用启动子融合GUS的方法分析OsUgP1基因的表达模式

克隆水稻尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(OsUgp1)的启动子,并与大肠杆菌β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase,GUS)报告基因连接后转化水稻,采用GUS组织化学染色检测启动子驱动GUS基因在水稻转化植株中的表达情况,发现在水稻的根、茎、叶、内外稃、子房、柱头等组织,以及减数分裂时期的花药及不同发育时期的...     

钙-钙调素调节拟南芥热激基因的表达

用转AtHSP1 8 2 promoter/GUS基因的转基因拟南芥为材料 ,体内 (invivo)实验证明钙 钙调素调节热激基因的表达。结果表明 ,无论在热激还是非热激条件下 ,CaCl2 处理都能提高转基因拟南芥的β 葡萄糖苷酸酶 (GUS)的活性 ,而钙离子螯合剂EGTA、钙离子通道阻断剂LaCl3和异博定、钙调素拮抗剂W 7、氯丙嗪 (CPZ)和三氟拉嗪 (TFP)的处理均使 β 葡萄糖苷酸酶的活性下降。     

水稻4CL基因启动子引导的GUS在紫外诱导下的组织特异性表达

 4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）是位于苯丙烷类共同代谢途径中类黄酮、木质素以及肉桂酸酯等分支代谢途径交叉点上的关键酶，对整个代谢过程起着重要的调控作用。4CL基因的表达可被真菌侵染，紫外辐射，机械损伤等外界刺激所诱导。笔者将水稻R4CL-1基因启动子与GUS基因融合导入烟草基因组中，并在紫外诱导下对转基因植株进行了β-Glucuronidase活性的组织化学染色分析。在转基因烟草植株幼叶的叶脉及其周围细胞、幼根的根尖细胞及维管组织、成熟花的花瓣及柱头、未成熟种子的表皮细胞和成熟种子的胚中都检测到了GUS活性，而在完全伸展的老叶、茎（幼茎和成熟茎）、老根和花的其它组织中均没有观察到GUS酶活性，从而证明了R4CL-1启动子能在植物发育过程中指导GUS报告基因的组织特异性表达。     

水稻OsRLCK167基因的组织表达模式和生物信息学分析

类受体胞质激酶(receptor-like cytoplasmic kinases, RLCKs)家族是一类特殊蛋白激酶,在植物生长和病原菌防御中发挥着重要的生物学功能。在对水稻RLCKⅥ家族成员OsRRK1基因的研究中发现水稻4号染色体上存在一个与其同源性特别高的基因,即OsRLCK167(LOC＿Os04g56060)。为了丰富类受体胞质激酶家族并探究水稻胞质受体激酶基因的作用,本研究利用ExPASy-Protparam、Protscale、CD-search等在线工具和DNAMAN软件对OsRLCK167基因进行生物信息学分析;采用qRT-PCR技术对OsRLCK167基因做组织表达模式分析。结果显示：OsRLCK167蛋白的分子量为43.77776 kD,为疏水性、不稳定的酸性蛋白;对该蛋白的二级结构进行预测,显示其主要由无规则卷曲(41.94%)、α-螺旋(35.29%)、延伸链(15.35%)和β-转角(7.42%)组成;该基因在水稻不同组织均有表达,且在叶鞘中的表达量最高。结果表明,OsRLCK167基因在进化过程中具有高度的保守性,在水稻中具有功能多样性。     

水稻OsFAH基因启动子的克隆及表达分析

以湘晚籼13号为材料,克隆了水稻OsFAH基因启动子,构建了OsFAH启动子与GUS基因融合表达载体,并转化拟南芥。序列分析结果表明,该启动子包含了启动子核心序列TATA–box和CAAT–box以及光响应元件等。GUS染色结果表明：在拟南芥幼嫩的子叶、下胚轴和真叶中,GUS的表达较强;随着叶片的衰老,GUS表达减弱;在根中,GUS主要在主根的维管柱内表达;黑暗处理会使GUS表达减弱;在黑暗条件下,OsFAH基因表达下调。     

太平洋鳕ATG5基因的克隆及表达分析

ATG5(Autophagy related gene 5)基因是一种自噬相关基因,是形成自噬体的重要基因,ATG5基因的表达对自噬调控的成熟有重要作用。本研究中通过克隆,首次得到太平洋鳕Gadus macrocephalus ATG5c DNA部分序列,该序列长为895 bp,含有完整的开放阅读框(Open reading frame,ORF),编码275个氨基酸,其编码的蛋白质相对分子量约为32 200;经核苷酸序列比对发现,太平洋鳕ATG5核苷酸序列与半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis、尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus ATG5核苷酸序列的相似性均高达87.27%;利用太平洋鳕与其他物种ATG5核苷酸序列构建系统进化树,结果显示,ATG5核苷酸序列系统进化树反映的亲缘关系基本符合传统分类学观点;氨基酸序列分析结果显示,ATG5蛋白氨基酸序列具有较高的保守性;利用绝对荧光定量PCR方法对ATG5基因在太平洋鳕各组织中的转录水平进行检测,结果显示,肝、脾和肾中的表达量高于其他组织,鳃、肾、脾、脑、肝和肌肉各组织中的ATG5 mRNA拷贝数分别为11.617 08、20.449 25、19.706 87、4.839 84、27.434 97、2.954 75 copies/ng。本研究结果将为进一步研究太平洋鳕细胞吞噬机制奠定基础,也为太平洋鳕的免疫机理和相关研究提供基础数据。     

水稻OsENOD93b基因组织表达模式与生物信息学分析

主要探究OsENOD93b基因在水稻中的组织表达模式,并对其作生物信息学分析.采用实时荧光定量PCR技术分析OsENOD93b基因的表达模式.用ExPASy-Protparam、Protscale、CDD、SOPMA、Phyre 2、Psort等在线工具对OsENOD93b进行生物信息学分析.经组织表达模式分析可知,O...     

水稻乙醇酸氧化酶基因的克隆和表达分析

根据水稻数据库中乙醇酸氧化酶(GLO)基因的编码序列,设计引物,克隆了水稻OsGLO3基因的序列,该片段长1 104bp,编码367个氨基酸,含有11个外显子。荧光定量PCR结果表明:OsGLO4在不同水稻生育期中表达量差异较大,且OsGLO1和OsGLO4在生长发育后期表达量较高,OsGLO2和OsGLO5在生长发育前期表达量较高。     

卵形鲳鲹组织蛋白酶L基因的克隆及其表达分析

[目的]明确卵形鲳鲹组织蛋白酶L基因(TroCatL)的遗传进化规律及其组织表达水平,为研究CatL生物学功能及其对病原的抗病机理提供理论依据.[方法]应用RT-PCR和RACE技术克隆TroCatL基因全长cDNA,采用生物信息学方法对其序列特征进行分析;并以实时荧光定量PCR(qPCR)检测TroCatL基因在健康组织中的表达情况及其表达与溶藻弧菌感染的关联性.[结果]TroCatL基因全长cDNA为1492 bp(GenBank登录号MH036350),包括开放阅读框(ORF)1011 bp、5'端非翻译区(5'-UTR)120 bp和3'端非翻译区(3'-UTR)361 bp. TroCatL基因编码336个氨基酸残基,其理论等电点(pI)5.7,预测分子质量37.93 kD,且存在CatL特有的保守结构域(ERFNIN、GNFD和GCXGG基序)及由139Cys、279His和303Asn组成的半胱氨酸蛋白酶保守活性位点.TroCatL氨基酸序列与其他鱼类CatL氨基酸序列的同源性高达83.9%~95.2%,尤其与鲈形目鰤鱼的亲缘关系最近. TroCatL基因mRNA在健康卵形鲳鲹组织中均有表达,以在肝脏中的表达最高,在脑组织中的表达最低.经溶藻弧菌感染后,TroCatL基因mRNA在肝脏、脾脏和血液中的表达水平均上调,肝脏和脾脏中的TroCatL基因mRNA在攻毒后24 h达峰值,血液中的TroCatL基因mRNA在感染后12 h达最高值.[结论]TroCatL蛋白结构域及其催化活性位点在遗传进化过程中较保守,通过参与机体的免疫应答反应,在卵形鲳鲹抵御细菌或病毒侵染的过程中扮演重要角色.     

小细胞团为受体的根癌农杆菌介导的非洲菊基因转化体系

以非洲菊叶柄基部的愈伤组织为起始材料,通过匀浆将其切割成小细胞团,再利用该小细胞团为外植体进行农杆菌介导的GUS基因转化.标记基因GUS的转化及转化愈伤组织的X-Gluc染色证明了该方法可以高频率地(＞80%)获得转化愈伤组织;通过对转化愈伤组织的再生培养,获得了8株X-Gluc染色阳性植株;转化植株的PCR检测和Southern分子杂交检测进一步表明,目的基因已整合入非洲菊基因组中.     

水稻HSF基因OsHsf-like的生物信息学和转录表达分析

植物热激转录因子主要调控植物热激蛋白基因的转录表达,对植物的耐热性起着重要的作用.我们利用生物信息学技术鉴定出1个新的水稻HSF基因OsHsf-like,该基因编码1条719个氨基酸的预测肽链,肽链中包含1个HSF DNA结合域和1个由2个疏水的七肽重复序列(HR-A/B)构成的寡聚域.OsHsf-like的DNA结合域具有典型的HSF DNA结合域的次级结构和三级结构.对寡聚域的结构分析和系统进化分析将OsHsf-like归于B类HSFs.OsHsf-like在水稻穗部低水平转录表达.表达水平不受热激影响.     

水稻TWH1基因启动子的克隆及表达分析

启动子是基因表达的重要调控元件。利用PCR方法克隆了控制水稻颖壳发育的候选基因TWH1的启动子,并将启动子片段与GUS报告基因融合构建了重组表达载体。通过农杆菌介导的方法将其导入水稻愈伤组织,转基因植株经GUS染色分析显示,各个发育时期的茎秆、叶片、叶鞘、雌雄蕊和孕穗期的颖壳中都有GUS活性表达,但在根和抽穗后的颖壳中未检测到GUS活性。该结果对进一步研究TWH1基因的功能奠定了基础。     

水稻化感材料的抑草作用及其机制

 水稻化感材料PI312777和化感1号在田间能显著地抑制杂草,而且其抑草作用与栽培方式相关,抛秧和移栽方式对杂草的抑制作用明显地优于直播。结果表明,PI312777和化感1号植株产生和释放的化感物质(多酚、黄酮和羟基肟酸)显著高于非化感品种华粳籼1号,而且在6叶期植株中的化感物质含量达最大值。这种不同水稻材料植株在不同生育期产生并释放化感物质量的差异是导致它们在田间抑草效应强弱的重要原因之一。进一步研究发现,PI312777植株由地上部分合成化感物质后经根部分泌到环境中,根组织并不产生化感物质,且稗草能诱导     

拟南芥和水稻CesA基因家族的生物信息学分析

以拟南芥和水稻21个纤维素合成酶基因(CesA)为研究对象,对其基因结构、保守结构域、蛋白质跨膜结构、亚细胞定位、基因表达等进行综合分析。结果显示,Ces A基因长度在3.5~6.5 kb,有7~13个内含子(OsCesA10除外)。Ces A基因编码的蛋白质保守性较强,含有该基因家族的保守结构域Ring finger(OsCesA10、OsCesA11除外)和Cellulose synthase。水稻和拟南芥的CesA蛋白跨膜螺旋数量为6个或8个(OsCesA10除外)。蛋白质亚细胞定位结果表明,21条Ces A蛋白全部定位在质膜上。大部分At Ces A基因在植株的幼根、幼叶和愈伤组织中均有表达,而大部分OsCesA基因仅在幼根或幼叶中表达。     

温度对隐性长穗颈温敏不育水稻eui基因表达的影响

 为了解杂交稻不育系抽穗不畅问题，以隐性长穗颈温敏核不育水稻长选3S为材料，采用田间调查和人工温度处理方法研究了温度对隐性长穗颈基因（eui）表达的影响。结果表明，长选3S穗颈伸出剑叶叶鞘的长度与始花前9～20 d自然条件下的日均温度呈负相关，其中以始花前12～17 d(花粉母细胞形成至减数分裂期)日均温度负相关性最显著。在eui基因表达对温度最敏感的时期进行4种人工温度处理，22℃、24℃、26℃和28℃。28℃条件下eui基因表达受阻；22～26℃条件下eui基因表达，且穗颈伸出剑叶叶鞘的长度随温度降低而增长。     

猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的克隆和序列分析及其基因表达

采取三元杂交猪的外周血,提取单核细胞总RNA,采用RT-PCR克隆猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)cDNA(GenBank登录号为DQ108393)。以pcDNA3.1(-)为质粒载体,构建猪GM-CSF基因真核表达质粒pGM-CSF,对克隆片段进行测序,并进行不同物种间同源性的比较。将重组质粒转染COS-7细胞,Western blotting鉴定表达蛋白的特异性。序列分析表明,GM-CSF的cDNA开放阅读框为435 bp,编码144个氨基酸和大部分信号肽,与用作PCR引物设计的参考序列比较,其核苷酸的同源性为97.5%,氨基酸的同源性为95.1%,同绵羊、人、牛、小鼠和犬的GM-CSF序列比较,其核苷酸的同源性分别为86.2%、80.5%、81.7%、69.7%和81.8%,氨基酸的同源性分别为78.5%、71.3%、70.3%、55.9%和71.5%。Western blotting证实目的基因可以在真核细胞中特异性的表达GM-CSF蛋白。以上结果表明,猪的GM-CSF基因被成功克隆,它存在着种属特异性。这为进一步研究该基因的生物学作用特别是利用GM-CSF增强DNA疫苗的免疫效果奠定了基础。     

11个玉米DOF基因对逆境胁迫的表达模式分析

研究玉米DOF基因在玉米不同组织和非生物胁迫条件下的响应表达模式,为进一步阐明玉米DOF基因的生物学功能提供有价值的信息.利用qRT-PCR技术探测11个玉米DOF基因在'郑58'自交系不同组织中以及在200 mmol/L NaCl溶液、20％PEG6000溶液和铵态氮、硝态氮缺乏胁迫等条件下的表达模式.进化树分析结果...     

水稻胚乳贮藏物代谢相关基因响应花后高温胁迫的微阵列分析

【目的】揭示花后高温条件下水稻灌浆过程中胚乳淀粉和蛋白贮藏物代谢相关基因的表达谱,并阐明部分重要功能基因对花后高温胁迫的响应表达模式。【方法】利用人工气候箱设高温(日均温度32℃,日最高温36℃/日最低温28℃)和适温(日均温度22℃,日最高温26℃/日最低温18℃)2个温度处理,并在水稻开花后的不同时期取样,对水稻胚乳贮藏物代谢各类相关基因的表达谱与表达模式进行高通量的cDNA微阵列检测。【结果】在水稻胚乳贮藏物代谢的相关基因中,以对高温胁迫响应表现较迟钝的基因居多,其高温处理与低温处理之间的杂交信号(nARVOL)比值(称R值)大致在0.8—1.2,但随高温处理时间的持续,呈上调或下调差异表达的基因数量均有明显增加;花后高温对胚乳糖代谢和淀粉合成类基因表达的调控效应,不仅随各个基因的功能类型、代谢途径和灌浆进程的差别变化而异,而且其表达丰度及其上调或下调幅度在很大程度上还与该功能基因的同工型(或酶亚基)有关;高温处理下水稻胚乳中的谷蛋白、醇溶蛋白和球蛋白类基因多呈下调表达特征,但也会随其所调控的蛋白亚基组分的不同而异,从而对胚乳贮藏蛋白的亚基构成和组分变化产生较大影响;与胚乳白贮藏物代谢密切相关的糖信号传导类基因、核糖体蛋白类基因和逆境防御蛋白类基因普遍比直接参与胚乳贮藏物合成路径的功能基因对高温胁迫响应表现敏感。【结论】花后高温胁迫对水稻胚乳灌浆贮藏物代谢的调控相当复杂,涉及到众多的功能基因位点。     

水稻可溶性OsVDAC5蛋白的外源表达及鉴定

通过生物信息学分析确定水稻(Oryza sativa L.)Os VDAC5的可溶性肽段,将相应的编码区克隆于p GEX-4T-1原核表达载体中,进行IPTG诱导表达和GST亲和层析纯化,利用SDS-PAGE和Western Blot检测目的蛋白。结果表明,成功构建的p GEX-4T-1-Os VDAC5(1-75aa)原核表达载体,经过体外IPTG诱导,在35 k Da处可检测到可溶性目的蛋白,并获得外源蛋白表达的最适温度为15℃和最佳诱导时间为8 h;经过GST亲和层析,SDS-PAGE可检测到较为单一的蛋白条带,得到纯化的GST-Os VDAC5(1-75aa)融合蛋白。     

水稻闭花授粉基因cl7(t)的遗传分析与基因定位

【目的】鉴定、遗传分析和定位水稻闭花授粉突变体新基因,了解水稻开花机理,利用闭花授粉基因防止转基因作物花粉漂移。【方法】通过EMS对优良粳稻品种H02进行诱变,发现了一个新的闭花授粉突变体8m30。利用突变体8m30与正常开花授粉材料广恢102配制的杂交种和相应的自交分离群体,采用形态特征观察、杂交后代的表型分离统计和遗传分析、基于图位克隆的基因定位等技术方法,对突变体8m30的表型、遗传和基因定位进行研究。【结果】突变体8m30与野生型H02相比,株高变矮,株型变紧,穗着粒密,在整个抽穗授粉过程中,颖花不张开。遗传分析表明该突变性状受1对隐性核基因控制,位于第7染色体长臂的RM21964和RM234之间,遗传距离分别为0.1 cM和0.3 cM,两者间的物理距离为160 kb,与标记RM21971共分离,是一个尚未报道的基因,暂命名为cl7(t)(Cleistogamy 7(t))。【结论】水稻闭花授粉突变体8m30由位于第7染色体1对隐性核基因控制,位于第7染色体的RM21964和RM234之间160 kb范围内。