在新疆和甘肃发现该病,上世纪60年代曾在中东部夏玉米区流行,至70年代以来各玉米产区已陆续发生[2],近年来在黄淮海夏玉米区特别是套播或晚春播、早夏播玉米田发生危害严重。     

谷胱甘肽S-转移酶基因在B型烟粉虱寄主转换中的差异比较

烟粉虱是一种世界性的重大农业害虫,其寄主范围十分广泛,对农作物危害严重。为研究GST基因家族在B型烟粉虱寄主转换中的响应机制,本文首先通过分析B型烟粉虱寄主转换后,23个GST基因表达量的变化,然后利用转录组数据、PCR、克隆、测序得到GST7基因全长,最后对GST7基因进行生物信息学分析。结果表明:烟粉虱GST7和GST13在辣椒寄主上的表达量与在原始寄主棉花上有显著差异,且GST7表达量上升了2.31倍;生物信息学分析结果显示GST7基因的开放阅读框全长657bp,编码219个氨基酸,没有信号肽,没有跨膜结构,理论等电点pI为4.81,其分子量为25.07kD,系统发育树分析表明GST7基因属于Delta亚家族。本研究发现GST7基因在烟粉虱适应不适寄主植物中起到一定作用,为将来RNAi研究GST7基因的功能奠定了基础。     

烟粉虱MEAM 1隐种主要内共生菌的定位和分布

烟粉虱MEAM 1隐种是一种重要的世界性入侵害虫,共生菌在其种群入侵和扩张中起着不可忽视的作用。本研究采用荧光原位杂交技术(FISH),明确其携带的初生共生菌(Candidatus Portiera aleyrodidarum)和次生共生菌(Candidatus Hamiltonella defensa和Rickettsia sp.)在不同发育阶段虫体中的定位和分布。结果显示,烟粉虱MEAM 1隐种卵、若虫和成虫3个阶段均携带3种共生菌,Portiera和Hamiltonella菌集中分布于含菌细胞中,其中Hamiltonella呈环形包裹于含菌细胞周边;Rickettsia既在菌胞中呈“集中”分布,也“随机”分布于虫体其他部位或器官。上述结果明确了这3种共生菌在MEAM 1烟粉虱各个发育阶段的分布特征,同时证明3种共生菌均能通过烟粉虱雌虫垂直传播,为进一步揭示内共生菌在烟粉虱入侵过程中的作用打下基础。     

甘蔗黄叶病毒复制酶基因的克隆及序列分析

 The gene of RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) was cloned by RT-PCR from Sugarcane yellow leaf virus-Fuzhou isolate (CHN-FJ1) and then cloned into pMD18-T vector. The sequence showed that the fragment comprised 1 212 nucleotides including part gene of ORF1 and ORF2. The ORF2 was involved the RdRP gene consisted of 995 nucleotides and encoded putative protein of 331 amino acids. Compared the nucleo-tide sequence and encoded putative protein of CHN-FJ1 with the other isolates from different countries, they shared the homology above 92.0%. Phylogenetic tree suggested that the sixteen isolates were classified into four types according to the amino acid sequence of the RdRP. One of the groups contained CHN-FJ1 and the other isolates from China, American, Brazil, Australia and Colombia;however, there was the closest relation between CHN-FJ1 and BRA-YL1 isolate from Brazil.     

抗氰戊菊酯棉铃虫细胞色素P450 CYP6B7基因的克隆及分析

以抗氰戊菊酯棉铃虫六龄幼虫中肠组织总RNA为模板,采用特异性引物,通过对反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)的条件进行不断探索和优化,成功克隆出全长为1 557 bp的基因片段(GenBank登录号DQ497428)。该片段包括一个完整的开放阅读框架(1 515 bp)及5'端的42个碱基,编码504个氨基酸残基。与国外报道的细胞色素P450 CYP6B7基因(GenBank登录号AF031468)的核苷酸、氨基酸同源性分别为97.75%和98.81%,为CYP6B7的等位基因。Northern杂交分析表明,抗性品系棉铃虫中肠组织中CYP6B7 mRNA的表达量明显高于敏感品系的,初步表明CYP6B7在棉铃虫对氰戊菊酯的抗药性中起着重要作用。     

黏虫MagR和Cry2基因的时空表达分析

为了明确黏虫MagR、Cry2基因在定向行为中的作用,本研究采用基因序列分析及实时荧光定量技术,研究了黏虫MagR、Cry2基因的基因序列特征及其表达模式。结果表明,黏虫MagR基因编码131个氨基酸,蛋白分子量为14.17 kD,等电点为9.3,具有多个铁硫簇结合位点;黏虫Cry2基因编码757个氨基酸,蛋白分子量为87.04 kD,等电点为8.73。羽化后不同日龄迁飞型黏虫成虫各部位Cry2基因表达量存在显著差异。羽化后3 d成虫头部和胸部Cry2基因表达量显著高于其他日龄。迁飞型黏虫成虫羽化后不同日龄各部位MagR的表达量具有显著性差异;5 d时各部位的表达量达到最高,各日龄头部和胸部的表达量均显著高于腹部。