Hc38基因沉默对捻转血矛线虫L3期幼虫发育的影响

通过研究Hc38基因对捻转血矛线虫L3期幼虫发育的影响,探索Hc38基因功能,为利用该基因防治捻转血矛线虫的进一步研究提供依据。针对Hc38基因序列设计并合成特异性dsRNA和siRNA,采用浸泡的方法对捻转血矛线虫L3期幼虫进行RNA干扰(RNAi)试验,利用实时荧光定量PCR分析Hc38基因在L3期幼虫中的转录抑制效果,同时将dsRNA和siRNA浸泡24h后的L3期幼虫感染绵羊,研究Hc38基因的沉默对捻转血矛线虫L3期幼虫在绵羊体内发育的影响,定期采集绵羊粪便检查虫卵数,30d后剖检绵羊皱胃,检查荷虫数的变化。实时荧光定量PCR检测表明,各试验组Hc38基因的相对含量显著低于对照组(P<0.01),浸泡72h后,Hc38-dsRNA组和Hc38-siRNA组Hc38基因的表达量分别仅为对照组的32.27%和14.93%。绵羊体内干扰沉默效果显示,试验组Hc38干扰组虫卵减少率最高,为50%,减虫率最高,为48.6%。通过浸泡法导入的dsRNA和siRNA均能有效抑制Hc38基因的转录,同时Hc38基因的沉默与幼虫的发育密切相关,为捻转血矛线虫及其他寄生线虫的基因功能研究提供一种新的方法。     

捻转血矛线虫H11部分功能域基因的原核表达与分析

    生物信息学软件分析表明,捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)ZJ株的H11抗原基因含有4个糖基化位点与1个锌结合区,为分析这些功能域在H11天然抗原诱导的免疫保护中的作用,对H11部分基因进行克隆和表达.参照本实验室在GenBank上登录的捻转血矛线虫ZJ株的H11基因序列设计引物,扩增H11开放阅读框670～1710 bp的部分基因序列,命名为HPS(H11 partial sequence).基因片段与表达载体pET-28b分别以NdeⅠ、XhoⅠ酶切后构建重组表达载体pET-28b-HPS,并将其转入大肠杆菌BL21中,提取质粒经PCR和酶切鉴定获得阳性质粒并对其进行测序.结果表明,扩增得到的目的基因片段为 1041 bp,与已发表的ZJ株和国外株参考序列比较,核苷酸同源性分别为100%和98.8%.将重组表达载体用IPTG诱导表达,表达产物利用SDS-PAGE和Western-blotting检测表明,HPS基因在大肠杆菌中成功表达,融合蛋白的分子量约为37.34 kDa,诱导6 h的蛋白表达量可达到58.9%.     

捻转血矛线虫扫描电镜的补充报告

本文对采自上海绵羊真胃的捻转血矛线虫进行扫描电镜观察。对该虫齿、颈乳突、排泄孔、肛孔、纵纹、横纹和交合刺超微结构作了补充描述,并讨论了交合刺构造。     

山羊捻转血矛线虫的诊治

介绍了山羊捻转血矛线虫的临床表现、剖检病变及实验室诊断,提出其预防与治疗措施,以期为该病的防治提供参考。     

捻转血矛线虫HLJ株H11基因克隆及部分胞外域表达

根据GenBank上发表的捻转血矛线虫核苷酸序列设计引物,采用RT-PCR方法克隆捻转血矛线虫HLJ株H11基因。结果表明,H11ORF核苷酸长为2 919 bp,编码972个氨基酸残基。经分析,捻转血矛线虫HLJ株H11与X94187、AY247714、AY819650同源性分别为99.14%、98.49%和99.59%;H11基因含有4个糖基化位点和1个Zn结合功能域;4个糖基化位点分别位于99~102 aa、227~230 aa、549~552 aa和858~861 aa处;Zn结合功能域位于376~385 aa处。参照捻转血矛线虫HLJ株H11序列设计引物,扩增H11ORF 451~2 919 bp一段胞外域序列,构建包含3个糖基化位点和1个Zn结合功能域pGEX-6P-1-H11原核表达质粒,在大肠杆菌表达菌Rosetta(DE3)中进行表达。SDS-PAGE结果表示,融合蛋白分子质量约为118 ku,以包涵体形式存在。免疫印迹实验未出现目的条带,说明H11确是一种隐蔽抗原。     

捻转血矛线虫肌动蛋白基因的克隆与表达及其DNA疫苗的构建

根据秀丽新杆线虫等其他几种线虫的肌动蛋白(Actin)开放阅读框(ORF)设计简并引物,以捻转血矛线虫总RNA为模板,合成cDNA,用RT-PCR方法扩增出约为1 100 bp的DNA片段。将该片段克隆到T载体后进行序列测定和分析,结果表明该基因的ORF为1 131 bp,与秀丽新杆线虫、新杆状线虫、肿孔古柏线虫等的同源性高达86%以上,推导出其蛋白质序列含有376个氨基酸,与胎生网尾线虫、秀丽新杆线虫、新杆状线虫、马来丝虫等的肌动蛋白相似性均为98%以上,说明成功克隆了捻转血矛线虫actin基因。将捻转血矛线虫肌动蛋白基因的ORF克隆到pET-28a(+)中,构建了原核表达载体,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析发现,该基因获得了表达,且以包涵体的形式存在,融合蛋白相对分子质量约46×103。以此重组蛋白为抗原,用自然感染捻转血矛线虫山羊血清为第一抗体进行Western blot分析,结果出现1条特异性条带,表明捻转血矛线虫Actin蛋白在自然感染过程中能被宿主的免疫系统识别,可能是一种天然抗原。用纯化重组Actin蛋白免疫小鼠,制备抗血清,以该血清为第一抗体进行Western blot,结果发现该血清能识别捻转血矛线虫成虫蛋白谱中相对分子质量约为42×103的蛋白条带。将捻转血矛线虫actin基因亚克隆到真核表达载体pVAX1中,构建了DNA疫苗pVAX1-ACT,动物免疫试验结果表明该DNA疫苗在机体内获得了表达。     

重组捻转血矛线虫半乳糖结合凝集素免疫山羊皱胃细胞因子表达定位

【目的】检测重组雌、雄捻转血矛线虫半乳糖结合凝集素(rHco-GAL-f/m)免疫山羊皱胃转录细胞因子。【方法】用rHco-GAL-f/m免疫山羊,通过原位杂交法对阴性对照组(A)、攻虫对照组(B)、免疫攻虫组(C)和免疫不攻虫组(D)山羊皱胃中白介素-1β(IL-1β)、白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA转录进行定位,并对上述细胞因子阳性反应细胞数量进行分析。【结果】A组山羊皱胃组织中没有检测到细胞因子,其它3组仅在皱胃黏膜下层中检测到了上述细胞因子。B、C和D组间IL-4和IL-6阳性反应细胞数差异显著(P0.05),其中C组明显高于其它两组;B、C和D组间IL-1?、IL-2和TNF-α阳性反应细胞数差异显著(P0.05),其中D组明显高于其它两组;IFN-γ阳性反应细胞数在B组和C组之间差异不显著(P0.05),D组与B组和C组之间差异显著(P0.05),且明显高于其它两组。【结论】重组捻转血矛线虫半乳糖结合凝集素能够诱导山羊皱胃局部免疫应答。     

捻转血矛线虫GST耐药基因的克隆、表达及生物信息学分析

为探究捻转血矛线虫GST基因的原核表达及其生物信息学特征,以捻转血矛线虫cDNA为模板,设计特异性引物扩增GST基因,构建原核表达载体pET30a(+)-GST转化至E.coil BL21(DE3)感受态细胞,将鉴定正确的重组菌进行表达条件优化后,再通过SDS-PAGE分析蛋白表达的特征,并利用在线软件对GST蛋白进行生物信息学分析。结果表明:捻转血矛线虫GST基因大小为618 bp;诱导后的pET30a(+)-GST重组菌最佳诱导条件为0.05 mmol/L的IPTG在37℃时诱导6 h,以包涵体的形式存在,大小约为29 ku。生物信息学分析表明:GST分子式为C_(1083)H_(1657)N_(277)O_(294)S_6,属于不含信号肽和跨膜区的亲水性蛋白;二级结构主要由α螺旋形成;潜在的抗原表位主要位于25～48、55～63、92～106、113～124、139～147、170～189和195～205位氨基酸附近。本试验成功构建GST基因原核表达系统,优化表达条件下能稳定纯化GST重组蛋白,为进一步探索捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药机制及GST蛋白的生物学特性提供研究基础。     

捻转血矛线虫H11基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

将捻转血矛线虫H11基因亚克隆到酵母表达载体pPICZαB后，用氯化锂法转化巴斯德毕赤酵母菌株X-33，通过含Zeocine^TM抗生素的YPD平板筛选出72个重组子。重组酵母用甲醇诱导后，经RT-PCR、SDS-PAGE和Western blot检测，结果表明捻转血矛线虫H11在巴斯德毕赤酵母中实现了表达。     

绵羊混合感染捻转血矛线虫和美丽筒线虫的诊治

2008年11月以来河北北方学院动物科技学院病理实验室先后接到张家口坝上地区养羊户送来的以贫血、渐进性消瘦为主要特征的病羊,剖检发现其真胃内有捻转血矛线虫寄生,最多达2 120条。另在其食道黏膜内发现细长、乳白色的美丽筒线虫,共14条。漂浮法粪便检查时发现2种虫卵。一种虫卵内含16～32个胚细胞,卵壳薄,光滑稍带黄色,虫卵大小为(75～95)μm×(40～50)μm;另一种虫卵内含有幼虫,虫卵大小为(50～70)μm×(25～37)μm。经诊断为羊混合感染捻转血矛线虫和美丽筒线虫病。对羊群普遍用左旋咪唑片和丙硫咪唑口服驱虫,2周后羊群症状消失,病情得到控制。     

捻转血矛线虫Hc-FAR-4蛋白的表达特性及其与配体结合能力分析

【目的】捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)寄生在牛羊等反刍动物的皱胃中,引起的捻转血矛线虫病在我国呈全国性流行。文章通过研究脂肪酸与视黄醇结合相关蛋白Hc-FAR-4的表达特性及配体结合能力,以了解其在捻转血矛线虫生长、发育、繁殖过程中的作用。【方法】对Hc-far-4进行克隆、并且构建原核表达载体pET-30a-Hc-far-4,pET-30a-Hc-far-4重组质粒经过PCR与双酶切鉴定准确无误之后转化到E. coli BL21感受态细胞中,用0.1 mmol·L ^-1IPTG(isopropyl-β-d-thiogalactoside)进行重组蛋白的诱导表达。收集重组蛋白rHc-FAR-4,利用荧光分析法,研究rHc-FAR-4蛋白与DAUDA、视黄醇、油酸的结合能力。配体结合试验是依据荧光物质retinol与脂肪酸类似物DAUDA在极性和非极性溶液中,在某一波长的激发光激发下,所发出的荧光光谱随之变化的特性,判断rHc-FAR-4蛋白是否具有与DAUDA、retinol结合的能力。再在体系中加入非荧光长链脂肪酸油酸,根据荧光光谱的变化情况判定油酸能否分别与DAUDA、retinol竞争目的蛋白的脂肪酸结合位点,间接说明目的蛋白能否与非荧光脂肪酸油酸结合。同时制备鼠源多克隆抗体,利用ELISA技术检验免疫后小鼠的抗体效价,抗体效价合适即可收集小鼠血清。收集的血清用于免疫组织荧光（IHF）试验,探究Hc-FAR-4的表达部位,从而推测其功能。该试验过程为：对捻转血矛线虫进行石蜡包埋,石蜡切片,抗原修复,3%的BSA 于4℃封闭过夜,自制鼠源多克隆抗体作为一抗孵育1 h; Alexa Fluor? 488 nm羊抗鼠IgG作为二抗避光孵育1 h,DAPI染色30 min,激光共聚焦显微镜检查染色情况。利用荧光定量PCR技术分析Hc-far-4在捻转血矛线虫各个主要阶段的表达特性。【结果】成功克隆目的基因Hc-far-4,测序结果与Sanger数据库中捻转血矛线虫far-4基因序列（>HCISE00908800.t1）相似度为 99.9%;重组质粒 pET-30a-Hc-far-4在E. coli BL21中成功表达,在诱导8 h后达到峰值。经过ELISA检测,结果显示制备的鼠源多克隆抗体效价达到1﹕1 024 000—1﹕2 048 000,可用于后续试验。Western Blot鉴定结果显示rHc-FAR-4重组蛋白带有His标签,并且条带大小为25 kD,结果符合预期。制备的鼠源多克隆抗体经过Western Blot鉴定,能够与天然Hc-FAR-4 蛋白结合,说明该抗体可用于IHF试验。配体结合试验结果表明 rHc-FAR-4蛋白具有结合脂肪酸与视黄醇的能力。荧光定量PCR分析表明,Hc-far-4在四期幼虫中的转录水平最高;IHF试验表明,Hc-FAR-4主要表达在捻转血矛线虫的肠壁、性腺中。综上推测Hc-FAR-4蛋白主要在寄生生活阶段参与了转运脂肪酸与视黄醇,为捻转血矛线虫的生长发育与生殖提供营养物质。【结论】捻转血矛线虫 FAR-4 蛋白能够结合脂肪酸类似物DAUDA和视黄醇,但是与油酸的结合能力较弱,主要表达在肠壁,在性腺、角皮中也有少量表达,其基因在进行营寄生生活阶段时表达量达到峰值。     

羊捻转血矛线虫病的综合诊断与治疗

捻转血矛线虫病是羊常见的寄生虫病。某场羊出现精神不振,食欲下降,被毛粗乱,贫血,消瘦,颈下、胸前水肿等症状,通过发病情况调查、临床症状观察、剖检和进行虫种鉴定,确诊为羊的捻转血矛线虫病。通过皮下注射1％阿维菌素,治疗效果良好。     

多重PCR检测捻转血矛线虫苯并咪唑类药物抗性等位基因

 利用GenBank发表的捻转血矛线虫β微管蛋白基因组DNA序列设计2对引物,建立检测捻转血矛线虫苯并咪唑类药物抗性的多重PCR方法,利用该方法检测我国不同地区捻转血矛线虫对苯并咪唑类药物的抗性,并用生物学检测验证。结果表明,建立的多重PCR方法在抗性检测上具有很强的特异性,澳大利亚抗性虫株只有F1和F3条带,上海敏感虫株只有F2和F3片段;序列分析证实抗性虫株编码β微管蛋白第200位氨基酸的密码子为TAC,敏感虫株为TTC。并且该法具有很高的灵敏性,检测基因组DNA的最低量为50 ng。生物学检测,澳大利亚抗性虫株丙硫苯咪唑LD50达0.54 ?g·ml-1,上海敏感虫株的LD50为0.0023 μg·ml-1,与多重PCR结果相符,说明多重PCR可以用于捻转血矛线虫苯并咪唑类药物抗性的检测。利用该技术检测源于新疆石河子、伊宁,安徽五河,江苏南京、徐州等地的虫株发现,这些地理株均表现为敏感型,丙硫苯咪唑LD50在0.0023～0.0032 ?g·ml-1之间,提示我国捻转血矛线虫苯并咪唑类药物抗性尚不严重。     

Multiplex PCR Detection of Alleles Responsible for Benzimidazole-Susceptibility or-Resistance in Natural Populations of Haemonchus contortus

A multiplex PCR was developed to detect benzimidazole-resistance (BZ-R) or -susceptibility (BZ-S) in Haemonchus contortus by amplification with 4 primers of a sequence of the GRU-1 gene of β-tubulin of H. contortus making use of sequence information available in Genbank. The method was based on two allele-non-specific primers and two allelespecific primers. Fl (264 bp) and F3 (799 bp) should be produced in BZ-R, F2 (585 bp) and F3 in BZ-S. With this method,we demonstrated that H. contortus BZ-R strain from Australia showed Fl and F3, and the worm BZ-S strain from Shanghai did F2 and F3. Sequence analysis of the isotype 1 gene of β-tubulin of BZ-R from Australia and BZ-S from Shanghai showed the code in residue 200 of the gene was respectively TAC and TTC. The LD50 of albendazole of the Australian BZR strain was 0.54 μg mL-1, the Shanghai BZ-S strain was only 0.0023 μg mL-1 by EHA (egg hatch assay). The multiplex PCR could determinate the genotype of single adult worm or several third stage larvae and was performed on at least 50 ng of genomic DNA. BZ-R H. contortus were not detected in Shihezi and Yining of the Xinjiang, Wuhe of the Anhui Province,Nanjing and Xuzhou of the Jiangsu Province. The LD50 of the H. contortus from these locations to albendazole as determined by EHA varied between 0.0023-0.0032 μg mL-1. The result indicated that the multiplex PCR could be used to differentiate BZ-R and BZ-S of H. contortus and that the BZ-R situation of H. contortus was not serious in China.     

捻转血矛线虫H11蛋白提取及其氨肽酶活性分析

试验对体外培养的捻转血矛线虫L4期幼虫和自然感染的成虫的H11天然蛋白分别进行了提取和纯化,并进一步测定了其氨基肽酶活性及酶抑制剂敏感性,为利用捻转血矛线虫天然抗原进行疫苗研制进行了初步探索。结果表明,H11蛋白在L4期幼虫和自然感染成虫体内均有表达,且具有氨肽酶M(ApM)活性和氨肽酶A(ApA)活性,其酶活性能被EDTA及邻二氮杂菲等哺乳动物氨肽酶抑制剂所抑制。H11蛋白是寄生阶段虫体的一种酶类,在对H11蛋白进行操作时,应按照相应的酶处理方法进行,以防变性,影响抗原免疫效果。