粘质沙雷氏菌几丁质酶(ChiC)基因克隆及其生物信息学分析

从粘质沙雷氏菌(Serratia marcescensATCC14041)中克隆出几丁质酶基因(ChiC),将回收纯化的PCR产物与载体pMD18-T连接,构建成的重组质粒命名为pMD-Ch iC,将重组质粒转化到受体E.coliDH5α中进行克隆,经BamHI和NheI双酶切验证、核酸序列测定证实,重组质粒pMD-Ch iC含有几丁质酶C基因(ChiC)。利用生物信息学的方法,推测该粘质沙雷氏菌ChiC基因编码的蛋白质由480个氨基酸组成。预测该蛋白的等电点为5.63,分子量约为52kD。针对粘质沙雷氏菌中的几个几丁质酶基因做了进化树,进而验证了粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)几丁质酶(ChiC)在沙雷氏菌几丁质酶中的分类;同时对粘质沙雷氏菌几丁质酶C(ChiC)蛋白的高级结构作出了预测,得到其编码的属于18家族的蛋白质高级结构图谱。     

黏质沙雷氏菌C8-8几丁质酶基因的克隆与表达

利用PCR方法从黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)C8-8中克隆到编码几丁质酶的chiA基因,大小为1 692 bp,推测其编码一条长563个氨基酸的多肽链,分子量约为60 900。同源分析研究结果表明从C8-8中克隆的chiA基因序列与黏质沙雷氏菌株141(DQ 990373.1)和14041菌株(DQ 493896.1)的chiA基因序列相似性最高,达到99%。结构域分析结果表明从C8-8中克隆的chiA基因N末端(23 AA)存在典型的信号肽序列,C端存在另外两个结构域,即PKD区(73 AA)和几丁质酶催化区(387 AA)。采用大肠杆菌表达系统重组表达chiA基因,结果表明重组菌株在几丁质诱导培养基上能产生透明的水解圈。采用SDS-PAGE电泳分析,结果表明chiA重组表达产物的相对分子质量约为60 000,与预测分子量大小基本一致。初步提纯后,生物活性试验结果表明该重组表达产物能水解几丁质,在几丁质培养基上产生透明的水解圈。     

黏质沙雷氏菌产几丁质酶的诱变

分析了紫外线、NaNO2及其复合处理对黏质沙雷氏菌产几丁质酶的诱变效果,经几丁质平板透明圈初筛与摇瓶复筛,筛选出1株几丁质酶活较高的诱变菌株NU2,产量为出发菌株的2.75倍.研究发现,原生质体紫外线诱变对酶活的提高效果比菌悬液NaNO2诱变更明显;复合诱变中,菌悬液经NaNO2诱变后再经原生质体紫外线诱变的方法产酶能力更强,且菌株遗传稳定性较好.     

黏质沙雷氏菌与农药混配增效作用

为明确黏质沙雷氏菌ZJ9与杀虫剂混配对草地贪夜蛾幼虫的联合作用,本试验采用浸叶法测定黏质沙雷氏菌ZJ9分别与10种杀虫剂（乙基多杀菌素、苦参碱、虫酰肼、阿维菌素、虫螨腈、苏云金杆菌、斜纹夜蛾核型多角体病毒、虱螨脲、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、杀虫单）混合使用对草地贪夜蛾2龄幼虫的杀虫活性。结果表明,1.00×10⁸ CFU/mL的黏质沙雷氏菌ZJ9分别与6%乙基多杀菌素SC、32 000 IU/mg苏云金杆菌WP、10亿PIB/mL斜纹夜蛾核型多角体病毒SC、0.10 mg/L的虱螨脲SC和0.05 mg/L的甲维盐EC等体积混配表现出增效作用,其中与甲维盐混配效果最好,且最佳混配比为7∶3（共毒指数130.33）。本研究可为探究黏质沙雷氏菌与杀虫剂间的联合作用提供依据,为草地贪夜蛾防控中化学农药的减量使用提供参考。     

4种栽培模式下铁皮石斛提取物抑菌活性

设计林下床栽、林下附生、林下悬挂和大棚床栽等4种栽培模式,比较铁皮石斛提取物抑菌活性。结果表明:林下附生铁皮石斛提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和黏质沙雷氏菌H30的抑菌效果最好,抑菌直径分别为12.64、11.93和8.49mm,最低抑菌浓度(MIC)为15.62、31.25和250μg·mL~(-1);林下床栽的铁皮石斛提取物对铜绿假胞杆菌和黏质沙雷氏菌MG1的抑菌效果最好,抑菌直径分别为9.35和9.33mm,MIC分别为62.5和125μg·mL~(-1)。同时,林下附生的铁皮石斛提取物多糖含量为78.54%,醇溶性浸出物含量为36.01%,在各铁皮石斛中含量最高。相关性研究显示,多糖与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌呈现显著正相关(P0.05或P0.01),相关系数分别为0.995和0.951。浸出物与黏质沙雷氏菌MG1呈现显著正相关(P0.05),相关系数为0.984。可见,不同栽培模式影响到铁皮石斛的功能成分,进而也影响了抑菌效果。     

一株耐高温抑菌黏质沙雷氏菌的鉴定及其红色素的初步分离

[目的]为了了解黏质沙雷氏菌的抑菌机理及温度对其产生色素的影响。[方法]从土壤中分离纯化得到1株产红色素细菌,对该菌进行生理生化和16S rDNA鉴定,同时对该菌产生的红色素进行了初步的探讨。[结果]该菌为黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens),在28℃条件下培养红色素产量最高,37℃下仍能产生色素,说明该菌株是耐高温红色素产生菌。紫外全波长扫描分析和薄板层析结果表明,其红色色素有可能是灵菌红素。[结论]该菌对霉状杆菌和镰刀菌等病原菌具有一定的抑制作用。     

地沟油与食用油中微生物群落结构多样性的比较

为了研究地沟油与食用油中微生物群落结构多样性,采用NA培养基分离纯化菌株,16S rDNA通用引物进行PCR扩增,用Hinf Ⅰ和TaqⅠ2种限制性内切酶对扩增产物进行ARDRA酶切,通过MVSP软件进行聚类分析(UPGMA),并对代表菌株进行测序.结果表明:从地沟油和食用油中分离出的18株细菌,其16S rDNA酶切聚类分析显示在84％的相似水平上分成5个类群,表现出了丰富的遗传多样性.16S rDNA序列测定及系统进化分析表明,这18株菌主要为解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、嗜线虫沙雷氏菌(Serratia nematodiphila)、黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia).     

黏质沙雷氏菌灵菌红素合成基因簇异源表达及其潜在的温度调控机制

[目的]构建黏质沙雷氏菌FZSF02灵菌红素合成基因簇的异源表达菌株,探究其合成灵菌红素可能的温度调控机制.[方法]构建3种携带不同启动子的异源表达大肠杆菌菌株,并利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测FZSF02中pig基因簇pigA、pigF、pigN基因在37℃与28℃培养条件下的转录水平差异.[结果]在2...     

高产过氧化氢酶菌株的鉴定与产酶条件

为解决过氧化氢废水对环境的污染,从稻田土中筛选到1株高产过氧化氢酶菌株。经形态学观察和分子生物学鉴定,确认该菌属于黏质沙雷氏菌,命名为Serratia marcescens FZSF02。通过培养基碳源、氮源、无机盐类型及产过氧化-氢酶条件优化。在培养条件为:1%大豆蛋白胨、0.5%麦芽糖、0.2%NaCl、31℃、180r·min~(-1)、发酵时间48h,菌株产过氧化氢酶总酶活最高达6 380U·mL~(-1),比优化前提高了7.4倍。粗酶液最适反应温度为60℃,最适反应pH为8.0。该菌在过氧化氢废水无害化处理和其他工农业过程中有很好的应用潜力。     

普城沙雷氏菌RsmA蛋白过量表达菌株的构建

普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)G3是本课题组从山东泰安小麦茎秆中分离的1株内生细菌,能产生几丁质酶、蛋白酶和硝吡咯菌素等多种抗真菌因子.次生代谢物阻遏蛋白RsmA(Repressor of secondary metabolite)已知在细菌中是高度保守的,已在大部分革兰氏阴性菌和某些革兰氏阳性菌如枯草芽孢杆菌中被鉴定[1],例如在欧文氏菌Erwinia中,RsmA属于Rsm蛋白家族,主要由两个成员组成:RsmA(RNA结合蛋白)和RsmB(一种不翻译的调控sRNA分子,能消除RsmA的翻译阻遏功能).     

禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)几丁质酶基因特征分析

禾谷镰刀菌是引发麦类赤霉病的优势种,对禾谷镰刀菌基因组中几丁质酶基因的研究可以帮助理解其致病机理。通过对禾谷镰刀菌基因组数据库的搜索分析,发现了16个ORFs编码的假定几丁质酶,它们都属于糖水解酶18家族。通过与它们的糖水解酶家族比较,对这些几丁质酶进行了系统的命名,按pI值从小到大进行编号为Chi18-1～Chi18-16,研究分析这些几丁质酶蛋白的信号肽、活性位点和亚细胞定位,进行了多序列比对,并建立了系统发生树,为禾谷镰刀菌中的几丁质酶在其致病性和相关生物防治方面的研究奠定了基础。     

粘质沙雷氏菌中乙偶姻合成途径调控基因的鉴定

粘质沙雷氏菌H30中控制乙偶姻合成的调控因子budR被克隆和鉴定。序列分析表明调控因子budR与液化沙雷氏菌MG1中乙偶姻合成调控因子slaR同源性达80%,属lysR型调控因子。调控因子budR突变可导致粘质沙雷氏菌无法合成乙偶姻,引起培养液pH快速下降和菌体生长缓慢,而在培养过程中维持pH7.0,突变菌的生长可获得恢复,暗示budR的功能为调控粘质沙雷氏菌发酵过程中性产物乙偶姻的合成,以阻止发酵液过度酸化。     

粘质沙雷氏菌发酵工艺参数研究

研究了发酵温度、培养基pH、接种量及溶解氧等对粘质沙雷氏菌生长的影响,得出粘质沙雷氏菌的优化培养条件为温度30℃左右,pH 7.0～7.5,接种量1:10,通过振荡或通气的方法保证培养基中含一定的溶解氧有利于细菌的生长。用发酵罐测定了粘质沙雷氏菌的生长曲线,在上述优化培养条件下粘质沙雷氏菌约4 h后进入对数生长期,18 h达到稳定期,最终菌液浓度达16.00亿/mL。     

几丁质酶及基因参与水杨酸诱导香蕉枯萎病抗性

由尖孢镰刀菌古巴专化型真菌引起的香蕉枯萎病已成为最具毁灭性的香蕉病害,严重威胁香蕉产业的健康可持续发展.因此对香蕉枯萎病病程相关基因的研究显得尤为重要.比较了Foc4侵染下,香蕉6个病菌应答相关基因的表达;分析了Foc4处理和SA+Foc4处理的易感病巴西蕉幼苗外部形态特征、几丁质酶活性及几丁质酶基因表达的变化.结果发现Ma-14-3-3c、Ma-14-3-3d、Ma-14-3-3e、Ma-14-3-3f、Ma-Cel和Ma-Chi6个基因都能在转录水平响应Foc4的胁迫;与Foc4处理相比较,SA+Foc4处理的香蕉幼苗枯萎病抗性增强,根系几丁质酶活性和几丁质酶基因表达水平提高.表明几丁质酶等6个基因参与了香蕉枯萎病的生物逆境胁迫应答,同时外源水杨酸处理能够通过诱导香蕉几丁质酶的活性及几丁质酶基因的表达增强香蕉对枯萎病的抗性.     

几丁质酶编码基因FolCTS3参与调控尖孢镰刀菌几丁质酶活性和致病力的研究

番茄枯萎病是一种由尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici, Fol)引起的土传植物病害,严重影响番茄农业生产。几丁质酶(CTS)在丝状真菌中保守存在,在真菌细胞壁形成过程中起着关键作用,但是否参与尖孢镰刀菌的致病过程目前尚未见报道。在Fol中鉴定到2个几丁质酶编码基因FolCTS2和FolCTS3,利用基因敲除方法研究其在病原菌致病中的功能。结果表明:缺失FolCTS3不影响Fol菌丝生长及对非生物胁迫的耐受能力,但显著影响几丁质酶活性和致病力,其缺失突变体的几丁质酶活性和致病能力显著下降;而缺失FolCTS2对Fol生物学表型无显著影响。这一研究提示几丁质酶编码基因FolCTS3参与调控尖孢镰刀菌的几丁质酶活性和致病过程,为解析尖孢镰刀菌的致病分子机制及番茄枯萎病防治策略的制定提供了理论依据。     

转基因烟草植株的检测

对采用叶盘法以质粒PBLGC为介导转化烟草的3个品种。经Kan抗性筛选获得的119株转化的烟草再生植株分别以启动子CaMV35S、几丁质酶基因和β—1，3-葡聚糖酶基因的引物进行PCR检测，分别获得91、72、47株阳性植株。其中，同时具有几丁质酶基因和β-1，3-葡聚糖酶基因的植株有36株。对部分转化植株进行PCR—Southern杂交实验的结果表明，外源基因的转化频率与植物品种、外源基因片段的大小有关。又对4株转基因植株后代(T1)进行了PCR、PCR—Southern杂交，结果发现，几丁质酶基因和β-1，3-葡聚糖酶基因已经稳定地遗传给后代，但二者的遗传传递率不同，β—1，3-葡聚糖酶基因似乎比几丁质酶基因更易于传递。另外，对转化植株T0代几丁质酶活力检测结果表明，转基因植株中几丁质酶活力显著增强，含有几丁质酶基因和β-1，3-葡聚糖酶基因的植株内切几丁质酶活力最强。     

石油污染土壤中高效苯酚降解菌的分离鉴定及特性研究

[目的]从石油污染土壤中分离高效苯酚降解菌,对其进行鉴定,并研究其特性,为含酚废水的处理及环保工程菌株构建奠定基础,具有一定的理论和实际应用价值。[方法]从四川省南充市炼油厂附近石油污染土壤中筛选、驯化得到1株高效苯酚降解菌株XH-10。通过形态学、生理生化特性研究及16S rDNA进化分析对其进行鉴定。最后,对XH-10的生长和苯酚降解特性进行研究。[结果]XH-10为短杆、革兰氏阴性、端生鞭毛、无荚膜,16S rDNA与多株黏质沙雷氏菌（Serratia marcescens）的同源性高达99.2%,初步确定XH-10为黏质沙雷氏菌属。XH-10最适生长和降解苯酚的温度为20~35℃,最适pH为6.0~9.0;24 h内对10 mmol/L的苯酚降解率达到99.29%,在含有20 mmol/L苯酚的无机盐培养基中该菌也能生长。[结论]XH-10具有很强的适应能力和苯酚降解能力,可用于高浓度含酚废水的生物处理,有较高的研究及应用前景。     

苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因chiA在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

[目的]研究来源于苏云金芽孢杆菌的几丁质酶基因chiA在枯草芽孢杆菌中的表达情况。[方法]以苏云金芽孢杆菌染色体DNA为模板,PCR扩增获取几丁质酶基因chiA,将其与枯草芽孢杆菌表达载体pHSG连接,构建重组菌,经IPTG诱导后,检测培养液中的几丁质酶活性。[结果]扩增得到几丁质酶基因chiA大小为2.5 kb。构建的重组菌对底物[4-MU-(GlcNAc)3]显示出一定的水解活性,培养液酶活约为2.8 U/ml,而pHSG空质粒转化子在同样条件下其培养液没有明显酶活。该重组酶的最适pH值为6.5,最适反应温度为50℃,与苏云金芽孢杆菌自身产生的几丁质酶性质一致。[结论]几丁质酶基因chiA能在枯草芽孢杆菌中成功表达,表达产物可成功分泌到细胞外。     

高产几丁质酶的粘质沙雷氏菌株的诱变选育

以黑龙江省科学院微生物研究所实验室保存的1株粘质沙雷氏菌S68为出发菌株,进行原生质体紫外线、Na NO2和复合诱变,通过透明圈对比和酶活测定,最终获得1株产酶量高于原始菌株4.3倍的粘质沙雷氏菌诱变菌株,产酶量达到4.98μg·h-1。确定该菌株最佳诱变方法为复合诱变,首先进行紫外诱变(高度为30 cm,诱变时间为12 s),再用化学诱变(0.4 mol·L-1Na NO2诱变5 min),经验证该诱变菌株遗传稳定。