转录因子CBF4诱导型启动子的克隆及功能分析

根据已有文献及公开的拟南芥基因组序列,利用PCR方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组DNA中扩增得到了转录因子CBF4上游的DNA片断,对其进行序列分析表明与GenBank序列高度同源,同时对其进行初步的功能分析。采用生物信息学方法对这一序列分析的结果显示这一片段具有启动子的特殊结构域;与GUS基因融合构建双元表达载体,转化烟草的组织特异性表达检测可见明显的GUS活性,初步表明所获片断为CBF4基因的诱导型启动子。     

转录因子基因ZmDREB3转化玉米的研究

利用玉米转录因子ZmDREB3基因(Gene ID:EU964828.1)构建了Ubiquitin启动子驱动的植物表达载体PGM0229-ZmDREB3-EP-SPS,以EPSPS基因为抗性筛选标记,通过花粉管通道法将农杆菌EHA105介导的植物表达载体转化到玉米自交系吉444、Mo17中,通过喷洒350mg/L草甘膦除草剂筛选,得到7株草甘膦抗性植株,用PCR检测得到2个同时整合EPSPS标记基因和ZmDREB3目的基因的转基因株系,用PCR-Southern进一步验证,结果呈阳性。以上结果证明外源基因已经被整合到玉米基因组中。     

转录激活因子CBF与植物的抗胁迫能力

很多低温相关基因的启动子中都含有CRT/DRE元件,CBF蛋白可以与该元件结合而使这些基因得以表达。拟南芥CBF基因有4种,分别为CBF1、CBF2、CBF3和CBF4。CBF1、CBF2和CBF3基因聚集在拟南芥第4染色体的短臂上,CBF4定位在第5染色体上。CBF2与CBF1、CBF3与CBF1的核苷酸序列具有较高的同源性,分别为81%和84%。CBF2和CBF3的氨基酸序列分别与CBF1大约有84%和86%相似,且表达模式完全相同。CBF4蛋白由224个氨基酸组成,与其他CBF蛋白有63%的同源性。在CBF1、CBF2、CBF3和CBF4转基因拟南芥植株中,不需低温刺激,4种CBF基因的组成表达都能够激活含有CRT/DRE元件的COR基因表达,从而提高植株的抗冻性。自1997年发现CBF1基因以来,已有很多成功导入CBF基因的报道。本文就这4个转录因子的性质及其在植物抗寒、抗旱和耐盐方面的作用进行了阐述。     

CBF转录因子介导的植物低温信号转导研究进展

对低温造成植物伤害的生理机制、低温诱导的植物信号转导系统、转录因子CBF的结构及表达特征、调控CBF基因表达的上游信号传递体和CBF调控的下游基因进行了概述.旨在为今后揭示棉花响应低温逆境的分子机制以及促进棉花耐低温品种的遗传改良提供理论依据.     

外源转入基因CBF1在转基因草莓中的遗传分析

以5个独立的转CBF1(C-repeat binding factor)基因草莓株系80、83、94、104和10-5-5为材料,套袋自交和正反交,通过对其后代种子中外源基因的卡那霉素筛选,PCR和Southern杂交,并统计数据,数据采用卡方检测.实验结果发现外源目的基因能够稳定遗传,并且是非细胞质遗传;在自交F1代中5个独立的转基因株系中,只有一个表现为基因互作,其余4个株系表现为一定的遗传分离模式;在自交F2代中,由于单果采收进行分析,发现既有3:1、15:1和35:1的分离模式,同时也出现基因互作等.转基因草莓中的外源基因的遗传是比较复杂的.     

转录组解析外源ABA对玉米脱水速率的影响

为了探明迪卡517、郑单1002喷施外源ABA后脱水速率变化的分子机制,发掘影响脱水速率的关键差异表达基因及代谢通路,利用Illumina HiSeq^TM2500测序仪分别对喷施ABA前后迪卡517(脱水速率较快)和郑单1002(脱水速率较慢)的穗位叶进行高通量转录组测序。原始序列经过质量控制、基因组比对、测序饱和度、基因覆盖度及冗余序列分析后进行基因功能注释。结果显示,迪卡517外源ABA处理与正常生长条件对比组检测到1 732个差异表达基因,其中1 251个为上调表达基因,481个为下调表达基因;郑单1002外源ABA处理与正常生长条件对比组检测到52个差异表达基因,其中24个为上调表达基因;迪卡517外源ABA处理与郑单1002外源ABA处理对比组检测到3 867个差异表达基因,其中1 946个为上调表达基因。不同对比组中筛选到差异表达基因GO分类情况、COG基因产物分类、KEGG代谢通路分析不同。转录因子分析共获得多个重要的转录因子家族,主要有AGC蛋白激酶家族、AP2/ERF转录因子家族、ARID转录因子、AUX/IAA转录因子家族、Alfin-like...     

CspB基因植物表达载体的构建及转化玉米自交系的研究

利用来自Bacillus subtilis细菌的CspB基因(Gene ID:936224)构建了Ubiquitin启动子驱动的CspB基因植物表达载体PBPC-CspB-bar,以bar基因为抗性筛选标记,通过花粉管通道法将构建的表达载体转化到玉米自交系京501、京517和吉444,通过喷洒除草剂筛选得到60株草丁膦抗性植株,用PCR检测得到48株bar基因阳性植株,将获得的转基因植株进行CspB基因PCR鉴定,获得13株同时整合CspB和bar的转基因株系。     

棉花CBF基因的克隆及其转基因烟草的抗寒性分析

从中棉12 (Gh12)、中棉36 (Gh36)和海岛棉7124 (Gb7124)品种中克隆并鉴定了棉花的CBF基因,该基因编码一个由184个氨基酸组成的蛋白CBF,该蛋白具有CBF转录因子典型的序列标签“PKRRAGRKKFQETRHP”和“FADSAW”。Southern杂交表明,CBF基因在3个棉花品种中均以基因家族的形式存在。围绕海岛棉7124的CBF基因(GbCBF1)开展的逆境表达谱分析表明,GbCBF1基因受低温、干旱、盐和ABA等多种逆境条件的诱导表达。将GbCBF1基因构建到由强启动子35S和弱启动子NOS这2种启动子控制的植物表达载体pCambia2301上并转化烟草NC89,经过筛选及PCR鉴定,共获得26株转基因烟草。对部分T₁代植株进行的PCR和RT-PCR检测表明,GbCBF1基因可以在烟草中正常转录并遗传。分析表明,在低温下,转基因烟草的电解质渗漏率普遍低于野生型烟草,而游离脯氨酸含量和可溶性糖含量均高于野生型烟草,说明转GbCBF1基因提高了烟草的耐寒性。     

转BADH基因玉米植株的获得及其耐盐性分析

采用超声波辅助花粉介导植物转基因方法, 将甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因导入玉米自交系郑58, 获得了耐盐性强的转基因玉米植株。经卡那霉素抗性初筛、PCR扩增、Southern blot杂交分析, 证明BADH基因已导入转化植株并整合到其基因组中。用不同浓度的NaCl溶液对T₂代转基因玉米植株与对照进行盐胁迫处理, 结果表明, 转BADH基因玉米植株表现出一定的抗逆性, 生长状况明显优于对照; 根据非转化苗对NaCl的反应以及生长状况, 确定250 mmol L^-1 NaCl溶液为玉米幼苗耐盐性筛选的适宜浓度; 依据此临界浓度下形态指标和生理生化指标的测定结果, 与对照相比, 转基因植株的株高提高10.94%~25.7%, 鲜重增加8.62%~18.2%, 干重增加9%~18.18%, 相对电导率降低37.21%~58.14%, 叶绿素含量增加15.89%~90.65%, 超氧化物歧化酶(SOD)活性提高64.92%~148.29%, 丙二醛(MDA)含量减少26.97%~48.05%。综上所述, 转入甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因提高了玉米的耐盐性。这是首例将BADH基因导入优良玉米自交系郑58的报道。超声波辅助花粉介导法是一种经济、高效、实用和无基因型依赖性的植物基因转化方法。     

抗逆调节转录因子CBF1基因提高多年生黑麦草的抗旱能力

通过逆境诱导型启动子rd29B为驱动,分别构建出含有抗逆调节转录因子CBF1基因的表达载体pBAC122,pBAC127,其中pBAC127以CaMV35S启动子驱动的bar基因作为选择标记。用高压氦气基因枪PDS1000/He分别将表达载体导入多年生黑麦草(Lolium perenne)品种Topgun的幼胚、成熟胚和愈伤组织。经除草剂Bialaphos抗性筛选和植株再生,获得了36棵转基因植株。经PCR,Dot-blotting的分子检测,CBF1基因已整合到多年生黑麦草部分转基因株系的基因组中。用5种不同浓度的除草剂涂抹黑麦草叶片,非转基因植株表现为不抗,而转基因植株最高可以抗到135~200 mg/L。叶片脯氨酸含量测定表明,经干旱处理或使用15%PEG处理,转基因植株叶片脯氨酸含量比未处理时显著提高,部分转基因植株提高幅度明显高于非转基因植株。经过25 d人工温室干旱处理,有3棵植株显示出存活迹象,复水后,有1棵植株(C122-7)恢复正常生长。从而表明,利用逆境诱导型启动子(rd29B)来调控外源CBF1基因的表达,能显著改良黑麦草的抗旱能力。     

转录因子CBF4基因的克隆及其植物表达载体的构建

为应用转录因子CBF4基因对苜蓿进行抗逆性改良,试验利用聚合酶链式反应技术(PCR)从拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株中克隆了CBF4基因,与GenBank中基因序列同源性可达99.41%,并将该基因连接到植物表达载体PBI121中,成功构建了适于苜蓿农杆菌遗传转化的植物表达载体,为下一步利用CBF4基因快速培育耐逆性强的苜蓿新品种奠定了基础.     

玉米胁迫诱导表达基因ZmSNAC1的功能分析

NAC转录因子是具有多种生物功能的植物特异转录调控因子,在植物生长发育、器官建成、激素调节和抵抗逆境等方面发挥着重要的作用。我们之前分离得到1个受干旱、盐、冷等非生物逆境胁迫和植物激素ABA诱导显著上调表达的玉米NAC家族成员ZmSNAC1,过表达转基因株系在苗期的耐脱水能力较野生型株系明显提高。在此基础上,本研究进一步对ZmSNAC1过表达转基因株系在植株生殖生长发育时期的抗旱性和耐盐性进行功能鉴定。结果表明,在干旱胁迫条件下,野生型株系相比转基因株系较存活率提高50%~52%,相对电导率降低17%~21%,叶绿素含量提高36%~47%,脯氨酸含量提高了17%~23%;在300mmol L^-1 NaCl胁迫条件下,转基因株系的存活率提高36~40%。ZmSNAC1可能作为一个正向调控因子在逆境胁迫信号转导过程中发挥重要作用。     

独行菜CBF基因的克隆及其植物表达载体的构建

本实验以新疆早春短命植物独行菜(Lepidiumapetalum Willd)为主要材料,利用聚合酶链式反应从独行菜中克隆了CBF( C-repeatbinding factor)基因家族中的CBF 3基因和CBF4基因,并将其成功构建到带有35 S+Ω的植物表达载体pCAMBIA 2300中,为进一步转化拟南芥以了解独行菜CBF基因的结构和功能奠定了基础.     

转水稻OsSIK1基因玉米植株的获得及抗旱性分析

类受体激酶基因Os SIK1具有通过激活抗氧化系统,增强水稻对于干旱和盐胁迫抗性的作用。为了丰富可利用的作物抗旱基因,获得具有较高抗旱水平的玉米新种质,通过超声波辅助花粉介导法,将水稻类受体激酶基因Os SIK1导入玉米自交系郑58中,并对转化株进行卡那霉素筛选及T1、T2、T3的PCR及Southern Blotting杂交等分子检测,获得转化植株并在T3获得转基因纯合株系。对T3转基因玉米和非转基因玉米对照以16.1%的PEG模拟水分胁迫进行抗旱性分析。结果表明,与对照相比,在水分胁迫处理下,转基因玉米株系叶片相对含水量提高了7.4%~19.8%,叶绿素含量提高了11.3%~106.9%,SOD活性上升45.8%~93.4%,而转基因玉米叶片的相对电导率下降了35.4%~58.1%,MDA含量下降了25.7%~50.4%,说明转Os SIK1基因玉米植株抗旱性得到提高,其中,5个转化株系与对照在抗旱性方面有显著差异,且生长状况明显优于对照。综上所述,研究最终获得5个转Os SIK1基因玉米株系,并证明导入水稻Os SIK1基因可以提高玉米植株的抗旱性。     

油棕CBF基因的克隆及与禾本科植物CBF基因的进化关系

本研究致力于克隆油棕低温相应转录因子基因CBF。以NCBI网站上公布CBF基因设计引物,对油棕的基因组进行扩增,并对其进行回收,转化和测序。总共测了11个克隆,测序结果显示这11个克隆中有3个不同拷贝的CBF基因序列,它们序列之间的同源性分别是,99%,92%和91%。将克隆的CBF基因与不同物种的CBF基因进行了聚类分析,分析结果显示：这些不同物种的CBF基因可以分为3类,克隆的油棕的3个CBF基因被聚在一块,此外,油棕CBF基因与HvCBF1,OsDREB1E,HvCBF11以及TaCBF11的同源性较高。采用同源序列法,克隆了3个拷贝的CBF基因,通过Blast比对发现,克隆的CBF基因与NCBI数据库现有的CBF基因具有很高的同源性。这些工作将为油棕抗寒的分子选育奠定基础。     

玉米Gln1-4的gDNA序列、基因结构、保守功能域与等位变异

本研究旨在分离玉米谷氨酰胺合成酶(GS)家族重要成员Gln1-4 gDNA序列全长,分析基因结构、保守功能域与自然等位变异,为氮利用效率功能位点关联性分析奠定基础。利用PCR步移(walking)方法分离Gln1-4基因区域基因组DNA序列,用生物信息学方法分析基因结构与保守功能域,测序与序列比对法分析重要区域自然等位变异。结果表明,分离得到自交系Mo17 Gln1-4区域gDNA 3 724 bp,起始密码子至终止密码子序列长2 858 bp,登录到GenBank (登录号为EU369651), 并注释。Gln1-4基因含10个外显子与9个内含子,18个剪接位点均为保守的5'供位GU与3'受位AG模式。编码的GS蛋白由356个氨基酸组成,分子量39.2 kD,等电点(pI)为5.202。氨基末端外显子2到外显子6为氨离子结合结构保守功能域;羧基末端外显子8与外显子9构成ATP酶活性保守功能域。Gln1-4与Gln1-3基因相比,在DNA序列、氨基酸序列、基因结构、保守功能域均很保守,氨基酸序列一致性达98.31%。52个玉米自交系的Gln1-4等位变异分析中,共鉴定出318个等位变异位点,其中242个SNP,45个Indels,占90%。该基因氮利用效率功能关联性分析区间应位于氨离子结合功能域与ATPase活性保守功能域中重要的变异位点,18个剪接位点。     

扁桃CBF1基因的克隆与生物信息学分析

为揭示CBF基因在扁桃抗逆机制中发挥的功能,对扁桃CBF1基因进行克隆与分析。以新疆扁桃主栽品种‘鹰嘴’为材料,根据已经报道的CBF1基因序列设计引物,通过PCR技术从扁桃基因组DNA中获得CBF1基因,命名为YZ-AcCBF1,并已登录GenBank（登录号KJ818900）。经生物信息学分析,该基因开放阅读框为729 bp,编码242个氨基酸,分子式为C₁₁₉₅H₁₈₈₆N₃₄₆O₃₆₈S₁₃,相对分子质量为27.405 kDa,等电点为7.69,半衰期为30 h,脂肪系数为63.72,疏水性平均值为-0.646。对其亚细胞定位、跨膜结构、信号肽及疏水性/亲水性进行分析,表明其定位在细胞核,不存在跨膜结构,为非分泌性亲水蛋白。系统发育分析结果显示其与桃(AGS13699)的亲缘关系最近。二级结构预测显示该蛋白主要由26.86%的α螺旋和58.68%的无规卷曲组成。三维结构预测表明其符合AP2结构域模型特点。