牛胎儿成纤维细胞分离与体外培养

本研究以 4 5d牛胎儿为材料 ,使用 0 .2 5 %胰酶 + 0 .0 4 %EDTA消化液 ,分离得到牛胎儿成纤维细胞 ,体外培养传代至第 2 8代。本实验描绘出牛胎儿成纤维细胞生长曲线 ,并发现α MEM是一种适合牛胎儿成纤维细胞生长的培养基。分离得到的牛胎儿成纤维细胞传至第 1 8代时核型仍然正常 ,冷冻、解冻后细胞可继续传代     

鸭胚成纤维细胞培养、传代及保存方法的研究

本研究旨在建立鸭胚成纤维细胞离体培养、传代以及冷冻保存体系,为鸭胚胎或生殖干细胞的离体培养奠定基础。利用胰酶-EDTA消化鸭胚胎组织,10% FBS+DEME营养液培养,获得原代和传代成纤维细胞。分别用DMSO、甘油以及乙二醇作为冷冻保护剂对F1代鸭胚成纤维细胞进行冷冻保存,检测复苏后细胞的生长情况。利用此方法可以获得高活性的鸭胚成纤维细胞,并可成功传至第三代。其中F1代与F2代细胞活力最好,达到90%以上。3种冷冻剂保存的细胞复苏后均与F1代细胞的活力存在明显差异,均小于80%,其中用DMSO冷冻保存的细胞复苏后活力最强,生长密度保持较好。     

牛胎儿皮肤成纤维细胞体外培养及其特性研究

该试验研究了牛胎儿皮肤成纤维细胞的分离、培养、纯化方法及其生长特征.牛胎儿皮肤细胞贴壁传代2～4次.可成功获得均一稳定的成纤维细胞群体.取传至4代的牛胎儿皮肤成纤维细胞进行细胞计数,并绘制其生长曲线.     

鲁西黄牛皮肤成纤维细胞分离与培养的研究

研究了鲁西黄牛耳皮肤成纤维细胞的分离与培养、纯化方法及生长特征,获得了传代培养的鲁西黄牛皮肤成纤维细胞和上皮细胞.鲁西黄牛耳皮肤细胞在体外培养时呈贴壁生长,其原代或早期传代培养物由上皮样细胞与成纤维细胞混合组成.传代培养混合生长的细胞用0.25%胰蛋白酶液37℃下消化处理3～4 min,脱壁悬浮的主要为成纤维细胞.采用反复消化法在传代过程中将二者逐步分离纯化,获得了可正常传代的鲁西黄牛耳上皮细胞系和成纤维细胞系.通过绘制生长曲线研究了鲁西黄牛耳皮肤成纤维细胞的增殖规律.传代培养至12代的鲁西黄牛皮肤成纤维细胞染色体倍性正常.利用第6代成纤维细胞作核供体克隆试验结果证明重构胚体外发育正常,囊胚发育率为27.3%.     

荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞分离培养及冷冻保存方法研究

试验对荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞的分离、体外培养及5种冷冻保存方法进行了研究。结果表明:用DMEM/F12 20%胎牛血清 100IU/mL双抗的完全培养液进行组织块培养,能获得良好的荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞原代培养物;成纤维细胞混合培养物经TrypsinEDTA(0.25%Trypsin,1mmol/LEDTA.4Na)消化所收集到的细胞主要为成纤维细胞,经2~3代传代,可得到纯化的荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞。纯化培养的成纤维细胞在冷冻保护剂和血清成分相同的条件下,选用5种不同的冷冻保存方法进行冷冻保存,其中使用70%细胞悬液 20%胎牛血清 10%DMSO的冷冻保存悬液,先在4℃预冷平衡0.5h,接着在液氮罐口的气态氮中悬挂4h,然后沉入液氮的方法冻存的细胞,解冻后,经台盼蓝染色后进行细胞活力分析,活细胞率为86.68%;培养48h后细胞贴壁率为86.40%,明显高于其他几种方法。     

东北野猪耳皮成纤维细胞系的建立及生物学特征

研究了东北野猪耳皮组织成纤维细胞的分离、培养、纯化方法和生长特性,并对培养细胞进行了污染检测及冷冻保存和复苏培养观察.结果显示:原代培养在接种5d组织块边缘开始游离出单个细胞,到10d细胞生长旺盛;用酶消化法和差速贴壁法得到纯化的东北野猪成纤维细胞;冷冻前和复苏后的细胞活率分别为96.7％和92.7％,差异不显著(P＞0.05);分离纯化的东北野猪成纤维细胞生长曲线正常;支原体和病毒检测呈阴性;成功建立东北野猪成纤维细胞系.     

广西巴马小型猪供核细胞的传代培养和冷冻保存及肌肉成纤维细胞HDAC1基因的mRNA的表达

本试验旨在建立猪颗粒细胞、胎儿成纤维细胞和新生巴马小型猪不同组织来源成纤维细胞的分离及传代培养技术体系和冷冻保存方法,并比较猪卵丘/颗粒细胞和新生巴马小型猪肌肉成纤维细胞HDAC1基因的mRNA表达的差异,从分子水平上鉴定新生巴马小型猪肌肉成纤维作为供体细胞的可行性。运用组织块贴壁培养方法分离不同来源的组织细胞进行培养,并比较了常规冷冻保存和微量冷冻保存对细胞复苏率的影响,同时,运用实时定量PCR的方法检测猪卵丘/颗粒细胞和新生巴马小型猪肌肉成纤维细胞HDAC1基因mRNA表达的动态变化。研究结果表明：（1）猪颗粒细胞单层细胞的生长需要5～6d;用组织块法获得猪胎儿成纤维细胞单层的生长时间为10～11d;用组织块法可以成功地对新生巴马小型猪的肌肉、肺、肾脏、心、睾丸组织的成纤维细胞进行分离和传代培养,肾和睾丸组织的成纤维细胞贴壁生长后,长满形成单层细胞需要12～13d,而肺、肌肉和心脏组织的则需要15～16d。（2）细胞的微量冷冻保存效果优于常规冷冻保存（P〈0.05）。（3）猪卵丘/颗粒细胞与新生巴马小型猪肌肉成纤维细胞HDACl mRNA的相对表达量为1.000比0.985,两者差异不显著（P〉0.05）。新生广西巴马小型猪不同组织来源的成纤维细胞的分离及传代培养和微量冷冻法,丰富了这种猪体细胞的分离培养种类,为其体细胞核移植研究提供了丰富的供体细胞,并从表观遗传的角度分析,鉴定了新生巴马小型猪胎儿成纤维细胞与猪卵丘/颗粒细胞一样适合作供体,为核移植前的供体细胞鉴定提供了新的方法。     

转双基因(pGH/IGF-Ⅰ)猪胎儿成纤维细胞系的建立及鉴定

本研究旨在建立转双基因（pGH/IGF-Ⅰ）猪胎儿成纤维细胞系,保存转双基因猪的成纤维细胞以便于后续细胞水平研究。试验采用胰蛋白酶消化法对猪胎儿躯干组织进行原代培养,通过原代培养、细胞传代、冷冻保存等成功分离出转双基因猪胎儿成纤维细胞,并对细胞进行了形态学观察、冻存前和复苏后细胞活力检测、生长动力学分析、波形蛋白免疫组化及微生物污染检测等生物学特性分析。结果显示,原代细胞经过胰蛋白酶消化和差速离心分离培养出成纤维细胞,冻存前细胞活力为94.3%,冻存3个月后细胞复苏后活力为91.2%;细胞生长总趋势呈“S”型,经历了潜伏期、指数生长期和平台期3个阶段;细胞波形蛋白在成纤维细胞中呈阳性反应;细胞的细菌、真菌、病毒和支原体检测均为阴性。结果表明本试验成功建立了转双基因猪成纤维细胞系。     

金华猪耳缘组织成纤维细胞的体外培养及生物学特性研究

试验以金华猪耳缘皮肤组织为材料,采用组织块贴壁法进行耳缘组织分离、培养、传代,并进行细胞形态观察、细胞冻存前和复苏后存活率测定、生长曲线绘制等生物学特性研究。结果表明:金华猪耳缘组织成纤维细胞呈典型的成纤维细胞形态;细胞冻存前和复苏后存活率分别为95.6%和93.8%;生长曲线呈"s"型。通过试验建立了稳定的金华猪耳缘组织成纤维细胞培养方法,说明组织块贴壁方法是获得成纤维细胞的简单有效方法,获得的细胞可在体外至少传代10代以上,能为体细胞克隆、转基因和异种器官移植等相关研究提供核细胞来源。     

新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞体外培养体系的建立

利用微量液体组织块贴壁法原代培养分离新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞,进行常规传代培养、冷冻和复苏;通过接触抑制和解除抑制研究该类细胞的增殖潜力,免疫荧光进行鉴定;并通过脂质体介导对分离到的新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞分别进行EGFP-N1和DsRed-N1基因转染。结果成功分离到新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞,体外可以大量传代和冷冻,目前已经传至50代以上,生长良好;冷冻复苏和接触抑制解除后仍可以正常培养和传代;细胞免疫荧光检测,波形蛋白表达阳性,角形蛋白表达阴性;转染48h后荧光显微镜下可以观察到绿色荧光和红色荧光,表明瞬时转染新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞可以获得成功,其中转染DsRed-N1基因的新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞已经传至60代以上。结果表明,本试验成功建立了新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞的体外培养体系,在体外能稳定培养和传代,并可以成功获得转基因的新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞。