兰州大尾羊H-FABP基因荧光定量PCR检测方法的研究

通过对兰州大尾羊尾部、大网膜、肝脏、肾周脂肪组织中的总RNA提取,反转录获得总cDNA样品,结合PCR技术,建立了SYBR荧光定量PCR法检测兰州大尾羊心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因mRNA在不同组织中相对表达量的试验方法,并进行批内、批间重复性检验。结果表明,H-FABP和18S基因标准曲线回归方程分别为CtH-FABP=-3.24375x+38.34230和Ct18S=-3.33137x+33.4573,相关系数(r2)分别为0.9964和0.9992,扩增效率分别为103%和99%;批内、批间重复性测定的变异系数分别为小于1.8%和10%;说明该方法灵敏度高、特异性强、准确可靠、重复性好,是实时荧光定量PCR检测兰州大尾羊心脏型脂肪酸结合蛋白基因mRNA表达量的有效方法。     

兰州大尾羊H-FABP基因荧光定量PCR检测方法的研究

通过对兰州大尾羊尾部、大网膜、肝脏、肾周脂肪组织中的总RNA提取,反转录获得总cDNA样品,结合PCR技术,建立了SYBR荧光定量PCR法检测兰州大尾羊心脏型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）基因mRNA在不同组织中相对表达量的试验方法,并进行批内、批间重复性检验。结果表明,H-FABP和18S基因标准曲线回归方程分别为CtH-FABP =-3.24375x+38.34230和Ct18S=-3.33137x+33.4573,相关系数（r2）分别为0.9964和0.9992,扩增效率分别为103%和99%;批内、批间重复性测定的变异系数分别为小于1.8%和10%;说明该方法灵敏度高、特异性强、准确可靠、重复性好,是实时荧光定量PCR检测兰州大尾羊心脏型脂肪酸结合蛋白基因mRNA表达量的有效方法。     

兰州大尾羊血液蛋白(酶)多态性的研究

以126只兰州大尾羊为实验对象,采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对血清酯酶(Es)、淀粉酶(Amy)、乳酸脱氢酶(LDH)、血红蛋白(Hb)、白蛋白(Alb)、后白蛋白(Po)和转铁蛋白(Tf)等7个蛋白位点进行了多态性检测和遗传多态性分析。结果表明,在所检测的7个蛋白位点中,Es、Hb、Po和Tf等4个蛋白位点表现多态性,而Alb、Amy和LDH等3种蛋白(酶)未检测到多态性。其中,Es基因座上共检测到3种基因型,即Es++、Es+-、Es--;Po基因座上表现出2种基因型,即AA、AB;Tf蛋白位点上表现出5种基因型,分别为AC、BB、CC、BC、CD;Hb蛋白位点上表现出3种基因型,分别是AA、AB、BB。群体遗传分析表明,Es、Hb、Po、Tf的杂合度分别为0.4987、0.4574、0.3346、0.5547。Es、Hb、Po、Tf蛋白位点有效等位基因数分别为1.9948、1.8430、1.5029、2.2457。卡方检验表明,在Es、Po、Tf、Hb多态性位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态。兰州大尾羊种内平均有效等位基因数、平均杂合度、平均多态信息含量分别为1.8966、0.4614、0.3802。平均杂合度和有效等位基因数呈明显下降趋势。     

利用荧光实时定量PCR法测定猪肌肉中解偶联蛋白3 mRNA丰度

用SYBR GreenⅠ荧光实时定量PCR技术,以β-actin为参照基因,建立了猪肌肉中解偶联蛋白3(UCP3)基因mRNA丰度的定量分析方法。UCP3基因片段的PCR产物测序与GenBank中该基因的序列一致,定量PCR过程中UCP3的熔解曲线也表明该PCR过程为特异性扩增。猪肌肉样品UCP3 mRNA样品的批内和批间变异系数分别<2%和<11%,标准曲线R2=0.998,线性范围涵盖样品的Ct值。由此,实验建立的猪肌肉UCP3基因mRNA丰度测定方法是可靠的、准确的,可以用于猪肌肉中UCP3 mRNA丰度的测定。     

兰州大尾羊微卫星DNA多态性研究

研究旨在分析兰州大尾羊的微卫星DNA多态性,以期了解该品种的遗传多样性,为该品种保种选育和品质的进一步提高提供资料。选择15对微卫星引物,通过计算基因频率、多态性信息含量、有效等位基因数和杂合度,评估其品种内的遗传变异。结果表明:在15个座位中,共检测到153个等位基因,每个座位平均为10.2个等位基因;座位平均杂合度为0.8149;平均有效等位基因数为6.0891;平均多态性信息含量为0.7762。结果提示,兰州大尾羊群体存在丰富的遗传多样性,所选微卫星标记可用于绵羊遗传多样性评估。     

羊传染性脓疱病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank已经发表的CEV参考毒株(登录号:AF097215)F1L基因序列,利用Primer Express 3.0软件设计合成1对特异性引物,以pMD19-T-63bp重组阳性质粒作为标准品,建立了羊传染性脓疱病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。经过反应条件的优化,建立的羊传染性脓疱病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的线性关系良好,标准曲线的相关系数R2=0.99,扩增效率E=1.18。该方法敏感性高且特异性强,最低检出下限为65.47拷贝/μL,与羊痘和口蹄疫病毒均不发生交叉反应,重复性好,组内和组间变异系数分别为0.17%~0.59%和0.74%~1.25%。运用该方法对2例羊传染性脓疱病例进行检测,结果均为阳性。因此,可将该方法应用于临床诊断,具有准确、高效、快捷、灵敏的特点。     

兰州大尾羊种质资源的保护和发展

兰州大尾羊(Lanzhou fat tailed sheep)是我国16个著名地方绵羊品种之一,属长脂尾型,是清朝同治年间(1862—1875年)由陕西大荔一带引进的同羊与兰州当地蒙古羊杂交自然选育而成,主要分布在兰州市及定西市临洮县等周边地区。具有耐粗饲、抗病能力强、饲料利用率高、适应性强、肉质鲜美等特点,尤以其尾大、脂肪充实而著称。1999年被国家列为濒临灭绝的资源。2006年6月,农业部确定兰州大尾羊等138个畜禽品种为国家级畜禽遗传资源保护品种。研究结果表明,其灭绝频率为0.77,为北方11个绵羊品种之首,品种贡献率为10.52%,居于第三,保护潜力为0.1419,居第1位。因此,保护兰州大尾羊这一珍贵的地方绵羊品种迫在眉睫。     

兰州大尾羊尾部脂肪细胞发育性变化研究

为了研究兰州大尾羊尾部脂肪组织的发育变化,运用显微成像处理系统中的Measure distance功能,测定样品的脂肪细胞形态学参数.结果表明,兰州大尾羊尾部脂肪细胞大小随生长发育呈现持续增加的趋势.说明兰州大尾羊尾部脂肪的沉积以脂肪细胞增大为主要方式.     

羊口疮病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR法的建立

为建立快速、灵敏、特异的检测羊口疮病毒(ORFV)的方法,基于羊口疮病毒保守序列B2L基因合成一对用于建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的特异性引物,将ORFV B2L全长基因和pMD19-T质粒载体连接,构建重组阳性质粒,以构建的重组质粒DNA作为模板,建立ORFV SYBR Green I实时荧光定量P...     

奶牛ACC基因SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

乙酰辅酶A羧化酶(ACC)在奶牛肝脏中脂肪酸的合成及氧化代谢过程中起着关键作用,ACC mRNA的表达水平对于研究奶牛酮病、脂肪肝等物质代谢障碍性疾病具有重要意义。研究采用双标准曲线法,成功建立了奶牛ACC基因荧光定量检测方法。结果表明,建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法具有操作简便、特异性强、定量准确等优点,为进一步对ACC基因定量分析,研究其在奶牛酮病、脂肪肝等营养代谢性疾病中的作用奠定了基础。     

聚合酶链式反应检测猪细小病毒方法的研究

本研究依据编码猪细小病毒结构蛋白VP2基因序列,合成了一对寡核苷酸引物,通过减少病毒核酸的提取时间、费用及优化聚合酶链式反应(PCR)的条件,成功地从猪细小病毒(PPV)感染的细胞中扩增出预期的158 bp片段,经EcoRⅠ酶切鉴定,证实了该扩增片段的特异性.经敏感性试验测定,PCR的最低检出量为0.008病毒血凝(HA)单位.这些结果表明本试验建立的PCR对PPV的检测人有快速、简便、经济、灵敏度高和特异性强的特点.     

犬轮状病毒荧光定量RT—PCR检测方法的建立

目的:建立轮状病毒快速准确的检测方法,为研发诊断试剂盒和疫苗奠定基础。方法:用Primer5软件设计VP7引物,从采集的腹泻犬粪便样品抽提病毒RNA,用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,将RNA反转录为cDNA,并进行PCR扩增,对扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和测序,与代表株的VP7进行同源性比较。结果:从腹泻病犬粪便样品中抽提到了轮状病毒RNA,反转录后扩增产物为51bp的基因片段,经核苷酸序列分析,其PCR序列与犬轮状病毒VP7基因编码源序列的同源性为86.3%。结论:正确克隆了轮状病毒主要保护性抗VP7基因中抗原表位区,建立了犬轮状病毒实时定量诊断方法,为研制实时定量诊断试剂盒奠定了基础。     

PCR检测猪伪狂犬病病毒方法的研究

根据编码猪伪狂犬病病毒gH基因保守序列，设计合成一对引物，通过改进病毒核酸提取方法和优化PCR反应条件，成功的从猪伪狂犬病毒感染的细胞中扩增出预期的355bp片段。而猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒和正常细胞均未扩增出相应的片段，经NaeⅠ酶切鉴定，证实了该扩增片段的特异性；敏感性实验表明，该体系可检测到0．48Pg的猪伪狂犬病毒DNA。本方法的建立使猪伪狂犬病病毒的检测更为快速、简便、经济、实用。     

猪伪狂犬病病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立

针对猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)gE基因保守区的核苷酸序列设计1对特异性引物和TaqMan探针,建立并优化了一种可快速、定量检测PRV野毒的TaqMan实时荧光定量PCR方法。应用该方法检测猪常见病毒性病原(猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型),PRV gE基因缺失株,以及健康猪的组织,结果均为阴性,证明该方法特异性良好。该检测方法能够检到的阳性质粒模板最低浓度为254 copies/μL,最低病毒浓度为4.22 TCID_(50)/100μL,比常规PCR敏感性高10倍;重复性试验结果表明该方法重复性良好;用TaqMan实时荧光定量PCR方法和常规PCR方法同时检测37份临床样品,其中前者检出阳性病料22份,阳性检出率为59.64%,后者检出阳性病料15份,阳性检出率为40.54%,2种方法的符合率为81.08%。综上所述,该方法的建立为PRV的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。     

兰州大尾羊肾动脉血管分布铸型研究

为了研究兰州大尾羊肾脏血管的分布情况,试验利用ABS塑胶液的冷塑性,用红色的塑胶液灌注于羊肾动脉,定型后,经过浓度为30%的盐酸腐蚀、自来水冲洗及人工修整等过程,制作羊肾脏铸型标本。结果表明:兰州大尾羊肾动脉入肾门后在肾实质内相继分支形成叶间动脉,在肾脏的皮质与髓质交界处延续为弓形动脉,由弓行动脉发出与肾表面近似垂直的小叶间动脉,小叶间动脉发出球小动脉和直小动脉;直小动脉可由弓行动脉、小叶间动脉和出球小动脉发出,伸向肾髓质。     

羊痘病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

山羊痘和绵羊痘是由羊痘病毒引起的一种急性、热性、接触性传染病。为了更快、更准确的诊断该病,本研究根据Gen Bank已经发表的GTPV和SPPV参考毒株(登录号分别为AY077836和AY077832)A29L基因序列,设计合成了1对特异性引物和2条Taq Man探针,同时制备重组质粒标准品。经过反应条件的优化,建立了羊痘病毒实时荧光定量PCR检测方法,对所建立的实时荧光定量PCR方法反应体系的特异性、灵敏性和重复性进行了评价,并用此方法对19份临床样品进行了检测。结果显示:该诊断方法与4种非羊痘病毒不发生交叉反应,并且山羊痘病毒和绵羊痘病毒之间也不发生交叉反应。该方法的重复性试验变异系数均低于2%,并且双重实时荧光定量PCR最低浓度检测限分别为470和440 fg。对标准阳性模板进行定量检测,生成的标准曲线相关系数分别为0.995和0.997。在检测的临床样品中,GTPV和SPPV阳性分别有14和4份,混合感染有1份。结果表明所建立的方法具有良好的特异性,灵敏性、稳定性,可以对GTPV和SPPV进行准确的定量检测。     

鹿布鲁菌分型实时荧光定量PCR检测方法的建立

鹿布鲁菌病主要是由牛型、羊型和猪型布鲁菌引起的,其他感染型少见,本研究依据布鲁菌的特异性基因BruAB20168、BMEII0466、BR0952上的部分高度保守片段设计猪型、牛型、羊型引物和探针,用于检测并区分鹿源布鲁菌的种型,且优化了反应体系,筛选出引物、探针的最优浓度配比。将扩增产物连接到pUC57载体上,制备标准品及标准曲线,建立鹿布氏菌各分型荧光定量PCR检测方法,并对其特异性、稳定性、敏感性进行评价。由标准曲线敏感性可知该方法的最低检测浓度分别可达到12、9、8copies/μL,比常规PCR灵敏度高出很多。