野桑蚕对溴氰菊酯抗性品系的筛选

1材料与方法 1．1供试昆虫桑叶育筛选抗性品系的原始材料启东野桑蚕（YQD）和苏大桑园野桑蚕（YSD）分别于2004年10月采自江苏省启东市桑园和2006年4月采自苏州大学桑园,室内桑叶育参照文献[6]进行,见专利“野桑蚕的室内饲养方法”;人工饲料育筛选抗性品系的原始材料吴江野桑蚕（YWJ）,2004年10月采自江苏省吴江市桑园,室内人工饲料育参照文献[7]进行,见专利“一种饲育1龄野桑蚕的方法”。     

中国野桑蚕和家蚕的分子系统学研究

 用分子生物学手段对11个地区的野桑蚕（Bombyx mandrina）和25个代表性家蚕（Bombyx mori）品种进行了分子系统学研究。野桑蚕与家蚕的DNA多态分析及其聚类分析结果进一步证实家蚕起源于中国野桑蚕。同时结合有关文献,作者提出了家蚕起源进化的新观点:家蚕可能是由多种生态类型（包括一化、二化、多化）混杂的野桑蚕驯化而来,其驯化之初就已拥有一化、二化、多化的遗传背景,其后几千年的人工饲养、选择才分离演化成为不同系统化性的家蚕品种。     

“桑蚕乳酸脱氢酶基因的克隆与表达分析

为了研究野桑蚕乳酸脱氢酶基因的功能,选择野桑蚕5龄3日幼虫的组织及不同发育时期的个体,利用 PCR 技术对野桑蚕乳酸脱氢酶基因进行克隆,得到野桑蚕乳酸脱氢酶基因开放阅读框长度为996 bp,没有内含子,只有1个外显子。该基因编码的蛋白含有331个氨基酸残基,等电点为6·76,分子量为36·35 kD。氨基酸序列分析表明,该蛋白高度保守,亚细胞定位预测分析表明该蛋白主要定位于细胞质中。转录表达分析表明,该基因在野桑蚕5龄3日幼虫的组织（马氏管、中肠、表皮、脂肪体、丝腺、血液、精巢和卵巢）及不同发育时期的个体（卵、幼虫、蛹和蛾）中均有表达,且表达量趋于一致。表明乳酸脱氢酶基因在野桑蚕的生命活动中可能具有重要的生理功能。     

安康野桑蚕种质资源的研究与保存

为了保存安康不同区域野桑蚕资源,收集安康各地的野桑蚕,建立饲养大棚,保存安康地区野桑蚕材料23份,其他地区野桑蚕材料3份.同时,探索了建立室外大棚饲养保存野桑蚕的方法,构建了人工保存的野桑蚕种质资源库,发现安康野桑蚕一代存在4～5个月的长蛹期.     

野桑蚕对溴氰菊酯抗性品系的筛选

[目的]通过溴氰菊酯对野桑蚕进行抗性品系的筛选,探明该药剂的抗药性发展情况,为科学施药和抗性治理提供依据。[方法]室内饲养繁殖来自3个不同地区的野桑蚕,点滴法测定其亲代对溴氰菊酯的敏感性。分别以半数致死量左右的剂量通过点滴法逐代处理其幼虫,统计幼虫死亡情况,建立毒力回归方程并计算抗药性倍数及其提高倍数。[结果]在桑叶育条件下,经3代室内筛选,启东野桑蚕（YQD）F4代抗药性倍数为14.26,较F0代提高了0.2倍;苏大桑园野桑蚕（YSD）F4代抗药性倍数为16.48,较F0代提高了0.9倍;在人工饲料条件下,经6代室内筛选,吴江野桑蚕（YWJ）F6代抗药性倍数为18.67,较F0代提高了0.2倍。[结论]相同剂量筛选下,YSD比YQD抗药性倍数提高快;YWJ在人工饲料饲育和杀虫剂筛选双重选择下,抗药性发展较慢。     

一份安康野桑蚕线粒体COI序列的克隆和分析

对1份安康野桑蚕线粒体进行了克隆分析,获得了一段长度为1 873 bp的线粒体序列,包含COI基因及其侧翼序列。序列比对表明其与石泉的2份野桑蚕存在48处碱基差异,聚类分析表明其与岚皋县、山东青州共同聚类,与家蚕亲缘关系较近。对6份安康野桑蚕在内的19份不同地域来源的野桑蚕及31份家蚕线粒体COI序列进行了单位点多态性和聚类分析。结果表明:17份中国野桑蚕在67个位点上存在多样性,平均核苷酸差异为25.596,2份日本野桑蚕之间的多态性位点为10个,平均核苷酸差异为10.000;6份安康野桑蚕可分为两大类,其一是石泉县2份野桑蚕与湖南、四川、江苏、湖北等地野桑蚕聚为一大类群,与家蚕亲缘关系较远,其二是包括本次研究在内的4份安康野桑蚕及山东青州野桑蚕与家蚕聚为一大类群,与家蚕亲缘关系较近,显示出安康野桑蚕复杂多样的遗传特性。研究为深入分析安康野桑蚕的遗传多样性,发掘安康野桑蚕种质资源提供理论依据。     

2份野桑蚕材料线粒体ATPsynthase F0 subunit 6基因的克隆及遗传进化分析

本研究对2份野桑蚕材料(ws-aksq和ws-akhb)线粒体atp6基因进行了克隆和序列分析。克隆结果表明,2株野桑蚕atp6基因ORF框全长678bp,编码225个氨基酸残基。序列联配比对结果表明2株野桑蚕atp6基因之间存在6处碱基的差异。ws-aksq野桑蚕atp6基因与家蚕c108、野桑蚕Qingzhou系、野桑蚕日本系的相似度分别为0.9926、0.9912和0.9690;ws-akhb野桑蚕与上述3者的相似度分别为0.9926、1.0000、0.9676。系统发生分析表明,鳞翅目下7个亚科的昆虫atp6基因分别聚为7枝,2份野桑蚕atp6基因与中国系野桑蚕亲缘关系较为接近,与日本株较远。本研究为深入利用线粒体基因组开展野桑蚕分类及与其它昆虫的遗传进化研究提供了理论基础。     

野蚕黑卵蜂寄主识别利它素的来源及性质

寄主卵表面存在对野蚕黑卵蜂有引诱作用的识别利它素，它主要来源于其寄主野桑蚕雌蛾性附腺中，同时发现在其替代寄主桑蚕雌蛾性附腺中也同样存在具利它素活性的物质。取自桑蚕雌蛾侧输卵管的卵涂上雌蛾性附腺内容物后，野蚕黑卵蜂对其的接受率（８３．３％）明显高于缺乏性附腺内容物的侧输卵管卵（３６．７％）．初步探明雌蛾性附腺内容物中具利它素活性的是８ｋＤ以上的大分子物质。     

安康野桑蚕遗传多样性分析

为了解安康不同区域野桑蚕的遗传多样性和对野桑蚕资源有效利用提供依据,采用SSR标记方法并利用DPS v7.05版统计软件,对安康12个不同区域的20个野桑蚕遗传距离进行聚类和多态性分折。结果表明,27对SSR引物扩增出635条带,多态率达81.1%;同一地区野桑蚕个体间的遗传距离为0.073 2~0.517 2,其中ak1与ak2遗传距离最近。SSR标记能够反映野桑蚕之间丰富的多态性,安康野桑蚕之间的遗传距离较大。     

SSR标记在家蚕×野桑蚕后代群体分析中的应用

以家蚕873、874、野桑蚕及其杂交后代群体为试材,通过对杂交亲本及其后代的SSR标记分析,利用DPS v7.05版统计软件进行遗传多态性研究,探讨家蚕、野桑蚕及其杂交后代的亲缘关系。结果表明,26份材料可分为4大类,即栗蚕,白河野桑蚕,汉滨野桑蚕,家蚕873,874和家蚕与野桑蚕杂交后代。亚类划分结果符合品系的来源情况。     

野桑蚕蚕沙DNA的提取方法与应用

研究以野桑蚕蚕沙代替野桑蚕个体提取基因组的可能性,为野桑蚕种质资源的保护与应用奠定基础。保存在无水乙醇的野桑蚕蚕沙使用预冷无水乙醇和EDTA清洗、裂解液裂解、离心富集后,进行蛋白酶K消化和苯酚/氯仿抽提,最后用无水乙醇沉淀获得蚕沙DNA。以此DNA为模板,成功扩增野桑蚕肌动蛋白actin基因834bp和线粒体CoI基因617bp的片段,与使用粪便抽提试剂盒获得的结果一致。     

陕西秦巴山区野桑蚕线粒体COⅠ序列的遗传多样性与系统进化分析

【目的】分析野桑蚕(Bombyx mandarina)的遗传多样性,为发掘和利用其基因资源提供参考。【方法】克隆8份秦巴野桑蚕线粒体COⅠ序列,联合GenBank中39份家蚕、17份野桑蚕COⅠ序列,用DnaSP 5.0软件统计核苷酸多样性和单倍型多样性,采用MEGA X软件构建系统发育树,Network 5.0软件构建单倍型中介网络。基于64份COⅠ序列进行聚类分析,分析遗传多样性和单倍型中介网络,探讨家蚕起源。【结果】克隆了8份秦巴野桑蚕线粒体COⅠ及其侧翼序列,序列长1 531 bp,序列间存在18处核苷酸变异,定义了4个单倍型,8份秦巴野桑蚕与沈阳、青州等北方野桑蚕亲缘关系最近。系统发育树将64份线粒体COⅠ序列聚为4个类群,其中中国野桑蚕聚为2个类群,一是来自陕西、辽宁、山东等的北方野桑蚕,与家蚕遗传距离为0.007 21;二是来自江苏、湖北、重庆等的南方野桑蚕,与家蚕遗传距离为0.019 59;日本野桑蚕群体与家蚕遗传距离为0.031 96。64份COⅠ序列共存在84处单碱基变异位点,定义了31种单倍型。单倍型中介网络图显示,31种家蚕、野桑蚕单倍型总体上可分为3个支系,其中单倍型H_22可能为家蚕祖先单倍型。【结论】秦巴山区野桑蚕与北方省份的野桑蚕亲缘关系最近,秦巴山区可能是家蚕驯化的起源地之一。     

桑蚕的生活习性以及生态特征

对桑蚕生活习性和生态特征研究，较好地反映了家蚕和野桑蚕之间的遗传特性。     

秦巴山区野桑蚕的生物学特性研究

对秦巴山区野桑蚕的生物学特性进行了研究,为进一步利用秦巴山区野桑蚕资源提供依据。     

从野桑蚕体内分离的NPV与BmNPV、AcMNPV间的RAPD分析

将野外收集的野桑蚕核型多角体病毒进行空斑筛选，纯化后的病毒通过碱裂解法抽提基因组DNA，用家蚕核型多角体病毒(BmNPV)和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)的基因组DNA作对照，用随机引物进行PCR扩增。结果表明，野桑蚕分离的NPV与BmNPV、AcMNPV存在较大的差异性，通过版本为1．3b的Treecomw软件分析，表明野桑蚕体内的NPV与BmNPV的同源关系较近，而与AcMNPV的同源关系较远。     

野桑蚕应用于家蚕育种的分子标记分析

为了利用家蚕×野桑蚕的杂种优势,选用家蚕与野桑蚕杂交后代群体为试验材料,用SSR分子标记分析家蚕×野桑蚕杂交后代的亲缘关系。聚类分析结果表明:家蚕与野桑蚕杂交后代群体分为2大类,其中第1大类是以家蚕873为亲本的杂交后代,第2大类是以家蚕874为亲本的杂交后代,聚类划分结果符合品系的来源情况。     

野桑蚕不同组织细胞色素P450 CYP305B1V1基因的诱导表达特征研究

[目的]研究不同诱导物对野桑蚕各组织中细胞色素P450CYP30581V1基因表达的影响。[方法]参照GenBank中公布的野桑蚕CYP305B1V1基因的mRNA序列,设计1对引物,采用半定量RT-PCR方法分析经NaF、芸香苷、氯氰菊酯和蜕皮激素处理的野桑蚕各组织中CYP305B1V1基因的表达情况,并对该基因的氨基酸序列进行同源性比较和进化分析。[结果]氯氰菊酯、芸香苷和NaF影响野桑蚕6TP305B1V1基因在组织中的表达,蜕皮激素无明显影响。氨基酸的同源性分析表明该基因氨基酸序列与家蚕CYP305B1的氨基酸序列同源性最高（100％）;与赤拟谷盗推测的CYP305A1、蜜蜂推测的CYP305A1、果蝇CYP305A1、冈比亚按蚊CYP305A2及库蚊CYP2L1有较高的同源性。[结论]野桑蚕CYP30581V1基因可能主要参与外源性化舍物的代谢,对揭示细胞色素P450的功能和不同药物的代谢机理具有重要意义。     

家蚕副肌球蛋白/小副肌球蛋白基因的克隆及进化分析

[目的]克隆家蚕副肌球蛋白／小副肌球蛋白基因,分析该基因与运动性状的关系。[方法]利用PCR扩增和RACE技术获得了家蚕（Bombyx mori）副肌球蛋白的全长cDNA和小副肌球蛋白的部分cDNA;经检索家蚕wgs（基因组散弹序列）数据,获得了家蚕副肌球蛋白／小副肌球蛋白的基因组序列,并确定其基因组结构。[结果]家蚕PM/mPM基因由17个外显子和16个内含子组成,通过基因内部选择性启动子的使用,该基因组序列同时编码副肌球蛋白和小副肌球蛋白,小副肌球蛋白和副肌球蛋白共用最后6个外显子。家蚕副肌球蛋白与其他无脊椎动物副肌球蛋白的聚类分析表明,家蚕和野桑蚕有最近的亲缘关系,在昆虫纲中与黑腹果蝇关系最远。[结论]家蚕和野桑蚕副肌球蛋白的氨基酸序列间不存在可引起飞行缺陷的点突变,推测家蚕和野桑蚕飞行能力差异存在其他调控机制。     

野桑蚕foxo同源基因的克隆和序列分析

FOX蛋白家族(Forkhead box family,FOX)在昆虫眠性、生长及变态发育等过程中起到重要作用。研究克隆了野桑蚕FOX蛋白家族中的foxo同源基因ORF框及其上下游部分UTR序列,比较了与家蚕同源序列的异同。结果表明野桑蚕foxo基因ORF框长度为1 539 bp,编码512个氨基酸残基。野桑蚕与家蚕foxo基因在核酸序列上存在13处单碱基差异,但两者蛋白序列完全一致。序列分析表明,野桑蚕foxo编码蛋白含有保守的fork-head结构域和FOXO蛋白特有的TAD结构域。进化分析表明,野桑蚕foxo与家蚕亲缘关系最为接近,脊椎动物和昆虫各亚目可按照foxo序列聚为亚群,表明foxo保守性的同时也具有各物种独特的特征。研究在深入开展野桑蚕foxo基因功能分析及其在变态发育过程中的功能研究方面具有一定理论指导意义。     

野桑蚕核糖体蛋白L21基因的克隆及序列分析

[目的]克隆野桑蚕(Bombyx mandaina)核糖体蛋白L21(RPL21)基因并进行半定量分析,为研究RPL21基因在昆虫体内的生物学功能提供参考.[方法]采用RT-PCR克隆野桑蚕RPL21基因序列,并采用半定量PCR分析该基因在野桑蚕4龄幼虫不同组织中的表达情况.[结果]扩增获得的野桑蚕RPL21基因序列全长为586 bp,其包含一个完整的开放阅读框(ORF),长度为480 bp,编码159个氨基酸;预测蛋白的分子量和等电点分别为18 kDa和11.01.序列比对结果表明,野桑蚕与其他12个物种的RPL21基因的相似性介于55.5%~91.6%,其中与致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)RPL21的相似性最低,与家蚕(Bombyx mori)的相似性最高.半定量分析结果表明,野桑蚕RPL21基因在野桑蚕幼虫的中肠、丝腺、脂肪体、血液、睾丸、表皮、卵巢和脑组织中均有表达,且转录水平无明显差异.[结论]野桑蚕RPL21基因进化较保守,在各组织中分布广泛且表达水平稳定.