Class Ⅰ新城疫病毒核衣壳蛋白在体外细胞感染过程中表达定位的检测

为分析核衣壳蛋白(NP)在新城疫病毒(NOV)感染真核细胞过程中细胞内定位的情况,本研究以NDV Class I强毒株9a5b作为免疫原制备4株NP特异性单克隆抗体(MAb),并将病毒株9a5b按5 MOI感染量接种DF1单层细胞,当接种后1 h～3 h时,NP有极少量表达并逐量增加,主要呈点状分布于细胞浆内;当接种后4 h～20 h时,NP聚集于细胞浆中,聚集数量与感染时间成正比;感染24 h后,细胞核碎裂,NP散在分布于细胞浆中.表明NP作为立早期蛋白,始终在胞浆中进行复制;在病毒感染初期,NP介导核糖核蛋白复合物发挥转录和翻译功能.本研究为深入开展NP与病毒mRNA转录、复制和包装的相互关系机制的研究奠定了基础.     

新城疫病毒Class Ⅰ与Class Ⅱ毒株交叉血凝抑制试验速分类

Class Ⅰ新城疫病毒(NDV)分离自健康家禽泄殖腔棉拭子,其基因序列与class Ⅱ NDV存在很大差异,为了建立简单快速的NDV分类方法,用SPF鸡制备Class Ⅰ和Class Ⅱ毒株多价抗血清分别与选取的Class Ⅰ和Class Ⅱ代表毒株进行交叉血凝抑制反应.结果表明所有Class Ⅰ毒株比同Class Ⅱ毒株的交叉血凝抑制值高8-64(3-61og2)倍;而Class Ⅱ毒株与Class Ⅱ抗血清的HI效价比同Class Ⅰ毒株的交叉血凝抑制值高2-8(1-31og2)倍,结果与基因分型高度一致,说明可以用交又血凝抑制试验进行初步分类.本研究结果显示,NDV Class Ⅰ弱毒株血凝性与广泛应用的NDV弱毒疫苗株不同,基因序列分析可以部分解释这种差异,另外可能HN蛋白的空间结构也会影响其与血凝素结合的特性.     

新城疫病毒ClassⅠ与ClassⅡ毒株交叉血凝抑制试验快速分类

ClassⅠ新城疫病毒(NDV)分离自健康家禽泄殖腔棉拭子,其基因序列与ClassⅡNDV存在很大差异,为了建立简单快速的NDV分类方法,用SPF鸡制备ClassⅠ和ClassⅡ毒株多价抗血清分别与选取的ClassⅠ和ClassⅡ代表毒株进行交叉血凝抑制反应。结果表明所有ClassⅠ毒株比同ClassⅡ毒株的交叉血凝抑制值高8～64(3～6log2)倍;而ClassⅡ毒株与ClassⅡ抗血清的HI效价比同ClassⅠ毒株的交叉血凝抑制值高2～8(1～3log2)倍,结果与基因分型高度一致,说明可以用交叉血凝抑制试验进行初步分类。本研究结果显示,NDVClassⅠ弱毒株血凝性与广泛应用的NDV弱毒疫苗株不同,基因序列分析可以部分解释这种差异,另外可能HN蛋白的空间结构也会影响其与血凝素结合的特性。     

两株ClassⅠ新城疫病毒的分离鉴定及遗传进化分析

采集送检实验室的鸡和鸭的咽拭子及泄殖腔拭子,处理后进行新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的RT-PCR检测以及病毒分离鉴定,对获得的分离株进行F基因高变区测序分析并构建遗传进化树.结果显示,采集的样本经RT-PCR扩增得到NDV特异性目的条带,接种鸡胚获得的病毒分离株具有血凝活性,两株...     

Class Ⅰ新城疫病毒NP因分子特征的研究

为分析2002～2007年Class Ⅰ新城疫病毒分离株NP基因的分子特征,以及其在新城疫病毒演化过程中所起的作用,采用RT-PCR方法扩增分离株的核衣壳蛋白(NP)基因,并进行了测序,应用生物信息学软件分析NDV NP基因的分子特征.根据NP基因序列的遗传发生分析表明,Class Ⅰ NDV 2型毒株与DE/R49-99和美国株亲缘关系较近,而3型毒株与其他Class Ⅰ毒株遗传关系较远,具有地区特色,形成一个独立的分支.生物信息学软件分析表明,NP蛋白N端1～400氨基酸比较保守,而C端序列(特别是氨基酸残基400～480)高度变异.ClaSs Ⅰ病毒2型毒株与国外分离株亲缘关系较近,可能有共同的起源;而3型毒株独立于其他Class Ⅰ毒株,具有独特性,这两种毒株的来源不同;不同基因型NP蛋白之间比较保守,但是P蛋白的C端发生了多个氨基酸的变异,对其功能的影响还需进一步探讨.     

鸭源新城疫病毒P基因遗传变异分析

为分析2002～2007年分离的鸭源弱毒新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)磷蛋白(P)基因的分子特征,以及在新城疫病毒演化过程中所起的作用,采用RT-PCR方法扩增NDV弱毒分离株的P基因,进行测序,并应用生物信息学软件(SNAP和CODEML)研究了作用于NDV P基因的选择压力.根据P基因序列的遗传发生分析表明,NDV Ⅰ类(Class Ⅰ)2型毒株与德国鸭源毒株DE/R49-99和美国株亲缘关系较近,而3 b型毒株与其他Ⅰ类病毒遗传关系较远,具有地区特色,形成一个独特的分支;NDV Ⅱ类(Class Ⅱ)中基因Ⅰb型与中国广泛使用的基因Ⅰ型疫苗毒Qeensland V4(QV4)以及Ⅰ型代表株亲缘关系较远.生物信息学软件分析表明,P基因不同片段受到正选择压力的作用不一样,P基因的两端受到负选择压力的作用不易发生变异,而中间(aa 62～113和137198)片段多个位点受到正选择压力的作用.可见,Ⅰ类病毒中3 b具有地域特色,不同基因型P蛋白之间变异较大,而且P蛋白不同位置变异不均匀.     

ClassⅠ新城疫病毒BJ1株微基因组的构建及功能鉴定

将以绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的ClassⅠ类新城疫病毒(NDV)BJ1株微基因组质粒pOK-M和3个辅助蛋白表达质粒pCI-NP、pCI-P、pCI-L共转染BSR T7/5细胞,转染24 h即可见到明显的绿色荧光,表明微基因组及其3种辅助质粒均获得了表达,并具有各自的生物学功能,为进一步建立该毒株的反向遗传操作系统奠定了基础。     

ClassⅠ新城疫病毒概述

新城疫病毒是影响养禽业健康发展的主要病原之一。新城疫病毒只有一个血清型,但根据亲源关系可以划分为ClassⅠ和ClassⅡ两大类。ClassⅠ新城疫病毒于2006年被证实存在,当前可被细分为9个基因型(1～9)。ClassⅠ所有自然分离株均为无毒株或弱毒株,但有经人工传代返强的报道,由于其分布广泛,数量庞大,对养禽业有巨大的潜在威胁。为了更好的了解ClassⅠ新城疫毒株的生物学特性,为研究ClassⅠ新城疫病毒提供参考,现将其基因组结构、分子流行病学及检测方法等综述如下。     

一株Class Ⅰ新城疫病毒中国分离株分子特性的研究

摘要：对从健康家鸭中分离到的一株Class Ⅰ新城疫病毒分离株Duck／China／08—004／2008进行了遗传进化特性研究。利用RT-PCR扩增了该分离株F基因的主要功能区片段。并进行了克隆与序列分析。序列测定结果已经登录到GenBank,登录号为EU589149。该分离株F蛋白裂解位点的组成为112E—Q—Q—E—R—L117,具有典型新城疫弱毒株的分子特征。同源性分析表明其与国内普遍使用的弱毒疫苗株LaSota和V4核苷酸的同源性较低（分别为55．4％和57．7％）。通过构建F基因的遗传进化树,结果表明该分离株在分类地位上属于Class Ⅰ,与我国目前普遍使用的弱毒疫苗株LaSota（Class Ⅱ中的基因Ⅱ型）和V4（ClassⅡ中的基因Ⅰ型）处在不同的进化分支。通过构建57株ClassⅠ新城疫病毒的遗传进化树．表明本分离株与近年来香港活禽市场分离株较为类似．同属于基因3型。     

新城疫病毒F48E9株P基因的克隆及鉴定

根据NDVP蛋白已知基因序列设计全盛了一对引物PU/PL，利用RT-PCR扩增出了F48E9株P基因在272bp的片段磁针 该片段克隆到pMD18-TVector上，并对所得到的重组质粒进行酶切分析，PCR鉴定，结果证明我们得到了这个基因片段的阳性重组子，为了更充分证实所得阳性质粒的可靠性，采用Sanger's双脱氧末端终止法对阳性重组子从5’端进行核苷酸序列测定，获得了F48E9株P基因片段5’端的基因序列，利用DNASIS分析软件，将F48E9株与La Sota株的相应序列进行比较，其核苷酸序列同源性为83.7%，至此，我们获得了F48E9株P基因的全长克隆。     

新城疫病毒M蛋白细胞核定位的机制与功能研究进展

新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)M蛋白一种非糖基化膜相关蛋白,主要位于病毒囊膜内表面,构成了病毒囊膜和核衣壳连接的支架.研究表明,M蛋白是一种细胞核-细胞质穿梭蛋白.在NDV感染早期,M蛋白可通过自身携带的核定位信号进入细胞核.根据已报道的相关RNA病毒M蛋白功能的研究结果,推测ND...     

狂犬病病毒磷蛋白在杆状病毒系统的表达及鉴定

为了建立狂犬病毒磷蛋白(phosphoprotein,P)的体外表达系统,本研究将RT-PCR扩增的狂犬病病毒ERA株P蛋白基因克隆于杆状病毒转移载体pFastBacHTA,构建重组质粒pFastBacHTA-P,并转染昆虫细胞Sf9包装形成重组杆状病毒。SDS-PAGE分析显示重组质粒pFastBacHTA-P转染的Sf9细胞中出现了分子量约为42 kDa的蛋白条带,Western blot证实分子量约为42 kDa的蛋白能与抗His的单克隆抗体发生特异性反应,间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)分析进一步显示Sf9细胞表达的P蛋白与抗P蛋白单克隆抗体能特异性结合。这些实验证明,狂犬病病毒P蛋白不仅在Sf9细胞中获得表达,而且具有良好的免疫反应性。狂犬病病毒P蛋白杆状病毒表达体系的建立,为蛋白结构的解析和诊断试剂的研制奠定了基础。     

新城疫病毒F基因在大肠杆菌中的高效表达及其免疫原性分析

应用PCR技术,以含有新城疫病毒F48E8株全长融合蛋白(F)基因的真核表达质粒pVAX1-F为模板,扩增出594bp大小的F基因的部分片段.经克隆筛选和测序后,构建成重组原核表达质粒pGEX-6P-1-F.重组质粒转化表达菌BL21,获得重组菌BL21(pGEX-6P-1-F).经IPTG诱导和SDS-PAGE分析表明,F基因在原核表达体系中获得高效表达,表达量占菌体总蛋白的23%.Western blotting结果显示,在相对分子质量46 ku位置有特异性条带.动物实验结果表明,F蛋白免疫鸡产生的针对新城疫病毒F蛋白的血清抗体效价显著高于空白对照组(P＜0.05),说明原核表达系统表达的F蛋白具有良好的免疫原性.     

新城疫病毒感染过程中基质蛋白的动态分布

本研究利用原核表达产物制备的多抗血清进行M蛋白在细胞内的定位分析,NDV 9a5b病毒按5个感染复数(m.o.i)感染量接种DF1单层细胞,当PI=6 h时,M蛋白主要分布于细胞浆内,并未到达细胞膜内侧;到PI=8 h时,粗面内质网周围的M蛋白逐渐增多;PI=12 h时,M蛋白已开始聚集于细胞膜的内侧,而当感染后16 h开始形成合胞体时,M蛋白在细胞膜内侧形成明显的斑点状聚集;当感染至24 h时,逐渐出现5~10个细胞膜融合的包涵体,M蛋白存在于包涵体融合膜的内层,且荧光强度已逐渐减弱。这为深入开展M蛋白与病毒增殖、宿主相互作用机制的研究工作奠定了基础。     

一株新城疫强毒株的分离鉴定

从昌吉市肉种鸡发病鸡群中分离到1株病毒,对其进行了SPF鸡胚接种试验,HA及NDV和AIVH5、H9单因子血清HI试验,动物回归试验,MDTI、CPI和IVPI毒力学指标测定,分离株与NDV Lasota株交叉HI试验,鸡胚半数感染量(EID50)测定。结果表明,分离株的MDT为55 h;ICPI为1.78;IVPI为2.41,第6代病毒EID50为3.98×10-8/0.1 mL。分离株能被NDV La-soda株阳性血清中和,动物回归试验鸡出现典型的新城疫症状。证明该毒株为新城疫强毒株。     

一株Class Ⅰ新城疫病毒中国分离株分子特性的研究

对从健康家鸭中分离到的一株Class I新城疫病毒分离株Duck/China/08-004/2008进行了遗传进化特性研究。利用RT-PCR扩增了该分离株F基因的主要功能区片段,并进行了克隆与序列分析。序列测定结果已经登录到GenBank,登录号为EU589149。该分离株F蛋白裂解位点的组成为112E-Q-Q-E-R-L117,具有典型新城疫弱毒株的分子特征。同源性分析表明其与国内普遍使用的弱毒疫苗株LaSota和V4核苷酸的同源性较低(分别为55.4%和57.7%)。通过构建F基因的遗传进化树,结果表明该分离株在分类地位上属于ClassI,与我国目前普遍使用的弱毒疫苗株LaSota(Class II中的基因II型)和V4(Class II中的基因I型)处在不同的进化分支。通过构建57株ClassI新城疫病毒的遗传进化树,表明本分离株与近年来香港活禽市场分离株较为类似,同属于基因3型。     

新城疫病毒F_(48)E_9株P基因的克隆及鉴定

根据NDVP蛋白己知基因序列设计合成了一对引物PU/PL ,利用RT_PCR扩增出了F4 8E9株P基因 12 72bp的片段 ,将该片段克隆到pMD18_TVector上 ,并对所得到的重组质粒进行酶切分析、PCR鉴定 ,结果证明我们得到了这个基因片段的阳性重组子。为了更充分证实所得阳性质粒的可靠性 ,采用Sanger’s双脱氧末端终止法对阳性重组子从 5’端进行核苷酸序列测定 ,获得了F4 8E9株P基因片段 5’端的基因序列 ,利用DNASIS分析软件 ,将F4 8E9株与LaSota株的相应序列进行比较 ,其核苷酸序列同源性为 83 7%。至此 ,我们获得了F4 8E9株P基因的全长克隆     

新城疫病毒F基因在新型杆状病毒表达系统中的表达及重组病毒的免疫原性

将新城疫病毒（四平株）F基因插入到pFastBac Ⅰ质粒中，构建了重组质粒pFF。pFF转化大肠杆菌DH10Bac后，F基因在助手质粒（helper plasmid)提供转座酶的情况下，通过转座进入Bacmid，构建了重组Bacmid(re-Bacmid)。在含有X－gal/IPTG、庆大霉素、卡那霉素和四环素的琼脂平板上，筛选白色菌落后，提取re-Bacmid转染Sf-9昆虫细胞。在昆虫细胞内，re-Bacmid经复制、表达、装配、形成重组杆状病毒，并表达F蛋白。经SDS－PAGE和Western-blot分析，表达的F蛋白的分子大小为63000，并证明在昆虫细胞内表达的蛋白能部分糖基化。表达的F蛋白约占细胞总蛋白的10％。动物试验证明，约建的重组杆状病毒具有良好的免疫原性。     

鸭源新城疫病毒F基因在昆虫细胞中的表达和鉴定

为在昆虫细胞中表达鸭源新城疫病毒(NDV) F蛋白,本试验首先根据鸭源NDV F基因序列设计引物,PCR扩增出F基因,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1,获得重组转座载体pFastBac-F,将其转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-F,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-F。Western blotting、间接免疫荧光试验结果均显示表达的重组蛋白能与鸭抗NDV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。结果表明鸭源NDV F蛋白在昆虫细胞中获得了成功表达,为鸭新城疫的预防控制奠定了基础。     

新城疫病毒Ⅰ系毒株通过Caspase途径诱导鸡胚成纤维细胞凋亡

应用不同Caspases抑制剂研究了新城疲病毒（NDV）Ⅰ系毒株诱导鸡胚成纤维细胞（CEF）凋亡的途径。结果，用20μmol／L的Z—VAD．fmk、Z—IETD．fmk和Z—LEHD．fmk分别处理CEF后，均能抑制NDVⅠ系毒株诱导的CEF凋亡；而用20μmol／L的Z—DEVD．fmk和Z—AEVD．fmk分别处理CEF,则不能抑制NDVⅠ系毒株诱导的CEF凋亡。由此表明，NDVⅠ系毒株能通过Caspase依赖性途径诱导CEF凋亡，其中Caspase-8和Caspase-9在凋亡中发挥重要作用，而Caspase-3和Caspase-10在凋亡中不发挥作用。