三种ELISA方法与荧光抗体病毒中和试验检测狂犬病抗体的一致性分析

为筛选合适狂犬病抗体检测的试剂盒，该研究以荧光抗体病毒中和试验（fluorescent antibody virus neutralization FAVN）方法为参照，与3个ELISA试剂盒方法进行比对，进行一致性分析，并计算了三种试剂盒的敏感性和特异性。结果显示：三种不同的试剂盒中，试剂盒A与FAVN一致性最好，Kappa值为0.605，有较高的一致性，符合率为86%；试剂盒B次之，Kappa值为0.485，为中度一致，符合率为80%；试剂盒C与FAVN的一致性最差，Kappa值为0.310，符合率也最低，为74%。在敏感性和特异性方面，试剂盒A的敏感性最高，为92.1%，试剂盒B的特异性最高，为72.7%。本研究为临床上科学的筛选试剂盒提供了依据。     

测定狂犬病病毒中和抗体的微量免疫酶试验

在Kazuakz等报道的微量免疫酶技术(MIET)的基础上,以健康细胞对照孔OD值均数加3倍标准差作为间接ELISA判定标准,进而建立了求中和剂量的新方法.通过用中和99%病毒的一致判定标准同经典的小鼠中和试验(MNT)比较看,本试验所建立的方法可代替MNT.     

狂犬病病毒中和抗体ELISA技术的建立

将狂犬病病毒(RV)糖蛋白(G蛋白)中和抗原表位串联表达的重组蛋白作为抗原,建立了检测RV中和抗体的间接ELISA技术。结果表明,最佳抗原包被量为2μg/孔,被检血清最佳稀释倍数为1:200。该方法与快速荧光灶抑制试验(RFFIT)的阳性符合率为88%,阴性符合率为96%。特异性试验表明,该抗原不与犬腺病毒I型、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬冠状病毒阳性血清发生交叉反应,具有良好的特异性。板内和板间重复性试验的平均变异系数分别为2.7%和4.2%,具有良好的重复性,为动物RV中和抗体检测提供了简单快捷的检测方法。     

狂犬病病毒糖蛋白膜外区表达及中和抗体间接ELISA检测方法的建立

采用RT-PCR方法克隆了狂犬病病毒CVS株G蛋白基因编码区,进而将完整编码区和膜外区编码基因分别克隆于pET-32a,将其中含膜外区编码基因的重组质粒pET-32a-PG转化BL21(DE3),经1.0 mmol·L-1IPTG诱导,外源基因获得高效表达.通过Western-blot以及ELISA试验证明表达产物具有良好的反应原性.以纯化后的表达产物作为抗原包被酶标板,用已知中和抗体效价的OIE参考血清对该方法进行了标准化,建立了检测狂犬病病毒中和抗体的间接ELISA方法.结果表明,抗原的最佳包被量为3.74 μg,血清的最佳稀释度为1:100,待检血清阳性临界值为0.50.用此方法检测了418份血清样品,并与荧光抗体病毒中和试验(FAVN)方法进行了比较,符合率为98.61%.     

表达绿色荧光蛋白的重组人偏肺病毒的构建及其中和抗体检测方法的应用

人偏肺病毒(hMPV)是最新发现的与呼吸道疾病有关的病原体.为构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的B型重组hMPV,本研究利用反向遗传学技术,以表达EGFP的hMPV NL/1/99株全长cDNA质粒重组pPS-hMPV-EGFP,及其4种辅助重组质粒pCITE-N、pCITE-P、pCITE-L、pCITE-M2.1为基础,共转染BHK-21细胞进行重组病毒的拯救.鉴定结果表明拯救的重组病毒rhMPV-NL-EGFP高效表达外源基因EGFP.rhMPV-NL-EGFP与亲本病毒株具有相似的生物学特性,生长滴度可达106.7 TCID50/mL.rhMPV-NL-EGFP在细胞中连续传代10代仍然维持外源基因的高效和稳定表达,病毒滴度于室温条件下可维持长时间稳定.分别利用亲本病毒株和重组病毒rhMPV-NL-EGFP进行免疫小鼠血清中和抗体检测,结果显示两种方法具有较好的相似性(p＞0.05).本研究为病毒中和抗体的检测提供了更为快捷的新方法,同时为hMPV感染发病机制及疫苗研究奠定了基础.     

狂犬病荧光抗体技术研究

用狂犬病巴黎株固定毒免疫家兔制造抗血清。应用ＱＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ５０层析法分离提纯抗血清ＩｇＧ，用异硫氰酸荧光素（ＦＩＴＣ）标记，成功的制造了狂犬病荧光抗体（ＲＶＦＡ）。此标记物对细胞培养中和脑组织中的狂犬病病毒（ＲＶ）具有高度的特异性。于接毒感染的细胞浆内，及实验感染动物小白鼠、家兔脑组织中的神经元细胞浆内及其轴突内，可见到数量不一的斑点状的特异性荧光小体－ＲＶ的聚集体。     

我国部分城乡犬狂犬病中和抗体水平调查

以国际兽疫局(OIE)推荐的荧光抗体病毒中和试验(FAVN)对随机采自广东、河北、北京等地区的573份犬血清进行了狂犬病病毒中和抗体效价的测定,以确定犬群中狂犬病的免疫状况。结果显示,在不同地区或不同城市的动物防疫区域中,犬体内狂犬病病毒中和抗体平均水平存在着明显的差异,城市犬的中和抗体水平较高,有的中和抗体保护水平(0.5IU/mL)阳性率高达100%,少数则达不到保护水平,不同防疫区域狂犬病中和抗体水平为(0.08±0.03)~(4.39±1.45)IU/mL,平均保护水平阳性率为46.3%;乡村看家犬病毒中和抗体水平普遍较低,大部分犬体内无中和抗体,只有个别犬体内存在水平较低的中和抗体,平均保护水平阳性率为1.8%。     

表达增强绿色荧光蛋白重组水疱性口炎病毒印第安纳株的构建

通过负链RNA病毒反向遗传操作技术,成功救获了表达增强绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的重组印地安纳株水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus Indiana serotype)、救获的重组病毒保持了野生型VSV高滴度生长特性,细胞连续传代10次仍保持GFP的稳定表达及生物学特性不变。本研究为VSV作为新型重组活病毒载体疫苗和肿瘤治疗载体研制及基础病毒学相关研究提供了理想的技术平台。     

狂犬病病毒特异性抗体保护致死性疾病攻击的效价测定

抗体在对抗多种感染源中扮演重要角色。中和作用是抗体最主要的功能,这些多功能蛋白的Fc及补体依赖活性是其在提供对抗多种病毒感染的保护能力中最关键的。体内抗病毒的保护作用很复杂,其中病毒中和作用(抗体使病毒失去感染力的能力,通常在体外进行)很重要,通常它仅仅占保护作用的一部分。荧光焦点抑制试验仍是检测狂犬病病毒中和抗体的金标准。除了中和试验,抗体的狂犬病病毒特异性抗原结合活性也可以通过酶联免疫吸附试验及其他备用方法进行测定。对于任何一种疾病,选择适当的试验测定抗体滴度,验证检测及如何进行判定是重要的考率因素。在替代保护分析试验和结果判断方法的选择中,必须仔细考虑检测狂犬病病毒抗体的单一实验室方法的固有局限性及所选方法的有效性。     

The modification of fluorescent antibody virus neutralization (FAVN) test for the detection of antibodies to rabies virus

The fluorescent antibody virus neutralization test (FAVN) for the detection of antibodies against rabies virus was modified by using a monoclonal anti-rabies antibodies and peroxidase anti-mouse conjugate instead of a fluorescent anti-rabies conjugate. The results were read on an automatic multi-channel spectrophotometer. A total of 182 serum samples from dogs were tested by both the original and modified FAVN methods and the results were compared. Good correlation was found between the two tests. Practically, the modified FAVN test was quicker and could be used for a larger number of samples.     

Production of a transgenic pig expressing human albumin and enhanced green fluorescent protein

We introduced a fusion gene of human albumin and enhanced green fluorescent protein (EGFP) into porcine oocytes using the sperm vector method, and produced a piglet that showed clear expression of GFP in the hooves and skin. PCR and Southern blotting analysis of genomic DNA extracted from the piglet's tissues, including the liver, showed that the tissues carried the transgene. RT-PCR analysis demonstrated that both the human albumin and EGFP genes were expressed in the tissues. The fact that human albumin gene was integrated and expressed in the liver of the transgenic pig opened a way for us to achieve our goal, which was the use of transgenic pigs for the bioartificial liver support system.     

表达狂犬病病毒糖蛋白的复制缺陷型重组腺病毒的构建

利用大肠杆菌内质粒间同源重组的方法,将狂犬病病毒G基因插入腺病毒基因组的E1基因区,构建了带有狂犬病病毒G基因的重组腺病毒质粒。重组质粒经Pme酶切,线性化后转染293细胞,成功获得了均一的复制缺陷型重组腺病毒。荧光显微镜下能观察到重组腺病毒GFP报告基因的表达。用PCR方法证实了重组腺病毒基因组中含有G基因,RT-PCR方法可检测到G基因的转录产物mRNA,Westernblotting方法能检测到重组腺病毒在29细胞中表达的G蛋白。此重组腺病毒在293细胞连续传代10次,PCR方法都能扩增出G基因目的条带。试验结果表明,狂犬病病毒G基因已成功重组到腺病毒基因组中,不但能稳定表达,而且能在重组腺病毒基因组中稳定存在。     

狂犬病“靶向性”中和表位DNA疫苗的构建与瞬时表达

采用RT-PCR获得BALB/c小鼠P41基因,并在不影响氨基酸序列前提下,对序列中461 nt NcoⅠ酶切位点进行定点突变；然后采用定向克隆方法将狂犬病病毒糖蛋白主要中和抗原表位核苷酸序列替换P41序列中CLIP区域,进行新一轮PCR反应以获得带有Kozak调控序列的P41-N分子,以增加目的基因的表达量,并将该含有Kozak序列的P41-N分子克隆插入到真核表达载体pCI-neo多克隆位点,通过PCR与限制性内切酶酶切方法进行鉴定；最后将各中和表位表达载体转染COS-7细胞,Western blotting检测目的基因的瞬时表达.测序分析结果显示,BALB/c小鼠P41基因CDS区为840 bp,编码279个氨基酸,与GenBank已登录(NM_010545)核苷酸序列、氨基酸序列均存在多个位点差异；定点突变后获得了P41分子突变体,经PCR及限制性内切酶酶切方法证明成功构建了携带P41-N分子的真核表达载体；Western blotting证实各P41-N分子均在COS-7细胞获得瞬时表达,且表达的目的产物能够与兔抗P41多克隆抗体发生抗原抗体结合反应.结果表明,成功构建了狂犬病病毒主要中和抗原表位的“靶向性”核酸疫苗,为开展在小鼠的免疫学试验奠定了基础.     

Generation of transgenic rats expressing enhanced green fluorescent protein in gonadotropin-releasing hormone neurons

Hypothalamic gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons govern reproductive function by controlling the release of gonadotropins from the pituitary. To facilitate identification of living GnRH neurons, here we attempted to generate transgenic rats that express enhanced green fluorescent protein (EGFP) in GnRH neurons. About 3 kb of rat GnRH promoter region was inserted into the EGFP reporter cassette, and the expression of EGFP fluorescence was confirmed in several cell lines following transient transfection. Then we successfully generated a transgenic rat by injecting linearized GnRH-EGFP transgene into the pronuclei of fertilized oocytes. The GnRH-EGFP transgenic rats expressed EGFP in the brain, but not in the ovary, testis or thymus. Immunohistochemical examination revealed that detectable EGFP fluorescence was confined to the cell body of GnRH-immunoreactive neurons in the septum and preoptic area, while no EGFP signal was discernible in the median eminence where abundant GnRH-immunoreactive fibers were observed. The mean percentage of EGFP-positive cells in the GnRH-positive cells was 76.3%. The GnRH-EGFP transgenic rats generated in the present study will enable characterization of properties of individual GnRH neurons.     

表达gpt和EGFP基因重组山羊痘病毒的构建和鉴定

在包含山羊痘病毒(Goatpox virus,GPV)疫苗株复制非必需区TK(Thymidine kinase)基因和背靠背启动子的质粒PtkPP的两个启动子下游插入EGFP(增强绿色荧光蛋白)基因,构建了质粒PtkPegfpP和PtkPPegfp,这两个重组质粒分别瞬时转染LT细胞,验证了启动子P11和P7.5能成功表达EGFP基因后,在PtkPP启动子P11的下游插入gpt(黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶)基因和EGFP基因,构建重组质粒PtkPgpt-egfpP,该重组质粒和GPV同源重组获得重组病毒rGPV-PtkPgpt-egfpP,利用MPA(霉芬酸)阻断核酸代谢途径筛选到稳定表达EGFP基因的重组GPV。为进一步开展GPV活载体疫苗的研究提供了技术平台。     

狂犬病毒糖蛋白单、双拷贝基因重组腺病毒的构建

将携带狂犬病毒糖蛋白单、双拷贝基因的穿梭栽体pShuttle-G和pShuttle-dG分别经PmeⅠ线性化后电转化含E1和E3区缺失的人5型腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态菌株BJ5183-AD-1进行细菌内同源重组,经抗性筛选,PcR、PacⅠ酶切及测序鉴定.构建了狂犬病毒糖蛋白单、双拷贝基因重组腺病毒质粒pAdHu5-G和pAdHu5-dG,线性化后分别转染Ad-293细胞进行病毒包装.结果显示,在第4天发生细胞病变效应,且荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达;western-blot证实2株重组腺病毒表达的糖蛋白能被特异性单抗识别;遗传稳定性分析显示,病毒传至10代时单G和双G基因均稳定遗传,没有发生缺失和突变.为比较分析2株重组腺病毒糖蛋白的表达时效及免疫效果奠定了基础.